陳 躍 馮亞東 趙向陽(yáng)

南京市溧水區(qū)人民醫(yī)院消化科(東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院溧水分院)1(211200) 東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院消化科2

背景：Claudin蛋白家族是構(gòu)成細(xì)胞緊密連接的重要分子，其中claudin-2是一種在肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞中高表達(dá)的細(xì)胞旁通道形成蛋白，具有水分子和陽(yáng)離子的選擇滲透性，在消化和泌尿系統(tǒng)中發(fā)揮至關(guān)重要的生理調(diào)控作用。目的：探討claudin-2在膽固醇結(jié)石形成和膽汁分泌過程中的作用及其機(jī)制。方法：收集claudin-2基因敲除(Cldn-2-/-)小鼠和野生型(Cldn-2+/+)小鼠的肝臟和膽囊組織，以蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)claudin蛋白家族的表達(dá)，HE染色、免疫熒光染色和電鏡觀察敲除claudin-2基因?qū)Ω闻K和膽囊組織結(jié)構(gòu)的影響。并分析claudin-2蛋白對(duì)膽汁成分和流速的調(diào)控作用。結(jié)果：Claudin家族蛋白在Cldn-2+/+小鼠肝臟和膽囊組織中高表達(dá)。與Cldn-2+/+小鼠相比，Cldn-2-/-小鼠肝臟和膽囊組織結(jié)構(gòu)無明顯差異，膽汁流速明顯降低(P<0.05)，膽汁濃度明顯增加(P<0.05)，肝臟和膽囊膽汁中的膽汁酸、膽固醇、膽紅素、磷脂含量顯著增加(P<0.05)。結(jié)論：Claudin-2蛋白通過調(diào)控膽汁成分和細(xì)胞緊密連接中的水分子旁分泌過程，影響膽汁的形成，這一過程的失調(diào)顯著增加了小鼠對(duì)膽固醇結(jié)石相關(guān)疾病的易感性。

膽石癥是消化系統(tǒng)的常見疾病，我國(guó)的發(fā)病率高達(dá)10%～15%，并呈逐年上升的趨勢(shì)[1]，但對(duì)膽石癥尤其膽固醇結(jié)石形成的具體機(jī)制缺乏深入的研究。有研究發(fā)現(xiàn)，在膽汁成核作用開始，到脂質(zhì)轉(zhuǎn)化、囊泡破壞和融合直至膽固醇單水結(jié)晶形成的過程中，成核因子和抑成核因子在多個(gè)水平上調(diào)控膽固醇的成核作用[2]，尋找關(guān)鍵的成核因子和抑成核因子是遏制膽固醇結(jié)石形成的重要突破口。

Claudin-2是第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的通道形成蛋白，具有水分子和陽(yáng)離子的選擇滲透性，在消化和泌尿系統(tǒng)中發(fā)揮至關(guān)重要的生理調(diào)控作用[3-4]。Claudin-1、-2、-3蛋白在肝臟和膽管系統(tǒng)中廣泛分布，claudin-1基因的功能障礙會(huì)導(dǎo)致膽汁滲漏、肝內(nèi)膽汁淤積和肝細(xì)胞損傷，形成硬化性膽管炎[5]。目前尚無關(guān)于claudin-2基因在膽囊結(jié)石致病機(jī)制中的報(bào)道，但其功能可能與claudin-1類似，在膽管結(jié)石的形成過程中發(fā)揮重要的生理調(diào)控作用。本研究通過評(píng)估敲除claudin-2基因?qū)π∈蟾闻K和膽囊組織結(jié)構(gòu)的影響，以及對(duì)膽汁成分和流速的調(diào)控作用，旨在探討claudin-2在膽固醇結(jié)石形成和膽汁分泌過程中的作用及其機(jī)制，從而為臨床治療膽囊結(jié)石尋找潛在靶點(diǎn)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：20只SPF級(jí)claudin-2基因缺失(Cldn-2-/-)C57BL/6小鼠和20只claudin-2野生型(Cldn-2+/+)小鼠購(gòu)自上海南方模式生物科技股份有限公司，體質(zhì)量20～25 g。由東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)并穩(wěn)定建系傳代。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案通過東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院動(dòng)物研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2.主要實(shí)驗(yàn)試劑：兔抗claudin-1、-2、-3抗體(Invitrogen，Life Technologies)，Alexa-488標(biāo)記的抗兔IgG以及Alexa-546標(biāo)記的抗鼠IgG抗體(Molecular Probes)。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.實(shí)驗(yàn)分組和組織標(biāo)本的獲?。篊ldn-2+/+小鼠和Cldn-2+/+小鼠喂食膽固醇結(jié)石誘石飼料4周。所有實(shí)驗(yàn)小鼠于術(shù)前禁食12 h，戊巴比妥(4.5 mg/100 g劑量)腹腔注射麻醉，采用腹部正中切口，暴露膽囊，觀察有無結(jié)石并收集部分膽汁進(jìn)行膽汁成分分析，結(jié)扎膽囊管切除膽囊于液氮凍存，同時(shí)采集肝臟組織-80 ℃保存。

