黃秀，張洋洋，朱曉宇，曾榃倫，杜玉君

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院，長春 130021)

腎臟纖維化是指由各種病因造成的受損腎臟組織內(nèi)纖維結(jié)締組織(細(xì)胞外基質(zhì)成分如膠原和纖連蛋白)的過度積聚，是慢性腎臟病(CKD)發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)及病理學(xué)標(biāo)志，也是CKD進(jìn)展至終末期腎病的最終及共性特征。腎臟纖維化主要表現(xiàn)為腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化及腎血管硬化[1]，在此基礎(chǔ)上，感染、毒素、遺傳性疾病、自身免疫、心肌梗死、高血清膽固醇、肥胖等多種因素加劇了腎臟纖維化的進(jìn)展，最終加快腎臟瘢痕形成、功能衰竭，直至終末期腎衰竭。盡管腎臟纖維化會帶來致命性后果，但由于其影響因素眾多且缺乏精準(zhǔn)的生物標(biāo)志物，故在早期不易被識別，從而使相關(guān)疾病發(fā)病率及住院率居高不下，并且成為世界各國的一個主要公共衛(wèi)生問題。流行病學(xué)顯示，2018年美國CKD發(fā)病率占其人口總數(shù)的15%[2]；僅2015年，我國因腎臟疾病住院的人數(shù)占全國總住院人數(shù)的4.8%[3]。目前仍無有效的治療措施來阻止腎臟纖維化。因此，明確腎臟纖維化的發(fā)病機制對于預(yù)防及早期干預(yù)腎纖維化具有至關(guān)重要的意義。已有研究表明，細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵信號通路(如TGF-β1/Smads，Wnt/β-連環(huán)蛋白，Jagged/Notch，表皮生長因子受體和JAK/STAT)失常在腎臟纖維化中發(fā)揮重要作用。其中，TGF-β1/Smads信號通路是腎臟纖維化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者[4]，本研究中我們就TGF-β1/Smads信號通路及其與腎臟纖維化關(guān)系的研究進(jìn)展作以下綜述。

1 TGF-β1/Smads信號通路

1.1 TGF-β1TGF-β超家族由De Larco和Todaro于1978年在研究病毒時發(fā)現(xiàn)，它包括TGF-βs、激活素、生長分化因子、骨成形蛋白(BMPs)等33個結(jié)構(gòu)相似但功能迥異的成員，主要通過調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、細(xì)胞外基質(zhì)重塑和免疫反應(yīng)等生理及病理過程，在組織穩(wěn)態(tài)、癌癥、炎癥、纖維化的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。近年研究表明，TGF-β超家族中，TGF-βs與腎臟纖維化關(guān)系最為密切。在哺乳動物體內(nèi)，雖然TGF-βs存在3種高度同源的異構(gòu)體：TGF-β1、2、3，且三者的氨基酸序列相似度高達(dá)64%～82%，但三者在腎臟組織中的分布及功能差異較大。TGF-β1在所有類型腎臟細(xì)胞中廣泛表達(dá)，且是發(fā)揮抗纖維化作用的主要因子；而TGF-β2和TGF-β3主要在腎小球的足細(xì)胞中表達(dá)，對纖維化的調(diào)節(jié)目前仍存在爭議。有研究[5]表明，TGF-β2可刺激大鼠近端小管上皮細(xì)胞的纖維化；亦有研究[6]發(fā)現(xiàn)，在人足細(xì)胞中加入TGF-β2，其可通過增強鞘氨醇激酶-1活性發(fā)揮抗纖維化作用。但無論是發(fā)揮抗纖維化還是促纖維化作用，TGF-β超家族是通過激活細(xì)胞膜上具有絲氨酸-蘇氨酸激酶活性的跨膜受體激活Smads蛋白發(fā)揮信號傳導(dǎo)作用的。

