李帥，徐向華，劉繼光，劉學超，張洲銘，王彭議

(1 佳木斯大學口腔醫(yī)學院，黑龍江佳木斯154003；2 山東省婦幼保健院;3 山東大學附屬省立醫(yī)院)

涎腺腺樣囊性癌(SACC)是涎腺較常見的涎腺惡性上皮源性腫瘤，早期以無痛性腫塊多見，具有生長緩慢、嗜神經(jīng)侵襲性較強、易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移等特點[1]。SACC病程長且預(yù)后差，晚期高達8%～46%的遠處轉(zhuǎn)移率是患者死亡的主要原因，5年生存率為55%～89%[2，3]。SACC早期治療以手術(shù)切除為主，但很難徹底切除病變組織治愈疾病，治療后易復(fù)發(fā)，長期預(yù)后效果欠佳，因此中晚期和復(fù)發(fā)SACC患者以放化療配以中草藥調(diào)節(jié)增強免疫力的綜合治療為主。青蒿素是抗瘧藥，隨著臨床實驗的深入研究，其抗腫瘤作用也備受關(guān)注[4]。研究[5]發(fā)現(xiàn)，青蒿素及其衍生物蒿甲醚(ART)對體外多種惡性腫瘤細胞具有顯著的選擇性殺傷作用，且無明顯的毒副作用，其作用機制包括促使腫瘤細胞凋亡、Fe2+介導(dǎo)產(chǎn)生自由基選擇性殺傷腫瘤細胞、抗血管生成作用、氧化損傷反應(yīng)、抑制腫瘤細胞增殖等[6～10]。高遷移蛋白-1(HMGB1)是人體內(nèi)含量最豐富的HMG蛋白，其基因定位于人染色體13q12，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄過程[11]。研究[12]發(fā)現(xiàn)，在腫瘤侵襲過程中HMGB1可釋放至細胞外，與細胞表面的HMGB1相應(yīng)受體相結(jié)合形成復(fù)合物，激活絲裂原活化蛋白激酶、基質(zhì)金屬蛋白酶等信號通路，促進腫瘤新生血管形成腫瘤侵潤及轉(zhuǎn)移。2018年4月5日～2018年10月8日，本研究觀察了不同濃度的ART對SACC細胞系A(chǔ)CC-2增殖、凋亡、侵襲、遷移的影響，并探討ART對ACC-2細胞的調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 ART、細胞及試劑 ART購于阿拉丁試劑有限公司。人涎腺腺樣囊性癌細胞系A(chǔ)CC-2購自procell公司。胎牛血清、0.25%Trypsin購于Gibco公司，CCK8細胞增殖和細胞毒性檢測試劑盒購自Beyotime公司，HMGB1 Antibody購自Sanying公司，凋亡測定試劑盒購自Nanjing Kaiji Bio公司，Transwell購自FALCON公司，Matrigel購自BD公司，兔多克隆抗抗HMGB1(30 KD)購自武漢三鷹生物科技有限公司，小鼠單克隆抗體β-actin(42 KD)、HRP標記的羊抗小鼠二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 將ACC-2細胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3d換液1次，細胞呈單層貼壁生長，待融合度達90%時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.3 不同濃度ART對ACC-2細胞增殖的影響觀察 采用CCK-8法。取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期ACC-2細胞，接種于96孔板，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)過夜。將ACC-2細胞分為4組，分別加入125、250、500 μg/mL的ART或等量0.1% DMSO培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，記為125 μg/mL組、250 μg/mL組、500 μg/mL組(實驗組)和對照組，每組設(shè)5個復(fù)孔，分別于培養(yǎng)0、24、48、72、96 h時，將10 μL CCK8溶液緩慢加入各孔中，37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)中3 h，以不加細胞和藥物的孔為空白組，使用酶標儀測定450 nm處的OD值，計算各組細胞增殖率。各組細胞增殖率=(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.4 不同濃度ART對ACC-2細胞凋亡的影響觀察 采用流式細胞術(shù)Annexin V-FITC/PI雙染法。取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期ACC-2細胞，接種于6孔板。將ACC-2細胞分成4組，分別加入125、250、500 μg/mL的ART或等量0.1% DMSO培養(yǎng)液，記為125 μg/mL組、250 μg/mL組、500 μg/mL組、對照組。各組細胞于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，PBS緩沖液洗滌細胞，胰蛋白酶消化后以無血清培養(yǎng)基重懸制備單細胞懸液，取細胞懸液置于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V-FITC，混合均勻后再加入5 μL PI，室溫避光反應(yīng)10 min，用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.5 不同濃度ART對ACC-2細胞侵襲能力的影響觀察 采用Transwell侵襲實驗。細胞分組及藥物干預(yù)方法同“1.4”。各組細胞藥物干預(yù)后除去培養(yǎng)基，加入3 mL PBS洗滌細胞，用0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，PBS洗滌，稀釋細胞濃度至1×105個/mL備用。Matrigel于4 ℃解凍，在冰上稀釋至終濃度1 mg/mL。Transwell小室、24孔培養(yǎng)板和槍頭在-20 ℃下預(yù)冷卻過夜，將含有雙抗體的培養(yǎng)基加入到24孔板中并置于Transwell小室中，將100 μL Matrigel垂直添加到Transwell小室上室底部中心，在37 ℃孵育4 h逐漸變成凝膠狀。Transwell上室分別加入200 μL各組細胞懸液，下室加入500 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24 h后取出小室，棉簽擦拭去上室的細胞，用70%冰乙醇溶液固定細胞1 h，0.5%結(jié)晶紫染料溶液染色20 min，在顯微鏡下取10個視野觀察拍照，計算各組下室侵襲細胞數(shù)目。

