山東省研究型醫(yī)院協(xié)會(huì)胸外科分會(huì) 山東省疼痛研究會(huì)加速康復(fù)外科專業(yè)委員會(huì)

在過去的20年里，食管癌已經(jīng)成為惡性腫瘤疾病里發(fā)病率第8位、死亡率第6位的疾病[1,2]，總生存率仍然相當(dāng)有限[3]。在接受根治性手術(shù)治療的食管癌患者中，2/3的患者術(shù)后會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[4]。在亞洲地區(qū)，食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)占食管癌總數(shù)的90%以上[5]，并且5年總生存率只有15%～20%[6]。因此，有效監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展、判斷預(yù)后及提高生存率，是ESCC研究領(lǐng)域亟待解決的問題。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)是由澳大利亞病理學(xué)家Thomas Ashworth最早報(bào)道的。CTCs被發(fā)現(xiàn)來源于原發(fā)腫瘤細(xì)胞的克隆[7]，外周血CTCs檢測(cè)被證明可作為一種預(yù)后因素，并且可能為癌癥治療提供新的策略[8]。已有研究報(bào)道，轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中，如果用CellSearch 系統(tǒng)檢測(cè)到大量CTCs存在，預(yù)示著患者的不良預(yù)后[9～11]。也有研究表明，CTCs在腫瘤的形成、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[12]。

1 CTCs定義

CTCs是從原發(fā)或繼發(fā)腫瘤脫離進(jìn)入血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，大多數(shù)CTCs被機(jī)體免疫系統(tǒng)消滅或凋亡，部分CTCs經(jīng)歷上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程從而獲得高侵襲性，極少CTCs可以形成轉(zhuǎn)移性病灶[13]。此外有研究表明，循環(huán)系統(tǒng)中還存在循環(huán)腫瘤微栓(CTM)以及大小和形狀與白細(xì)胞相似的小CTCs，但其來源均不明確[14～16]。

CTCs在血中含量非常稀少，每毫升血液中CTCs只有1～100個(gè)，增加血液樣本量是提高檢測(cè)準(zhǔn)確性的可能的解決方案，但又受到時(shí)間的限制及患者護(hù)理方面的挑戰(zhàn)。CTCs的異質(zhì)性也是檢測(cè)中的一個(gè)主要障礙，因?yàn)椴煌瑏喨旱腃TCs在生物標(biāo)志物表達(dá)方面有著顯著的多樣性[17]。同時(shí)，單細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)CTCs蛋白質(zhì)表達(dá)還存在時(shí)間和空間異質(zhì)性，表明除了CTCs計(jì)數(shù)以外，這些異質(zhì)性信息可能包含目前尚不清楚的生物學(xué)信息[18]。

2 CTCs檢測(cè)方法

迄今為止，已有不少研究報(bào)道了CTCs的直接及間接的檢測(cè)方法，這些方法在特異性、敏感性及成本方面都有著較大差異[19～26]。CTCs檢測(cè)通常包含兩個(gè)步驟，首先是從血液樣本中進(jìn)行分離富集，然后是對(duì)富集的可疑細(xì)胞進(jìn)行生物標(biāo)志物的確認(rèn)。

CTCs的分離富集分為兩種，一種是基于物理特性的分離富集技術(shù)，其特點(diǎn)是既不破壞CTCs形態(tài)，也不依賴CTCs表面抗原，可對(duì)單個(gè)CTCs進(jìn)行進(jìn)一步的形態(tài)學(xué)、免疫細(xì)胞學(xué)及遺傳學(xué)特征的研究。包括CTC-Biopsy系統(tǒng)、Clearcell FX系統(tǒng)、Parsortix系統(tǒng)、OncoQuick系統(tǒng)和DEPArray系統(tǒng)等[20,27～31]。另一種是基于免疫學(xué)特性的分離富集技術(shù)，包括陽(yáng)性富集(是依據(jù)免疫學(xué)原理，運(yùn)用磁珠、黏附對(duì)CTCs進(jìn)行捕獲)和陰性富集(是指去除白細(xì)胞后富集CTCs)。陽(yáng)性富集方法的代表是CellSearch系統(tǒng)，其也是惟一在歐美及中國(guó)均獲批準(zhǔn)應(yīng)用的CTCs檢測(cè)系統(tǒng)[32]。此外，采用陽(yáng)性富集技術(shù)的CTCs檢測(cè)系統(tǒng)還有LiquidBiopsy?系統(tǒng)、CTC-Chip系統(tǒng)和AdnaTest系統(tǒng)等[33,34]。陰性富集技術(shù)主要有Cyttel系統(tǒng)，其原理是利用特制的CD45免疫磁珠吸附并去除血液中的白細(xì)胞[35]。

