劉永紅，許培權(quán)，王康偉，汪進城，金功圣

(1 蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，安徽蚌埠233000；2 浙江省杭州市余杭區(qū)第一人民醫(yī)院；3 蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院)

乳腺癌是全世界范圍內(nèi)女性發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤之一，外科治療后輔助化療為目前主要的治療方式[1]。多西他賽、阿霉素、環(huán)磷酰胺、順鉑等作為一線化療藥物在多數(shù)乳腺癌治療中有效，然而其不良反應(yīng)較多[2]。細(xì)胞凋亡抑制蛋白(IAPs)是一類在程序性細(xì)胞凋亡進程中發(fā)揮重要作用的蛋白質(zhì)，可以抑制細(xì)胞凋亡并促進細(xì)胞周期進程。研究[3]顯示，IAPs在多種腫瘤細(xì)胞中高表達，并且與腫瘤惡性進展、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和腫瘤的治療抗性有關(guān)。研究[4]表明，通過siRNA干擾或反義寡核苷酸下調(diào)IAPs表達可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，使腫瘤細(xì)胞對放化療和結(jié)合死亡受體更加敏感，使得IAPs成為腫瘤治療的重要靶標(biāo)。研究[5]顯示，第二線粒體抑制劑的拮抗劑(Smac)模擬物L(fēng)CL161，可以通過降解IAPs進而抑制腫瘤的進展，還可通過激活凋亡起始蛋白半胱天冬酶-8(Caspase-8)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。研究[6]顯示，LCL161對白血病、肝細(xì)胞肝癌、多發(fā)性骨髓瘤等有明顯的增殖抑制、促進細(xì)胞凋亡的作用，在聯(lián)合放療、化療或靶向治療中能發(fā)揮協(xié)同作用并提高治療效果，且具有毒性低、耐受性好等特點。然而，有關(guān)LCL161在乳腺癌治療方面的研究鮮有報道。2018年2月10日～2018年10月20日，本研究觀察了LCL161聯(lián)合多西他賽對人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7增殖及凋亡的影響，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑 人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。LCL161和多西他賽購自美國MCE公司。RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自德國pan公司；cIAP1、cIAP2、RIP1抗體購自美國CST公司；β-Actin抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG、CCK-8試劑盒、ATP檢測試劑盒及AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自Biosharp公司。

1.2 LCL161給藥濃度的測算及細(xì)胞分組 ①LCL161給藥濃度的測算。取對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞按5 000個/孔接種于96孔板中，每孔加入100 μL培養(yǎng)液，待細(xì)胞貼壁生長后，棄去培養(yǎng)液，加入100 μL含有不同濃度的LCL161(1、2、3、4、5 μmol/L)培養(yǎng)液，記為實驗組。以只加入培養(yǎng)液，不加入MCF-7細(xì)胞和LCL161的組為空白組；以加入培養(yǎng)液和MCF-7細(xì)胞，不加入LCL161的組為對照組。實驗組和對照組培養(yǎng)24 h后加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1 h，振蕩10 min充分溶解結(jié)晶物，用多功能酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測各組OD值，計算各組細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。結(jié)果顯示，實驗組加入1、2、3、4、5 μmol/L LCL161的細(xì)胞存活率分別為93.52%±3.26%、85.33%±2.19%、73.34%±2.87%、64.78%±3.19%、64.82%±1.48%。選取對細(xì)胞增殖無明顯抑制作用、細(xì)胞毒性較小的實驗組用于后續(xù)實驗，即LCL161的給藥濃度為2 μmol/L。②細(xì)胞分組。將對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞分為4組： LCL161組、多西他賽組、LCL161聯(lián)用多西他賽組、對照組。各組細(xì)胞按5 000個/孔接種于96孔板中，每孔加入100 μL培養(yǎng)液，待細(xì)胞貼壁生長后棄去培養(yǎng)液，各組加入相應(yīng)藥物繼續(xù)培養(yǎng)24 h。LCL161組加入2 μmol/L的LCL161，多西他賽組加入0.6 mg/L的多西他賽，LCL161聯(lián)用多西他賽組加入0.6 mg/L的多西他賽和2 μmol/L的LCL161，對照組加入不含藥物的培養(yǎng)液。