2.HE和免疫熒光染色：取肝臟和膽囊組織，以甲醛溶液固定，石蠟包埋后切片行常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下分析肝臟和膽囊組織形態(tài)學(xué)變化。另取部分液氮冷凍的肝臟和膽囊組織進(jìn)行切片，修復(fù)抗原，清除內(nèi)源性過氧化物酶活性，血清封閉，滴加claudin-1、-2、-3免疫熒光抗體(工作濃度1∶750)4 ℃孵育過夜，室溫下孵育二抗2 h，封片。光學(xué)顯微鏡下觀察免疫熒光染色結(jié)果。

3.膽汁流量測(cè)量：小鼠自由飲水、禁食4 h后戊巴比妥腹腔注射麻醉，剖腹分離膽總管后插入塑料引流管并結(jié)扎固定，待流量穩(wěn)定后連續(xù)觀察4 h，測(cè)定每小時(shí)膽汁流量和流速，并收集部分膽汁進(jìn)行膽汁成分分析。

4.蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)肝臟組織claudin蛋白家族的表達(dá)情況：取100 mg肝臟組織，低溫研磨，充分裂解后獲取蛋白上清，以Bradford法進(jìn)行蛋白定量。取40 μg蛋白樣品，行10% SDS-PAGE電泳，半干轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，37 ℃封閉液中封閉2 h；分別加入claudin-1、-2、-3抗體(工作濃度為1∶500)4 ℃孵育過夜。次日用TBST洗膜3次后，加入相應(yīng)二抗(工作濃度1∶20 000)，室溫下孵育2 h，TBST洗膜3次，ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色。以GAPDH蛋白條帶作為內(nèi)參。

5.電鏡觀察膽囊和肝內(nèi)膽管超微結(jié)構(gòu)：取肝內(nèi)膽管和膽囊組織，2.0%多聚甲醛和2.0%戊二醛溶液前固定24 h，磷酸緩沖液沖洗，置于1%鋨酸中后固定2 h，雙蒸水沖洗后系列乙醇脫水，包埋，切片，厚60～90 nm，醋酸鈾-檸檬酸鉛復(fù)染，透射電鏡(JEM-1230)下觀察并拍照。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、Claudin蛋白家族在肝臟和膽囊組織中存在特異性高表達(dá)

Claudin-1、-2、-3在Cldn-2+/+小鼠肝內(nèi)膽管和膽囊上皮的表達(dá)均較高，而敲除claudin-2基因后，claudin-2表達(dá)顯著降低，但claudin-1、-3表達(dá)無明顯差異(圖1)。說明claudin蛋白家族在Cldn-2+/+小鼠肝臟和膽囊組織中特異性高表達(dá)，Cldn-2-/-小鼠能在肝臟和膽囊組織中實(shí)現(xiàn)claudin-2蛋白的特異性敲除，同時(shí)不影響其他claudin蛋白的表達(dá)。

二、Claudin-2蛋白對(duì)肝臟和膽囊組織結(jié)構(gòu)的影響

HE染色示，兩組小鼠肝臟和膽囊組織并未呈明顯的差異(圖2A、2B)。掃描電鏡結(jié)果顯示，與Cldn-2+/+小鼠相比，Cldn-2-/-小鼠靜脈區(qū)膽管寬度[0.79±0.03)mm對(duì)(0.78±0.04)mm]、門靜脈區(qū)[(0.92±0.03)mm對(duì)(0.90±0.02)mm]均無明顯差異(P>0.05；圖2C)。說明敲除claudin-2基因在組織學(xué)上并不會(huì)對(duì)肝臟和膽囊組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯影響。

A：免疫熒光染色；B：蛋白質(zhì)印跡法

A：肝臟HE染色(×100)；B：膽囊HE染色(×100)；C：掃描電鏡(×200)