1.2 Smads蛋白 Smads蛋白是Mad蛋白和秀麗隱桿線蟲小蛋白的組合，根據(jù)其在TGF-β1/Smads信號通路中的功能不同，將人體中發(fā)現(xiàn)的Smads蛋白分為3類：受體調(diào)節(jié)型Smads(R-Smads)：Smad1、2、3、5、8；共同通路型Smad(Co-Smad)：Smad4；抑制性Smads(I-Smads)：Smad6、7。作為一種細(xì)胞內(nèi)信使，Smads蛋白可將細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核，進(jìn)而激活下游基因轉(zhuǎn)錄。8種Smad蛋白均由氨基末端的MH1結(jié)構(gòu)域、羧基末端MH2結(jié)構(gòu)域及中間接頭區(qū)(linker)組成。其中，MH1結(jié)構(gòu)域的主要功能是結(jié)合DNA，為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制性結(jié)構(gòu)域；MH2結(jié)構(gòu)域主要作用是與活化的TGF-β受體結(jié)合，是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能性結(jié)構(gòu)域，此外其還可與其他Smad、不同譜系確定轉(zhuǎn)錄因子、染色質(zhì)閱讀器、共激活因子及共抑制子結(jié)合。越來越多的證據(jù)[7]表明，磷酸化、泛素化、SUMO化和乙?；萐mad翻譯后修飾在腎臟纖維化中起一定作用。此外，有研究表明，雖然在哺乳動物中R-Smads、Co-Smad三個結(jié)構(gòu)域高度保守，但I(xiàn)-Smad基因MH1結(jié)構(gòu)域在不同物種間的保守性卻較低，并且Smads基因在某些腫瘤中存在不同程度的突變。因此，進(jìn)一步探索Smad基因突變位點可能成為腎臟纖維化治療的突破點。

1.3 TGF-β1與Smads蛋白之間的作用 新合成的TGF-β以無活性形式存在，通過裂解鄰近的N-端釋放出潛在相關(guān)肽(LAP)，LAP與成熟的TGF-β通過非共價鍵連接成同源二聚體，形成小的潛在復(fù)合物(SLC)。SLC再與潛在TGF-β結(jié)合蛋白形成大的潛在復(fù)合物(LLC)。LLC可使TGF-β處于無活性狀態(tài)，不能與Ⅰ型或Ⅱ型受體結(jié)合發(fā)揮自身作用。特定蛋白酶、血小板反應(yīng)素、αVβ6、活性氧(ROS)、低pH可通過許多未知的機制潛在激活TGF-β，進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。研究[8]表明，αVβ6能夠通過物理牽引應(yīng)力使LLC結(jié)構(gòu)變形，從而釋放出有活性的TGF-β。此外最新研究[9]表明，在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表面和血小板內(nèi)以糖蛋白A為主的重復(fù)序列亦可潛在激活TGF-β1，這一新的重大發(fā)現(xiàn)可能為深入理解腎臟纖維化的發(fā)病機制提供新的線索。TGF-β被上述機制激活后，通過與具有絲氨酸-蘇氨酸激酶活性的Ⅰ型受體和Ⅱ型跨膜受體結(jié)合成復(fù)合物后將信號傳至細(xì)胞內(nèi)。目前研究表明,人類基因組包含7種Ⅰ型受體和5種Ⅱ型受體，其中TGF-β Ⅰ型受體也稱為激活素受體樣激酶5(ALK5)。這12個成員中的ALK5和ALK1與TGF Ⅱ型受體主要參TGF-β1/Smads信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，具體機制為被激活的TGF-β首先與TGF Ⅱ型受體結(jié)合成為活化型，其次TGF Ⅱ型受體使TGF Ⅰ型受體的GS結(jié)構(gòu)域磷酸化(Ⅰ型受體C-端的一個富含甘氨酸及絲氨酸的結(jié)構(gòu)域)，從而激活TGF Ⅰ型受體，活化的TGF Ⅰ型受體直接使Smad2/3磷酸化，干擾Smad2/3 MH1結(jié)構(gòu)域與MH2結(jié)構(gòu)域之間的相互作用，使Smad2/3可通過MH2進(jìn)一步與Smad4結(jié)合形成異源寡聚體復(fù)合物，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核與各種轉(zhuǎn)錄因子(共激活因子和共抑制因子)相互作用以調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而啟動經(jīng)典Smad和非經(jīng)典Smad信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。