1.3 各組細(xì)胞存活率測算 采用CCK-8法。各組細(xì)胞避光條件下加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1 h，振蕩10 min充分溶解結(jié)晶物，用多功能酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測各孔的OD值，計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=[實驗組OD值-空白組OD值]/[對照組OD值-空白組OD值]×100%。

1.4 各組細(xì)胞集落克隆能力檢測 采用細(xì)胞集落克隆實驗。取各組細(xì)胞按7 000個/孔接種于6孔板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，細(xì)胞生長至形成肉眼可見菌落時停止培養(yǎng)，PBS清洗3遍，每次2 min，放置于空氣中干燥，用4%多聚甲醇固定細(xì)胞，0.5%結(jié)晶紫染色液染色30 min，使用雙蒸水清洗6孔板底部，吸棄雙蒸水后室溫放置干燥，顯微鏡下計數(shù)各組細(xì)胞集落數(shù)目。

1.5 各組細(xì)胞晚期凋亡情況觀察 采用Hoechst33258染色法。取各組細(xì)胞于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸棄培養(yǎng)液，PBS清洗1次，10%甲醛固定，吸棄固定液，PBS清洗3次，每次5 min，加入10 μg/mL的Hoechst33258染色液1 mL避光染色15 min，PBS清洗3次，每次5 min，吸棄PBS，倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.6 各組細(xì)胞凋亡率測算 采用流式細(xì)胞術(shù)。取各組細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化，用15 mL離心管收集細(xì)胞，2 000 r/min離心5 min，倒去上層液體后加入1 mL PBS重懸，加入500 μL Binding Buffer混勻細(xì)胞后，分別加入PI及Annexin V-FITC各5 μL，室溫避光孵育20 min后流式細(xì)胞儀檢測，F(xiàn)lowjo軟件計算各組細(xì)胞凋亡率。

1.7 各組細(xì)胞凋亡抑制蛋白cIAP1、cIAP2及程序性壞死蛋白RIP1檢測 采用Western blotting法。取各組細(xì)胞培養(yǎng)于100 mm培養(yǎng)皿中，加入100 μL預(yù)冷的RIPA蛋白裂解液，置于冰上裂解1 h，4 ℃低溫離心機中12 000 rpm離心20 min，吸取上清液轉(zhuǎn)移至EP管中，使用BCA蛋白定量法測各組的蛋白濃度；根據(jù)各組的蛋白濃度加入相應(yīng)體積的蛋白上清液，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，封閉2 h，TBST洗膜3次，每次15 min，于抗體孵育盒中加對應(yīng)一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加對應(yīng)二抗，室溫下孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，按照ECL發(fā)光試劑盒說明書進行檢測，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像，使用Image J軟件掃描各組灰度值，以灰度值表示各組cIAP1、cIAP2、RIP1蛋白的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞存活率比較 LCL161組、多西他賽組、LCL161聯(lián)用多西他賽組、對照組的細(xì)胞存活率分別為86.84%±3.83%、81.29%±6.71%、46.91%±4.76%和92.77%±2.18%，LCL161組與對照組相比，P>0.05；其余組間兩兩相比，P均<0.05。

2.2 各組細(xì)胞集落數(shù)目比較 LCL161組、多西他賽組、LCL161聯(lián)用多西他賽組、對照組的集落數(shù)目分別為(117±14)、(95±9)、(61±12)、(132±7)個，LCL161組與對照組相比，P>0.05；其余組間兩兩相比，P均<0.05。

2.3 各組細(xì)胞晚期凋亡情況比較 LCL161組細(xì)胞膜通透性增加，染色質(zhì)固縮，部分細(xì)胞發(fā)生了核碎裂；多西他賽組和對照組的細(xì)胞核均勻淡染，細(xì)胞核形態(tài)呈橢圓形，細(xì)胞膜相對完整；LCL161聯(lián)用多西他賽組細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞核碎裂，部分發(fā)生了核解體。