1.6 不同濃度ART對ACC-2細胞遷移能力的影響觀察 采用Transwell遷移實驗。除不鋪Matrigel基質(zhì)外，其他步驟同“1.5”，在顯微鏡下取10個視野觀察拍照，計算各組下室遷移細胞數(shù)目。

1.7 不同濃度ART對ACC-2細胞HMGB1蛋白表達的影響觀察 采用Western blotting法。細胞分組及藥物干預(yù)方法同“1.4”。各組細胞置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，PBS洗滌細胞，應(yīng)用預(yù)冷的蛋白裂解液冰上裂解30 min，12 000 r/min離心15 min后提取細胞總蛋白，BCA蛋白定量法測定各組細胞蛋白濃度。各組細胞蛋白電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，脫脂奶粉封閉2 h，加入β-actin、HMGB1多克隆抗體，TBST洗滌5次，每次5 min，加入羊抗小鼠二抗，37 ℃搖床中孵育2 h，制備膠片，BandScan掃描分析各組細胞HMGB1蛋白灰度值，以灰度值表示HMGB1蛋白的相對表達水平。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度ART對ACC-2細胞增殖的影響結(jié)果比較 培養(yǎng)0、24、48、72、96 h時，125 μg/mL組細胞增殖率分別為100.7%±8.7%、77.5%±5.2%、61.0%±7.7%、50.6%±3.3%、39.0%±2.6%,250 μg/mL組細胞增殖率分別為99.5%±7.3%、63.3%±3.6%、50.4%±3.4%、38.1%±2.7%、25.5%±2.3%,500 μg/mL組細胞增殖率分別為101.5%±2.4%、56.0%±2.9%、38.2%±3.7%、28.9%±2.3%、11.0%±2.4%,對照組細胞增殖率均為100.0%，各組培養(yǎng)24、48、72、96 h時細胞增殖率相比，P均<0.01，提示隨著藥物作用時間的延長，ART抑制ACC-2細胞增殖的作用也愈發(fā)明顯，呈濃度依賴性。

2.2 不同濃度ART對ACC-2細胞凋亡的影響結(jié)果比較 125 μg/mL組、250 μg/mL組、500 μg/mL組、對照組細胞凋亡率分別為21.98%±0.44%、34.76%±1.74%、49.94%±1.43%、2.30%±0.17%，組間相比，P均<0.01，提示ART對ACC-2細胞凋亡有顯著的促進作用，且細胞凋亡促進作用隨藥物濃度的增加而增加。