CTCs鑒定是指分離富集后的可疑CTCs必須通過可靠的鑒定才能確定為CTCs，但該步驟處于持續(xù)探索階段，且不同類型的惡性腫瘤CTCs會(huì)有更為特異的鑒定方法。

總之，目前ESCC患者CTCs的檢測(cè)方法種類較多，但標(biāo)準(zhǔn)尚不統(tǒng)一，尤其在結(jié)果驗(yàn)證和判讀等方面。

3 CTCs的檢測(cè)流程及結(jié)果評(píng)判

CellSearchTM系統(tǒng)由于無法實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞捕獲并進(jìn)行后續(xù)基因檢測(cè)以及用藥指導(dǎo)，目前已停產(chǎn)停售。有研究證實(shí)，武漢友芝友公司CTC-Biopsy?系統(tǒng)具有較高的敏感性及可靠性，其原理是通過高分子材料微孔濾膜過濾裝置分離富集CTCs[20]，且在ESCC的CTCs檢測(cè)中有著較好的應(yīng)用價(jià)值[32,36]，其具體檢測(cè)流程簡(jiǎn)介如下。

3.1 操作過程 每次檢測(cè)需要全血5 mL，注意不要將第1管血樣送檢，以防止血管內(nèi)皮細(xì)胞的干擾。采血后為防止凝血，應(yīng)立即輕柔顛倒混勻8次。血樣最好在2 h內(nèi)檢測(cè)，否則應(yīng)靜置于4 ℃環(huán)境保存(時(shí)間不能超24 h)。處理樣本時(shí)需室溫靜置復(fù)溫20 min。遠(yuǎn)距離運(yùn)輸血樣時(shí)，應(yīng)將儲(chǔ)血裝置豎直向上置于4～8 ℃采血箱中，同時(shí)避免與冰袋直接接觸及劇烈晃動(dòng)。使用友芝友公司的CTCs快速染色液行改良瑞氏—吉姆薩染色。

3.2 評(píng)判參數(shù) ①細(xì)胞直徑(長(zhǎng)端)>15 μm；②核質(zhì)比>0.8；③細(xì)胞核呈現(xiàn)異型性，如出現(xiàn)不規(guī)則的結(jié)節(jié)狀、分葉狀等；④細(xì)胞核深染且著色不均；⑤由于核膜增厚出現(xiàn)凹陷或皺褶，致使核膜呈鋸齒或不規(guī)則狀；⑥細(xì)胞核染色質(zhì)邊移，或巨大核仁，或異常核分裂。

3.3 評(píng)判標(biāo)準(zhǔn) 符合以上6個(gè)評(píng)判參數(shù)中的4個(gè)或4個(gè)以上判定為CTC；滿足評(píng)判參數(shù)⑥之外的任意3個(gè)或單獨(dú)滿足評(píng)判參數(shù)⑥判定為疑似CTC；3個(gè)及3個(gè)以上的細(xì)胞成團(tuán)且能鑒定為CTC，但因相互連接重疊無法準(zhǔn)確判定為CTC的細(xì)胞團(tuán)，判定為CTM；3個(gè)及3個(gè)以上的細(xì)胞成團(tuán)但不足以判定為CTC的細(xì)胞團(tuán)，判定為疑似CTM；不能判定為血液來源的細(xì)胞但同時(shí)也不符合上述四種類型的其他細(xì)胞判定為非血液細(xì)胞[37]。

3.4 降低CTCs檢測(cè)假陽(yáng)性率的建議 為降低CTCs檢測(cè)的假陽(yáng)性率，建議用CD45抗體ICC檢測(cè)，以排除形態(tài)學(xué)特征類似CTCs的白細(xì)胞。細(xì)胞核染色為藍(lán)色(蘇木素)且細(xì)胞膜染色為棕黃色(DAB)判定為CD45陽(yáng)性；細(xì)胞核染色為藍(lán)色(蘇木素)且細(xì)胞膜周圍無棕黃色判定為CD45陰性。

3.5 提高CTCs檢測(cè)特異性的建議 對(duì)于ESCC患者的CTCs或CTM的鑒定，在條件允許的單位可采用較為特異的鑒定方法，對(duì)捕獲的細(xì)胞行P40及CD45免疫熒光檢測(cè)，有著較為可靠的鑒定結(jié)果[36]。