2.4 各組細(xì)胞凋亡率比較 LCL161組、多西他賽組、LCL161聯(lián)用多西他賽組、對照組細(xì)胞凋亡率分別為15.16%±2.26%、21.42%±1.17%、34.38%±3.27%、5.18%±0.89%，LCL161組與對照組相比，P>0.05；其余組間兩兩相比，P均<0.05。

2.5 各組細(xì)胞cIAP1、cIAP2、RIP1蛋白的相對表達量比較 LCL161組、多西他賽組、LCL161聯(lián)用多西他賽組、對照組cIAP1蛋白的相對表達量分別為0.41±0.09、0.29±0.11、0.11±0.04、0.62±0.17，LCL161組與對照組相比，P>0.05；其余組間兩兩相比，P均<0.05。LCL161組、多西他賽組、LCL161聯(lián)用多西他賽組、對照組cIAP2蛋白的相對表達量分別為0.86±0.11、0.77±0.15、0.51±0.12、0.98±0.01，LCL161組與對照組相比，P>0.05；其余組間兩兩相比，P均<0.05。LCL161組、多西他賽組、LCL161聯(lián)用多西他賽組、對照組RIP1蛋白的相對表達量分別為1.97±0.22、1.84±0.19、3.17±0.26、1.00±0.07，LCL161組與多西他賽組相比，P>0.05；其余組間兩兩相比，P均<0.05。

3 討論

研究[7]顯示，IAPs在腫瘤的調(diào)控機制中發(fā)揮著重要作用，在許多腫瘤組織中高表達，其表達水平與預(yù)后密切相關(guān)。研究[6]表明，Smac可通過降解IAPs而對腫瘤發(fā)揮抑制作用。研究[8,9]顯示，Smac模擬物還可以通過激活凋亡起始蛋白Caspase-8，繼而激活TNF-α依賴的細(xì)胞凋亡。本研究首先通過設(shè)置不同濃度的LCL161處理MCF-7細(xì)胞，選取對細(xì)胞增殖無明顯抑制作用、細(xì)胞毒性較小的LCL161劑量用于后續(xù)實驗。我們對加入LCL161和多西他賽的各組細(xì)胞存活率、細(xì)胞集落克隆能力進行了檢測，結(jié)果顯示，多西他賽可顯著升高細(xì)胞增殖抑制能力，而當(dāng)LCL161與多西他賽聯(lián)用時，細(xì)胞的增殖抑制能力升高更加明顯。本研究還觀察各組細(xì)胞的晚期凋亡情況，結(jié)果顯示，LCL161可顯著促進細(xì)胞的晚期凋亡，而當(dāng)LCL161與多西他賽聯(lián)用時，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，晚期凋亡更加明顯。

研究[10,11]顯示，在腫瘤細(xì)胞凋亡過程中，腫瘤壞死因子受體(TNFR)的激活可以調(diào)控多個信號傳導(dǎo)通路，包括NF-κB的激活、RIP1非依賴性細(xì)胞凋亡(RIA)、RIP1依賴性細(xì)胞凋亡(RDA)和壞死性凋亡。在本研究中，我們檢測了MCF-7細(xì)胞經(jīng)過LCL161及多西他賽處理后細(xì)胞凋亡抑制蛋白cIAP1、cIAP2及細(xì)胞程序性壞死蛋白RIP1表達的變化，發(fā)現(xiàn)多西他賽與LCL161聯(lián)用時,凋亡抑制蛋白cIAP1、cIAP2表達被抑制，程序性壞死蛋白RIP1被激活。我們認(rèn)為，LCL161聯(lián)用多西他賽誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞發(fā)生了程序性壞死，且是通過激活RIP蛋白信號通路這種程序性壞死的經(jīng)典途徑來實現(xiàn)的。以上結(jié)果證明了RIP家族蛋白在LCL161聯(lián)合多西他賽誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞程序性壞死中的重要作用。

綜上所述，LCL161聯(lián)合多西他賽可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，促進其凋亡；LCL161聯(lián)合多西他賽可下調(diào)凋亡抑制蛋白cIAP1、cIAP2的表達，上調(diào)程序性壞死蛋白RIP1的表達，進而誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的凋亡及程序性壞死來發(fā)揮抗腫瘤作用。