圖2 敲除claudin-2基因?qū)π∈蟾闻K和膽囊結(jié)構(gòu)的影響

三、Claudin-2蛋白對(duì)膽汁流速的影響

與Cldn-2+/+小鼠相比，Cldn-2-/-小鼠肝內(nèi)和膽囊膽汁的顏色加深，質(zhì)地濃稠(圖3A)；膽汁流速明顯降低[(3.00±0.40)μL·min-1·100 g-1對(duì)(5.80±0.32)μL·min-1·100 g-1，P<0.05；圖3B]。證實(shí)敲除claudin-2基因會(huì)導(dǎo)致膽汁分泌的流速降低、膽汁濃縮。

四、Claudin-2蛋白對(duì)膽汁成分的調(diào)控

與Cldn-2+/+小鼠相比，Cldn-2-/-小鼠肝臟和膽囊膽汁中總膽固醇、磷脂、總膽汁酸、總膽紅素含量均明顯升高(P<0.05；圖3C、3D、表1)。

討 論

膽囊膽固醇結(jié)石的形成機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，受到多種因素的影響和調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，成核因子和抑成核因子共同參與了膽囊膽固醇結(jié)石的形成，其中包括蛋白質(zhì)、有機(jī)離子和無機(jī)離子[6-7]。本研究通過Cldn-2-/-小鼠的在體和離體實(shí)驗(yàn)證實(shí)claudin-2蛋白缺失會(huì)改變分泌膽汁成分，進(jìn)而誘導(dǎo)膽囊結(jié)石的形成，有望為尋找遏制膽固醇結(jié)石形成的關(guān)鍵因子提供重要突破口。

研究認(rèn)為，生物系統(tǒng)內(nèi)外環(huán)境的穩(wěn)定性可通過細(xì)胞旁滲透進(jìn)行調(diào)節(jié)，細(xì)胞旁滲透的破壞可誘發(fā)多種疾病。緊密連接作為細(xì)胞間的一種連接方式，是細(xì)胞旁滲透發(fā)揮生理作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，可實(shí)現(xiàn)水分子和脂溶性物質(zhì)的選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)，為維持上皮細(xì)胞內(nèi)外兩個(gè)不同環(huán)境的穩(wěn)定提供滲透屏障，進(jìn)而保證上皮細(xì)胞的極性[8]。多種緊密連接蛋白共同組成了細(xì)胞的緊密連接，包括claudin蛋白、連接黏附分子(JAMs)、咬合蛋白(occludin)，其中claudin蛋白是緊密連接最重要的組成部分[9-10]。Claudin蛋白家族是一個(gè)四跨跨膜蛋白的大家族，目前發(fā)現(xiàn)了至少27個(gè)成員，在不同細(xì)胞系統(tǒng)中發(fā)揮不同功能[11]。Claudin-2是claudin蛋白家族中最早發(fā)現(xiàn)和研究最多的緊密連接蛋白，能形成陽(yáng)離子選擇性通道[12]。在腎臟組織中，claudin-2基因的缺失會(huì)導(dǎo)致小鼠近端小管喪失陽(yáng)離子選擇性，鈉離子和氯離子的重吸收受阻[13]。研究發(fā)現(xiàn)claudin-2通過形成細(xì)胞旁水通道，介導(dǎo)水分子在MDCK細(xì)胞間的跨細(xì)胞運(yùn)輸[14]。膽管系統(tǒng)分泌的膽汁成分中98%是水，因此膽汁中水分含量會(huì)直接影響膽汁流速和成分[1]。本研究發(fā)現(xiàn)，敲除claudin-2基因后膽汁中的鈉離子濃度降低，膽汁酸和脂質(zhì)成分濃縮，提示膽管系統(tǒng)中claudin-2缺失可減弱細(xì)胞緊密連接中的水分子旁分泌，進(jìn)而造成膽汁中膽汁酸、膽固醇、磷脂、膽紅素等成分的濃縮和相對(duì)含量增加，膽汁流速降低，從而促進(jìn)小鼠膽固醇結(jié)石的形成。

*P<0.05

A：肝內(nèi)膽汁和膽囊膽汁肉眼圖；B：膽汁流速；C：肝臟膽汁成分；D：膽囊膽汁成分

圖3 Claudin-2蛋白對(duì)膽汁流速和成分的調(diào)控作用

表1 Cldn-2+/+和Cldn-2-/-小鼠膽汁成分比較

總之，本研究證實(shí)膽汁成分和分泌量部分受claudin-2蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞旁通透性所調(diào)節(jié)，有望為預(yù)防膽石病提供新的治療靶點(diǎn)，靶向claudin-2調(diào)控的細(xì)胞旁通透性可能成為治療各種病因引起的膽汁淤積癥的潛在策略。