林書祥，潘蕊，舒劍波，孟英韜，鄒映雪，彭林

(1天津市兒童醫(yī)院·天津市兒科研究所，天津300134；2天津市第四中心醫(yī)院)

手足口病(HFMD)是兒科常見病毒感染性疾病，由多種腸道病毒(EV)引起，具有高度傳染性。HFMD通常是一種良性的自限性疾病，但少部分患者也可出現(xiàn)神經(jīng)、呼吸或循環(huán)系統(tǒng)嚴(yán)重并發(fā)癥，甚至?xí)?dǎo)致死亡。HFMD為我國C類法定傳染病，發(fā)病率和病死率在2017年的45種法定傳染病中居首位。EV是一種正義單鏈RNA病毒，其類型有13種，從A型到J型，鼻病毒A、B、C型。HFMD是通過糞口途徑、直接或間接接觸鼻腔和喉嚨的分泌物進(jìn)行傳播[1]。HFMD感染的主要病原體為EV71和柯薩奇病毒A組16型(CVA16)，不同型別EV感染導(dǎo)致的HFMD臨床特點可能有所不同[2]。但近年來由CVA6和CVA10導(dǎo)致的HFMD在中國[3～6]、法國[7]、泰國[8]發(fā)病逐年增多，因此非EV71和非CVA16的其他EV引起的HFMD也需引起足夠重視。本研究收集2014～2016年天津市兒童醫(yī)院住院HFMD患兒的標(biāo)本，對HFMD進(jìn)行鑒定并對其感染的主要病原體進(jìn)行分型，有助于臨床對本病的診治。

1 對象與方法

1.1 調(diào)查對象 選擇2014～2016年在天津市兒童醫(yī)院住院并成功留取糞便標(biāo)本的HFMD患兒499例，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照HFMD診療指南(2010年版)[9]。其中男320例，女179例，男女比例為1.79∶1；年齡21 d～14歲?；純杭议L知情同意，研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 標(biāo)本采集、處理及保存 采集患兒入院3 d內(nèi)的大便標(biāo)本，置于專用無菌便盒，4 ℃暫存，12 h內(nèi)送達(dá)實驗室后于-80 ℃冰箱保存。取標(biāo)本500 μL，加入等量生理鹽水，配制50%的混懸液，充分振蕩混勻，5 000 r/min離心10 min，取上清用于病毒檢測。

1.3 EV檢測方法 采用RT-PCR法。采用核酸提取及擴(kuò)增試劑盒(江蘇默樂生物科技有限公司)，用RT-PCR法使用熒光定量PCR儀(ABI Prism7500)檢測核酸中的EV通用型、EV71和CVA16。操作步驟：配制工作液，上下顛倒混勻；在洗滌液WA瓶中加入無水乙醇4.8 mL，顛倒混勻6次以備用；洗滌液WB瓶中加入無水乙醇9.2 mL，顛倒混勻6次以備用。取1.5 mL離心管做好標(biāo)記后分別加入已混勻的工作液209 μL；用帶濾芯無RNase的吸頭加入需抽提處理的樣本和對照品200 μL，分別加入蛋白酶K 50 μL，振蕩混勻，短暫離心，72 ℃靜置10 min；用帶濾芯吸頭加入裂解液100 μL，振蕩混勻，短暫離心；將核酸抽提柱置于2 mL離心管上，將液體轉(zhuǎn)移入核酸抽提柱，12 000 r/min離心30 s。棄廢液，在每個核酸抽提柱內(nèi)加入洗滌液WA 500 μL，12 000 r/min離心30 s；棄廢液，在每個核酸抽提柱內(nèi)加入洗滌液WB 450 μL，12 000 r/min離心30 s。棄廢液，以最大轉(zhuǎn)速離心2 min。將核酸抽提柱置于無RNase的離心管，膜中央加入EB 40 μL，靜置1 min，12 000 r/min離心2 min。棄純化柱，將離心回收的核酸儲存于4 ℃待檢。配制反應(yīng)體系，計算各試劑使用量，加入離心管中，充分混勻，簡短離心，向設(shè)定的RT-PCR反應(yīng)管中分別加入20 μL，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。在裝有PCR反應(yīng)液的反應(yīng)管中分別加入制備好的標(biāo)本5 μL，同時做質(zhì)控樣本和陰性對照RT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：45 ℃ 15 min、95 ℃ 2 min，94 ℃ 10 s 40個循環(huán)，58 ℃ 40 s。