2 TGF-β1/Smads信號通路與腎臟纖維化的關(guān)系

2.1 TGF-β1的上下游因子與腎臟纖維化 TGF-β1是纖維化過程的驅(qū)動因子，已有研究表明，腎臟病理改變有纖維化的人及動物體內(nèi)TGF-β1水平增加。Suthanthiran等[10]發(fā)現(xiàn)非裔美國人血清中的TGF-β1水平與其腎臟疾病風(fēng)險呈正相關(guān)。Catherine等[11]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在糖尿病腎病小鼠體內(nèi)TGF-β1高表達(dá)可加劇疾病的進(jìn)展。眾多研究者發(fā)現(xiàn)，TGF-β1調(diào)控腎臟纖維化的基本機制如下：刺激肌成纖維細(xì)胞的大量合成從而誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化；刺激腎臟固有細(xì)胞(如：上皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和周細(xì)胞等)的活化及向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變；刺激細(xì)胞外基質(zhì)的沉積及抑制其降解；促進(jìn)腎小管細(xì)胞的凋亡及缺失。雖然腎臟纖維化的基本機制已得到闡述，基于上述機制在實驗?zāi)Ｐ椭虚_展的關(guān)于TGF-β1的臨床前研究顯示，TGF-β1具有抗纖維化作用，但將其運用到腎臟纖維化患者體內(nèi)后的療效并未令人滿意。故研究者可著眼于TGF-β1的上下游因子，從而為腎臟纖維化的治療開發(fā)更有效的方法。

近年研究表明，不同表型的巨噬細(xì)胞通過與TGF-β1相互聯(lián)系對腎臟纖維化發(fā)揮不同作用。Shen等[12]發(fā)現(xiàn)，小鼠單側(cè)輸尿管梗阻模型中，腎臟損傷早期主要是促炎型(M1型)巨噬細(xì)胞通過促進(jìn)TGF-β1等細(xì)胞因子的分泌及活化進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的積聚和纖維化的發(fā)生。在疾病的后期，Ostuni等[13]發(fā)現(xiàn)抗炎型(M2型)巨噬細(xì)胞通過抑制局部CD4+T細(xì)胞反應(yīng)和減少細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生來減緩纖維化的進(jìn)展；相反，同樣以單側(cè)輸尿管梗阻小鼠為模型，Pan等[14]發(fā)現(xiàn)腎損傷后募集的巨噬細(xì)胞被極化為M2型，其釋放高水平TGF-β1增強上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)的腎臟纖維化。目前，兩種表型的巨噬細(xì)胞激活狀態(tài)通過TGF-β1對腎臟纖維化的作用仍存在較大爭議[15]，但近幾年關(guān)于巨噬細(xì)胞和TGF-β1在腎臟纖維化中相互作用的研究日益增加，這可能是減輕腎臟纖維化的有效策略。

最近證據(jù)表明，除巨噬細(xì)胞的異質(zhì)性與TGF-β1上游關(guān)系密切外，在HIV相關(guān)CKD的小鼠模型中，同源域相互作用蛋白激酶2(HIPK2)可能通過激活TGF-β1從而促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞中纖維化標(biāo)志物的表達(dá)；相反通過抑制HIPK2活性可阻止TGF-β1相關(guān)的腎臟纖維化進(jìn)程[16]。

此外，也有研究提出TGF-β1的上游還與腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)密切相關(guān)。RAS中的AngⅡ是TGF-β1產(chǎn)生和活化的誘導(dǎo)物，且該系統(tǒng)的多個新軸與TGF-β關(guān)系密切，如ACE2 -Ang(1-7)-Mas受體軸可減弱TGF-β1的表達(dá)及其誘導(dǎo)的纖連蛋白的產(chǎn)生；腎素原-腎素受體-細(xì)胞內(nèi)途徑軸可刺激TGF-β、纖連蛋白和纖溶酶原激活物抑制因子-1的表達(dá)[17]。總之，巨噬細(xì)胞、HIPK2及RAS均在TGF-β信號通路的上游通過某種機制參與腎臟纖維化的發(fā)生、發(fā)展。