2.3 不同濃度ART對ACC-2細胞侵襲能力的影響結(jié)果比較 125 μg/mL組、250 μg/mL組、500 μg/mL組、對照組侵襲細胞數(shù)目分別為(61±3)個、(39±3)個、(15±1)個、(99±8)個，組間相比，P均<0.01，提示ART可抑制ACC-2細胞的侵襲能力，且細胞侵襲能力抑制作用具有一定的濃度依賴性。

2.4 不同濃度ART對ACC-2細胞遷移能力的影響結(jié)果比較 125 μg/mL組、250 μg/mL組、500 μg/mL組、對照組遷移細胞數(shù)分別為(93±13)個、(69±3)個、(30±3)個、(164±16)個，組間相比，P均<0.01，提示ART可抑制ACC-2細胞的遷移能力，且隨著藥物濃度的增加，遷移的細胞數(shù)量減少。

2.5 不同濃度ART對ACC-2細胞HMGB1蛋白表達的影響結(jié)果比較 125 μg/mL組、250 μg/mL組、500 μg/mL組、對照組細胞HMGB1蛋白相對表達水平為0.798±0.064、0.667±0.079、0.424±0.019、0.887±0.045，組間相比，P均<0.01，提示ART可以降低ACC-2細胞中HMGB1蛋白的表達，且表達下調(diào)作用具有一定的濃度依賴性。

3 討論

青蒿素是中國學者屠呦呦等人于1972年從草本植物青蒿中分離出來的化學物質(zhì)，用于治療瘧疾[13]。近年來的研究[14，15]表明，青蒿素及其衍生物如ART、青蒿琥酯和雙氫青蒿素等，不僅僅在治療瘧疾方面卓有成效，并且其在抑制腫瘤方面也表現(xiàn)出了巨大的潛力和前景。國內(nèi)外研究[16]表明，對于體外培養(yǎng)的頭頸部惡性腫瘤細胞，青蒿素及其衍生物均存在較強的抑制作用。雙氫青蒿素可通過活性氧積累和線粒體依賴性凋亡途徑促進破骨細胞凋亡來保護脂多糖誘導(dǎo)的骨丟失，從而達到治療炎性骨丟失的作用[8]。青蒿琥酯可抑制白血病細胞K562細胞增殖，從而抑制腫瘤生長，達到治療目的[9]。越來越多的基礎(chǔ)和臨床實驗研究[17～20]發(fā)現(xiàn)，ART可以選擇性地抑制某些腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移、血管生成以及炎癥反應(yīng)。

本研究將不同濃度的ART作用于ACC-2細胞，CCK8增殖檢測結(jié)果顯示，在藥物作用24 h后ART即表現(xiàn)出對ACC-2細胞增殖的有效抑制，伴隨作用時間的延長，抑制ACC-2細胞增殖的作用愈發(fā)明顯，顯示出濃度依賴性作用。Transwell小室實驗常用于檢測體外惡性腫瘤細胞的侵襲和遷移能力。本研究結(jié)果表明，ART在125、250、500 μg/mL濃度均可抑制ACC-2細胞的侵襲和遷移能力，且隨藥物濃度的升高抑制愈發(fā)明顯。這一結(jié)果同HMGB1蛋白表達水平結(jié)果保持較高同步性和一致性，ART濃度越高，HMGB1蛋白表達水平下降的越明顯，說明ART可以有效降低HMGB1的表達，提示ART可能是通過HMGB1蛋白的表達參與了調(diào)控過程，進而有效抑制ACC-2細胞的增殖、凋亡、侵襲和遷移。

綜上所述，ART能夠明顯抑制SACC細胞的增殖、侵襲和遷移，促進其凋亡，對SACC細胞的生長起著明顯的抑制作用，并且抑制作用與ART濃度有關(guān)，其機制可能與下調(diào)HMGB1蛋白的表達有關(guān)。本研究為ART在SACC治療中的臨床應(yīng)用提供體外支持，為其治療研究提供一個新的方向。