1.4 EV陽性標(biāo)本衣殼蛋白VP1(VP1)區(qū)全長基因擴(kuò)增和序列檢測 將陽性EV標(biāo)本按照QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN公司，德國)的操作說明提取標(biāo)本上清中的RNA，按照PrimeScripiT One Step RT-PCR Kit Ver 2(Takara公司，日本)操作說明進(jìn)行EV分型檢測，根據(jù)文獻(xiàn)合成EV分型引物AN32、AN33、AN34、AN35、224、222、AN89、AN88[10]。實驗體系及過程參見Nix WA和Oberste MS的研究過程[10]。實驗過程中使用PICO 21微量離心機(jī)(美國Thermo公司)，C1000梯度DNA擴(kuò)增儀，NC-001電泳儀，及Universal HoodⅡ凝膠成像儀均購自美國BIO-RAD公司。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增結(jié)果，選取瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果陽性的PCR產(chǎn)物，送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，將測序結(jié)果與Genbank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對分析，獲得EV的分型。

1.5 生物信息學(xué)分析 多序列比對分析采用MEGA6.06，使用鄰近法，選擇Kimura 2-parameter模型，構(gòu)建親緣進(jìn)化樹，通過1000 bootstrap評估建樹的可靠性。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料以例或百分比表示，比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EV陽性檢出情況 EV71的陽性率為46.5%(232/499)，CVA16的陽性率為5.4%(27/499)，NENC的陽性率為34.07%(170/499)，三者比例為8.6∶1∶6.3，EV總陽性率為85.97%(429/499)。

2.2 EV陽性標(biāo)本VP1區(qū)基因擴(kuò)增及測序結(jié)果 499份標(biāo)本中共檢出21種EV，EV71陽性率最高，為46.5%(232/499)；其次為CVA10，陽性率9.4%(47/499)；其余EV：CVA6陽性35份、CVA16陽性27份、CVA12陽性11份、?？刹《?型(Echo9)陽性7份、柯薩奇病毒B組3型(CVB3)陽性5份、Echo18陽性3份、Echo6陽性3份、CVA2陽性3份、柯薩奇病毒B組1型(CVB1)陽性3份、CVA4陽性2份、CVA9陽性2份、?？刹《?0型(Echo30)2份、CVA5陽性1份、CVA8陽性1份、CVA24陽性1份、Echo16陽性1份、Echo25陽性1份、CVB2陽性1份、CVB5陽性1份。尚有40份標(biāo)本未能成功測序分型。

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化情況 運用MEGA6.06軟件鄰近法將本研究此次測序的28份EV71型標(biāo)本的VP1序列與EV71各型及亞型代表株序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，可見EV71毒株均與C4a亞型處于同一進(jìn)化分支，屬于C4a亞型。擴(kuò)增104份非EV71非CVA16 EV的VP1編碼序列，共獲得47份CVA10的VP1序列，隨機(jī)選取22份，根據(jù)VP1序列構(gòu)建進(jìn)化樹，22份CVA10聚集成簇，構(gòu)成G型。擴(kuò)增104份非EV71非CVA16的EV VP1編碼序列，共獲得35份CVA6的VP1序列，隨機(jī)選取16份，根據(jù)VP1序列構(gòu)建進(jìn)化樹，16份CVA6聚集成簇，構(gòu)成F型。

3 討論

HFMD是兒童常見的自限性傳染病，自2008年我國暴發(fā)HFMD以來，EV71及CVA16即成為HFMD的主要病原體[11,12]。但近年來，由CVA6和CVA10引起的HFMD病例也逐漸增多，出現(xiàn)零星發(fā)生或暴發(fā)增加，或?qū)⑷〈鶨V71及CVA16成為主要病原體，在導(dǎo)致HFMD的散發(fā)和暴發(fā)中造成越來越大的影響。