3.6 檢測(cè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)及其注意事項(xiàng) 目前接受手術(shù)治療的ESCC患者CTCs檢測(cè)的時(shí)間點(diǎn)沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)NCCN指南中所提到的隨訪時(shí)間，建議在術(shù)后隨訪的同時(shí)，進(jìn)行CTCs的檢測(cè)。術(shù)后前2年每3～6月復(fù)查1次；術(shù)后第3～5年每6個(gè)月復(fù)查1次；5年后，根據(jù)情況決定是否需要繼續(xù)行CTCs檢測(cè)。對(duì)于治療前患者，推薦在化療或手術(shù)前進(jìn)行檢測(cè)，但要避免在手術(shù)當(dāng)天進(jìn)行檢測(cè)。此外，結(jié)合臨床實(shí)際，建議在清晨或上午6:00～9:00進(jìn)行檢測(cè)，抽血前可以適當(dāng)飲水，避免在體液出現(xiàn)大量丟失的情況下檢測(cè)。

4 CTCs檢測(cè)在ESCC中應(yīng)用的臨床意義

4.1 早期篩查 健康人幾乎檢測(cè)不到CTCs，分期較早的ESCC患者中，CTCs的檢測(cè)陽(yáng)性率也極低[32,36]。所以，目前暫不推薦將CTCs檢測(cè)作為ESCC患者的早期篩查。

4.2 判斷預(yù)后及療效 無論是使用CellSearch系統(tǒng)還是CTC-Biopsy?系統(tǒng)，對(duì)于ESCC患者而言，外周循環(huán)中檢測(cè)到CTCs(或CTM)均提示預(yù)后不良[38,39]。

有研究發(fā)現(xiàn)，采用CellSearch系統(tǒng)對(duì)接受化療或化放療的90例ESCC患者進(jìn)行檢測(cè)，CTCs檢測(cè)陽(yáng)性率為27.8%，其中12例患者檢測(cè)到1個(gè)CTC，4例檢測(cè)到2個(gè)CTCs，5例檢測(cè)到3～9個(gè)CTCs，2例檢測(cè)到10～99個(gè)CTCs，還有2例患者檢測(cè)到≥100個(gè)CTCs；Ⅱ～Ⅲb期患者的檢測(cè)陽(yáng)性率為26.9%，Ⅲc期患者的檢測(cè)陽(yáng)性率為11.1%，Ⅳ期患者的檢測(cè)陽(yáng)性率為50.0%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)；CTCs檢測(cè)陽(yáng)性率與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是密切相關(guān)的(P=0.002);并且，CTCs檢測(cè)陽(yáng)性率在胸膜轉(zhuǎn)移的患者中是100%，在血行轉(zhuǎn)移的患者中是50%，在遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中是40%，表明CTCs的狀態(tài)與胸膜轉(zhuǎn)移及血行轉(zhuǎn)移是密切相關(guān)的(P<0.000 1，P=0.015)；另外，接受化療的患者其CTCs陽(yáng)性率要高于接受放化療的患者(P=0.004)，因?yàn)檠芯坎±龜?shù)及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的原因，還無法據(jù)此就得出放化療優(yōu)于化療的結(jié)論。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)CTCs檢測(cè)陽(yáng)性患者的總生存率顯著低于CTCs檢測(cè)陰性患者，前者的中位生存期只有261 d，而后者的中位生存期可達(dá)到557 d(P=0.002)；在多因素回歸分析中，術(shù)前CTCs檢測(cè)結(jié)果被證明是獨(dú)立的預(yù)后因素(P=0.021)；在整個(gè)治療過程中，CTCs持續(xù)陽(yáng)性的患者其中位生存期為128 d，治療后CTCs由陽(yáng)轉(zhuǎn)陰的患者中位生存期為514 d，治療前檢測(cè)陰性的患者中位生存期為557 d，表明在治療及隨訪過程中，如果CTCs檢測(cè)由陽(yáng)轉(zhuǎn)陰，患者則可有相對(duì)較好的預(yù)后[38]。該文獻(xiàn)提示，CTCs檢測(cè)對(duì)于ESCC患者的預(yù)后及對(duì)于化療或放化療療效的判斷有著較為可靠的作用。