除TGF-β信號通路的上游與腎臟纖維化關(guān)系密切外，另有證據(jù)表明，TGF-β1的下游也參與腎臟纖維化的調(diào)控。在腎臟纖維化的發(fā)病機制中TGF-β1與ROS關(guān)聯(lián)。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1一方面通過誘導(dǎo)NADPH氧化酶依賴性NOX4的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)ROS的產(chǎn)生，另一方面還可抑制抗氧化酶的活性雙重介導(dǎo)腎臟纖維化的發(fā)生[18]，并且是Smad3依賴性的。此外也有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)機體發(fā)生如尿路梗阻、缺血再灌注、高血壓等損傷后，腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子TGF-β1和趨化因子CCL21/CXCL16/CCL2，趨化因子通過協(xié)同作用可募集骨髓來源的T細(xì)胞、單核細(xì)胞和纖維細(xì)胞，TGF-β1通過激活Smad3以刺激單核細(xì)胞向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變[19]，進(jìn)而促進(jìn)腎臟纖維化。另有Bai等[20]通過研究白藜蘆醇對大鼠腎小管上皮細(xì)胞(NRK-52E)的作用發(fā)現(xiàn)，TGF-β1能夠激活Hh-Gli信號通路參與腎臟纖維化。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探究TGF-β1下游的這些因子干預(yù)腎臟纖維化的精準(zhǔn)靶點將有利于阻止腎臟纖維化的進(jìn)展?？傊谀I臟纖維化中，TGF-β1的上下游因子發(fā)揮關(guān)鍵作用。

2.2 Smads與腎臟纖維化 雖然Smad2和Smad3氨基酸序列具有90%以上的同源性，但其對于腎臟纖維化的作用卻不盡相同。在Smad3+/-基因敲除的糖尿病小鼠體內(nèi)，腎小球硬化降低[21]；另外其特異性抑制劑亦可減少單側(cè)輸尿管梗阻性腎病小鼠的腎臟纖維化[22]，這間接提示Smad3可促進(jìn)腎臟纖維化的發(fā)生，其機制可能為通過上調(diào)金屬蛋白酶組織抑制劑同時下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶的活性來抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解，也可能通過直接與基因啟動子中Smad結(jié)合元件結(jié)合從而促進(jìn)纖維化的發(fā)生。Chen等[23]發(fā)現(xiàn)，Smad3可激活骨髓來源的成纖維細(xì)胞介導(dǎo)腎臟纖維化：以梗阻性腎病小鼠為模型，敲除Smad3后腎臟組織中積累的骨髓來源的成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞活化，α-SMA的表達(dá)顯著減少；并且發(fā)現(xiàn)Smad3的缺失減少了膠原蛋白的沉積并抑制了細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的表達(dá)。由于Smad2基因敲除的胚胎致死性，限制了研究者對Smad2單獨作用的深入探究。Meng等將Smad2-Flox/Flox小鼠與腎臟特異性(Cadherin-16啟動子)cre小鼠雜交，并從腎小管上皮細(xì)胞敲除Smad2，以此Smad2基因敲除雜交小鼠為模型，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Smad2基因缺失可促進(jìn)TGF-β/Smad3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并造成嚴(yán)重的腎小管間質(zhì)纖維化，其機制可能為Smad2可通過競爭性抑制Smad3磷酸化、核轉(zhuǎn)位、轉(zhuǎn)錄活性及其與靶基因的結(jié)合而起到抑制Smad3介導(dǎo)纖維化的作用；另外Smad2的缺失增加了TGF-β1的自誘導(dǎo)[24]。

Smad4是TGF-β和BMP信號通路的共同組成，在Smad2/3和Smad1/5/8的核漿穿梭中起到轉(zhuǎn)錄共激活因子的作用[25]。研究表明，在腎小管上皮細(xì)胞中條件性敲除Smad4會顯著降低單側(cè)輸尿管梗阻小鼠的纖維化程度[26]。在糖尿病的體內(nèi)及體外模型中，Zhao等[27]通過外界干預(yù)使Smad4下調(diào)從而減少了腎小球系膜基質(zhì)的積聚。