盡管EV的多種基因型和亞型可同時或循環(huán)在其他國家和地區(qū)發(fā)病[8,13～16]，但研究顯示EV71仍然是導(dǎo)致2014～2016年天津地區(qū)HFMD發(fā)生的主要EV。EV71在世界各地以循環(huán)方式暴發(fā)，且該病毒每2～3年就會感染大量免疫能力不足的兒童。通過對進(jìn)化樹的構(gòu)建及分析，發(fā)現(xiàn)EV71與以往報道結(jié)果相同[17,18]，仍屬C4a亞型。HFMD是一種溫和的自限性疾病，EV71與其他EV相比更易導(dǎo)致腦膜腦炎、肺出血、循環(huán)衰竭甚至死亡。因此，仍需長期全面監(jiān)測EV71。

據(jù)報道，CVA10感染早在1981年就在日本暴發(fā)[19]。近年來，CVA10感染發(fā)生率在我國山東、河北和湖北在內(nèi)的多個地區(qū)不斷上升，這使其成為中國HFMD的常見病毒[12,20,21]。CVA10已成為HFMD的主要病原體之一，近年來常被發(fā)現(xiàn)與其他EV共同流行，這對預(yù)防和控制HFMD構(gòu)成了挑戰(zhàn)。本研究中雖只有47份標(biāo)本CVA10陽性，但其陽性率僅次于EV71。通過對進(jìn)化樹的構(gòu)建及分析發(fā)現(xiàn)CVA10的序列排列聚集成7個集群(A～G)。本研究中的22份CVA10與Zhang等[22]報道的G型參考株聚集成簇，其中G型集群絕大多數(shù)參考株來自2009年以后的中國大陸包括山東、河北、上海等地，而A～E型來自2010年及以前的日本、俄國、法國、印度等地，F(xiàn)型來自2008年及以前的中國大陸地區(qū)。由此可見，近年來CVA10在我國導(dǎo)致的HFMD正呈現(xiàn)逐年增多的趨勢，需引起重視。根據(jù)病毒出現(xiàn)的時間序列和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，可對未來會持續(xù)流行的病毒進(jìn)化枝或亞枝進(jìn)行粗略預(yù)測，以便更準(zhǔn)確地預(yù)防與診斷疾病。

CVA6是另一種重要的血清型病毒。雖然CVA6感染通常是輕度和自限性的，以咽喉潰瘍?yōu)樘卣鞯陌捳钚匝蕧{炎和皮膚癥狀為特征的HFMD最為常見。CVA6感染的大多數(shù)病例與嚴(yán)重的皮膚表現(xiàn)和甲狀腺腫瘤有關(guān)[23]。本研究CVA6陽性35份，陽性率僅次于EV71和CVA10，居第3位。通過對進(jìn)化樹的構(gòu)建及分析發(fā)現(xiàn)，隨機(jī)選取的16份CVA6的序列排列聚集成6個集群(A～F)，其中本研究中的16份CVA6聚集成簇構(gòu)成F型，F(xiàn)型集群的參考株來自2008～2012年的西班牙、芬蘭、法國、古巴、日本等國家及2011～2013年的上海、廣東、泰州和蘇州等中國大陸地區(qū)；A～E型來自1992年的山東及1994～2010年的美國、印度、日本、法國等。通過進(jìn)化樹可以粗略觀察近年來世界各地CVA6流行的病毒亞型已發(fā)生改變，這對今后的疫苗研究及疾病的防控有重要意義。

綜上所述，2014～2016年天津市兒童醫(yī)院499例HFMD患兒共檢出21種不同的EV，雖然EV71的陽性率仍最高，但非EV71非CA16的其他EV類型也占據(jù)一定比例。因此需長期全面監(jiān)測，及時發(fā)現(xiàn)新型別病毒，以預(yù)防感染并控制疾病流行。