采用基于按上皮腫瘤細(xì)胞大小分離(ISET)[20]原理的CTC-Biopsy?系統(tǒng)對(duì)接受手術(shù)的ESCC患者進(jìn)行檢測(cè)，山東大學(xué)第二醫(yī)院研究團(tuán)隊(duì)[36]發(fā)現(xiàn)，Ⅲ、Ⅳ期的ESCC患者的CTCs陽(yáng)性率顯著高于Ⅰ、Ⅱ期患者(P=0.017)；術(shù)前外周血CTCs檢測(cè)與陽(yáng)性淋巴結(jié)對(duì)數(shù)比(LODDS)密切相關(guān)；在Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸分析中，術(shù)前CTCs檢測(cè)陽(yáng)性被篩選出可能會(huì)對(duì)術(shù)后生存有顯著影響，如果術(shù)前及術(shù)后7 d的CTCs檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，其生存曲線與其他CTCs狀態(tài)的生存曲線顯著分離，提示著預(yù)后不良的明顯趨勢(shì)，但因隨訪時(shí)間有限，暫未得出總生存率結(jié)果。山東省腫瘤防治研究院團(tuán)隊(duì)[39]發(fā)現(xiàn)，CTCs檢測(cè)陰性的患者有著更佳的無進(jìn)展生存期(PFS)，多因素分析發(fā)現(xiàn)，CTCs檢測(cè)結(jié)果為2個(gè)以上是ESCC患者腫瘤復(fù)發(fā)的強(qiáng)有力、獨(dú)立的預(yù)測(cè)因子；對(duì)接受手術(shù)患者的亞組進(jìn)行分析，接受R0切除的術(shù)后接受輔助治療的患者中，CTCs檢測(cè)結(jié)果仍然是強(qiáng)有力的、獨(dú)立的預(yù)測(cè)因子；對(duì)于Ⅲ期或T3+T4的患者來說，CTCs陽(yáng)性患者的PFS較陰性患者顯著降低。因此，對(duì)于ESCC患者，CTCs即可作為術(shù)前患者判斷預(yù)后的因素，也可作為化療或化放療后判斷療效的指標(biāo)，甚至有作為分期指標(biāo)之一的潛力，治療期間應(yīng)規(guī)律復(fù)查，密切隨訪，綜合其他血液腫瘤指標(biāo)、影像學(xué)檢查及患者既往是否接受了足夠劑量的新輔助或輔助治療等情況，給予更為積極的處理。

此外，有研究表明上皮來源的腫瘤細(xì)胞經(jīng)歷EMT是其侵襲和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，因此EMT-CTCs具有更高的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，能更好地反映患者的預(yù)后和療效。國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃課題“循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)指導(dǎo)Ⅲ期食管癌新輔助化療治療的研究”(2016YFC0106005)研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，在ESCC組織中確實(shí)存在以上皮特性減少、間質(zhì)特性增加的EMT過程，聯(lián)合檢測(cè)波形蛋白(Vimentin)和上皮細(xì)胞鈣黏蛋白(E-Cadherin)有助于判定EMT-CTCs[40]。

4.3 指導(dǎo)治療方案 目前尚未檢索到CTCs用于指導(dǎo)惡性腫瘤患者初始治療選擇的研究，包括ESCC患者在內(nèi)，也沒有檢索到關(guān)于CTCs指導(dǎo)新輔助治療的任何研究成果。有研究表明，在乳腺癌及骨腫瘤的新輔助化療中，CTCs是重要的判斷預(yù)后的因素[41,42]，但對(duì)于行新輔助治療還是輔助治療，還沒有任何一個(gè)惡性腫瘤將CTCs檢測(cè)作為考量依據(jù)。新輔助治療用于惡性腫瘤治療，其重要的理論優(yōu)勢(shì)在于：①術(shù)前即殺滅血液中的微轉(zhuǎn)移灶以降低日后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)；②術(shù)前病灶處的血運(yùn)完整，化療藥物更容易到達(dá)病灶；③術(shù)前即可判斷腫瘤對(duì)于化療或放療的敏感性。但結(jié)合中國(guó)國(guó)情及臨床實(shí)際情況，Ⅱ期及ⅢA期患者和家屬對(duì)新輔助治療的接受率偏低，包括新輔助化療及新輔助化放療。不論是研究及證據(jù)較多的乳腺癌[43,44]還是研究相對(duì)匱乏的ESCC[38]，都被認(rèn)為患者CTCs檢測(cè)結(jié)果可以反映腫瘤進(jìn)展的真實(shí)狀態(tài)及腫瘤對(duì)于治療的反應(yīng)，所以其檢測(cè)對(duì)于新輔助化療或新輔助化放療或術(shù)后輔助治療的指導(dǎo)方面具有潛在的臨床研究前景。例如：①對(duì)于術(shù)前CTCs檢測(cè)即為陽(yáng)性的患者，是否更適合于新輔助治療；②對(duì)于術(shù)前CTCs檢測(cè)為陰性的患者，接受新輔助治療與術(shù)后輔助治療相比較是否生存無顯著差異；③對(duì)于術(shù)前完成新輔助化療或術(shù)后輔助化療的患者，其CTCs仍持續(xù)、大量存在是否意味著對(duì)該化療方案耐藥、術(shù)后需要改換化療方案；④在復(fù)查監(jiān)測(cè)的過程當(dāng)中，患者的CTCs檢測(cè)結(jié)果由陰轉(zhuǎn)陽(yáng)，但影像學(xué)及其他腫瘤學(xué)指標(biāo)均為陰性，是否可作為化療的依據(jù)，尤其是當(dāng)檢測(cè)到的CTCs或CTM出現(xiàn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化時(shí)(EMT-CTCs具有更高的侵襲和轉(zhuǎn)移能力)。這幾項(xiàng)臨床重大問題的解決還需要設(shè)計(jì)更大樣本量、更為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)难芯縼碜C實(shí)。