大量研究表明，Smad7在腎臟纖維化中發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用。鞘氨醇激酶-2缺乏可通過增加單側(cè)輸尿管梗阻小鼠Smad7的表達(dá)改善腎臟纖維化[28]。此外，在血管緊張素轉(zhuǎn)化酶Ⅱ誘導(dǎo)的高血壓性腎病小鼠模型中，使用非侵入性超聲-微泡介導(dǎo)法將Smad7基因轉(zhuǎn)移至小鼠體內(nèi)，使Smad7過表達(dá)，可阻斷腎臟纖維化[29]。Smad7的抗腎臟纖維化作用在于其生成速度大于其降解速度：一方面TGF-β1可通過Smad3依賴性機制誘導(dǎo)Smad7的合成，合成的Smad7通過競爭方式與Ⅰ型受體結(jié)合以及與Smad泛素化調(diào)節(jié)因子(SMURF2)結(jié)合形成E3泛素連接酶，降解活化的I型受體，從而拮抗R-Smads介導(dǎo)的腎臟纖維化；另一方面，Smad3蛋白的活化誘導(dǎo)E3連接酶(SMURF2和Arkidia)的生成，E3連接酶能夠結(jié)合泛素蛋白酶體并通過該途徑降解Smad7。

2.3 TGF-β1/Smads信號通路相關(guān)miRNA與腎臟纖維化 miRNA是一類由18～22個核苷酸組成的內(nèi)源性短鏈非編碼RNA分子。近年研究者陸續(xù)在腎臟病理學(xué)中鑒定出數(shù)種與TGF-β1/Smads信號通路相關(guān)且影響腎纖維化進(jìn)展的miRNA。其中，miRNA 146A、miRNA let-7、miRNA 324-3p在抗腎臟纖維化中起關(guān)鍵作用；miRNA 21、miRNA 433、miRNA 132、miRNA 212、miRNA 324-3p、miRNA 382發(fā)揮促腎臟纖維化作用；miRNA 29、miRNA 192、miRNA 200對纖維化的調(diào)節(jié)目前存在爭議。研究[30]表明，在糖尿病腎病中，恢復(fù)miRNA let-7水平可保護(hù)腎臟。McClelland等[31]發(fā)現(xiàn)，miR-21可通過增加Smad3磷酸化、降低Smad7的表達(dá)促進(jìn)纖維化基因的表達(dá)。Kato等[32]利用外源重組TGF-β1處理小鼠腎臟系膜細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)miR-192通過對轉(zhuǎn)錄因子ZEB1/2的抑制可升高TGF-β1的水平；相反，Krupa等[33]通過對糖尿病腎病患者的腎組織標(biāo)本的研究發(fā)現(xiàn)，腎小管間質(zhì)纖維化嚴(yán)重程度與miR-192表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，且miR-192表達(dá)的喪失呈TGF-β依賴性。miR-192對腎臟纖維化表現(xiàn)出相反作用，可能是因為系膜細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞miRNA表達(dá)譜對TGF-β的反應(yīng)不同，因此對其潛在機制的研究可能是進(jìn)一步需要探索的領(lǐng)域。

2.4 TGF-β1/Smads信號通路相關(guān)長鏈非編碼RNA(lncRNA)與腎臟纖維化 lncRNA是由大于200個核苷酸組成的RNA分子，無蛋白質(zhì)編碼能力。近年研究表明，多種lncRNAs會破壞組織穩(wěn)態(tài)，并在腎臟病理生理過程中必不可少。Zhou等[34]率先在單側(cè)輸尿管梗阻性腎病和免疫誘導(dǎo)的抗腎小球基底膜腎小球腎炎小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，lncRNA np_5318 / np_17856可能參與TGF-β/Smad3介導(dǎo)的腎纖維化；Feng等[35]發(fā)現(xiàn)，抑制腎臟lncRNA Erbb4-IR可誘導(dǎo)Smad7的表達(dá)，進(jìn)而可阻斷TGF-β/Smad3介導(dǎo)的腎臟纖維化；Wang等[36]發(fā)現(xiàn)，lnc-TSI可通過對TGF-β/Smad3信號通路發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用抑制腎臟纖維化的進(jìn)展。

綜上所述，TGF-β1/Smads信號通路功能多樣，在體內(nèi)參與多種生理及病理過程，是調(diào)控腎臟纖維化的關(guān)鍵信號通路，但其在腎臟纖維化中的具體調(diào)控機制仍有部分尚不清楚。因此，需進(jìn)一步深入明確TGF-β1/Smads信號通路調(diào)控腎臟纖維化的分子機制，為靶向治療腎臟纖維化提供理論依據(jù)。