另外有關(guān)新輔助化療與新輔助化放療，國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃課題“循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)指導(dǎo)Ⅲ期食管癌新輔助化療治療的研究”(2016YFC0106005)研究團(tuán)隊(duì)所實(shí)施的ESCC患者治療的網(wǎng)狀Meta分析[45～47]結(jié)果表明，新輔助化療和新輔助化放療與單獨(dú)手術(shù)相比，都可提高患者的總生存率。在擁有較大病例數(shù)的多中心、前瞻性、隨機(jī)對(duì)照研究匱乏的情況下，網(wǎng)狀Meta分析的確為不同治療手段之間的間接比較提供了解決方案，但由于其納入研究的異質(zhì)性，如不同年代的分期系統(tǒng)差異，納入患者年齡、分期等差異，化療藥物選擇、劑量及化療周期差異，放療方法及照射劑量等差異，分析方法差異(貝葉斯法與頻率學(xué)家方法)，網(wǎng)狀Meta分析的結(jié)果需謹(jǐn)慎對(duì)待。目前，國(guó)內(nèi)外的主流指南均推薦Ⅱ期及Ⅲ期的ESCC患者應(yīng)接受新輔助化療或新輔助化放療，有條件的單位可結(jié)合患者的臨床分期、CTCs檢測(cè)結(jié)果及患方的依從性等因素綜合考量并決策。

5 展望

CTCs的發(fā)現(xiàn)盡管已經(jīng)經(jīng)歷了一個(gè)多世紀(jì)，但由于稀少性、瞬時(shí)性、EMT等原因?qū)е虏东@困難，其在ESCC的臨床應(yīng)用曾較為困難。但近年來，由于CTCs分離檢測(cè)技術(shù)日趨成熟，其在臨床上逐漸應(yīng)用。目前的研究表明，CTCs在ESCC中與預(yù)后預(yù)測(cè)、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估以及治療效果的判斷等密切相關(guān)。

不可否認(rèn)，CTCs在臨床應(yīng)用中仍存在很多困惑甚至是困難，如CTCs檢測(cè)結(jié)果是否可以用于ESCC的分期，是否可用于指導(dǎo)臨床決策(如是否選擇新輔助治療或隨訪過程中是否需要化療等)，這些還需要設(shè)計(jì)更大樣本量、更為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)难芯縼硖剿髋c證實(shí)。

討論專家：

田輝(山東大學(xué)齊魯醫(yī)院)，張百江(山東省腫瘤醫(yī)院)，王偉(山東省胸科醫(yī)院)，叢波(山東大學(xué)第二醫(yī)院)，宋曉明(山東省千佛山醫(yī)院)，王磊(山東省立醫(yī)院)，張林(山東省立醫(yī)院)，張永明(山東省腫瘤醫(yī)院)，范興龍(山東大學(xué)齊魯醫(yī)院青島院區(qū))，岳韋名(山東大學(xué)齊魯醫(yī)院)，張康(濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院)，趙小剛(山東大學(xué)第二醫(yī)院)，彭傳亮(山東大學(xué)第二醫(yī)院)

秘書組：

趙云鵬(山東大學(xué)第二醫(yī)院)，單磊(山東大學(xué)第二醫(yī)院)，王永強(qiáng)(山東大學(xué)第二醫(yī)院)，張文豪(山東大學(xué)第二醫(yī)院)