彭 好 沈 磊

武漢大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)科(430060)

背景：叉頭框蛋白A2(Foxa2)在結(jié)直腸癌的增殖和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中具有重要作用，但關(guān)于Foxa2在結(jié)直腸息肉中的表達(dá)未見相關(guān)報(bào)道。目的：探討Foxa2在結(jié)直腸息肉和結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其意義。方法：選取2018年1月—2019年5月至武漢大學(xué)人民醫(yī)院收治的45例增生性息肉、135例腺瘤性息肉和45例結(jié)直腸癌及其相應(yīng)癌旁正常黏膜組織。采用免疫組化SP法檢測Foxa2表達(dá)情況，實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)印跡法分別檢測Foxa2 mRNA和蛋白表達(dá)，并分析Foxa2表達(dá)與結(jié)直腸息肉、結(jié)直腸癌之間的關(guān)系。結(jié)果：Foxa2在正常結(jié)直腸黏膜組織、增生性息肉、腺瘤性息肉、結(jié)直腸癌中的陽性表達(dá)率分別為13.3%、31.1%、62.2%、86.7%，組間相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。正常結(jié)直腸黏膜組織、增生性息肉、腺瘤性息肉、結(jié)直腸癌中Foxa2 mRNA和蛋白表達(dá)逐漸增高，組間相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Foxa2表達(dá)與腺瘤性息肉的大小、是否帶蒂有關(guān)(P<0.05)；與結(jié)直腸癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)(P<0.05)。結(jié)論：Foxa2在腺瘤性息肉和結(jié)直腸癌中高表達(dá)，且隨著息肉癌變風(fēng)險(xiǎn)提高而增高，因此檢測結(jié)直腸息肉組織中Foxa2蛋白表達(dá)有助于早期發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌。

結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤之一[1]。隨著飲食結(jié)構(gòu)的改變，我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈逐漸上升的趨勢[2]。結(jié)直腸息肉是結(jié)直腸黏膜的隆起性病變，常見病理類型包括炎性息肉、增生性息肉、腺瘤性息肉等，其中腺瘤性息肉屬于結(jié)直腸癌的癌前病變[3]。目前關(guān)于腺瘤性息肉癌變的機(jī)制尚不清楚。從分子生物學(xué)角度研究腺瘤性息肉與結(jié)直腸癌之間的關(guān)系，對(duì)于預(yù)防、診斷、治療結(jié)直腸癌具有重要意義。叉頭框蛋白A2(forkhead box A2, Foxa2)又稱為肝細(xì)胞核因子3β(hepatocyte nuclear factor 3β, HNF3β)，其能與DNA啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，在細(xì)胞分化、細(xì)胞代謝中發(fā)揮重要作用[4-5]。有研究[6]表明，F(xiàn)oxa2能促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲。本研究通過檢測不同類型結(jié)直腸息肉以及結(jié)直腸癌中Foxa2的表達(dá)，旨在探討Foxa2、結(jié)直腸息肉、結(jié)直腸癌三者之間的關(guān)系，從而為預(yù)防、診斷、治療結(jié)直腸癌提供一種新手段。

材料與方法

一、臨床資料

收集2018年1月—2019年5月至武漢大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)鏡中心行內(nèi)鏡下切除的增生性息肉45例、腺瘤性息肉135例，其中管狀腺瘤、管狀絨毛狀腺瘤、絨毛狀腺瘤各45例，另取外科手術(shù)切除的結(jié)直腸癌及其配對(duì)的正常結(jié)直腸黏膜(距腫瘤邊緣>5 cm)組織各45例。在180例息肉患者中，男107例，女73例，年齡26～81歲，平均(55.60±14.16)歲；45例結(jié)直腸癌患者中，男22例，女23例，年齡40～79歲，平均(62.78±9.20)歲。根據(jù)2000年WHO消化系腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)，高中分化腺癌17例，低分化腺癌28例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移15例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例；TNM分期采用國際抗癌聯(lián)盟2009年發(fā)布的第7版分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ+Ⅱ期19例，Ⅲ+Ⅳ期26例。收集的各組樣本組織立即置于液氮中，-80 ℃保存。

二、方法

1.免疫組化SP法：將4 μm厚的石蠟切片進(jìn)行二甲苯脫蠟、乙醇水合、蒸餾水浸洗后，置于0.01 mol/L MEDTA緩沖液(pH 9.0)中，微波爐熱修復(fù)25 min，TBS沖洗。0.3%雙氧水去除內(nèi)源性過氧化物酶，滴加小鼠抗人Foxa2抗體(稀釋濃度1∶100，美國R&D公司)，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，于4 ℃濕盒子中孵育15 h，加酶標(biāo)二抗，0.25% Triton X-100室溫破膜10 min，TBS沖洗。DAB顯色(購自Agilent Technologies, Inc.)，蘇木素復(fù)染，脫水、封片，顯微鏡下觀察和采集圖像。

結(jié)果判定：Foxa2免疫組化陽性產(chǎn)物呈棕黃色或棕褐色，主要位于細(xì)胞核內(nèi)，部分組織中因轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的不同時(shí)相，可在胞質(zhì)或胞膜上特異性表達(dá)。高倍鏡(×400)下隨機(jī)選取4個(gè)視野，評(píng)估染色的陽性程度和陽性面積。陽性強(qiáng)度：無色，0分；黃色，1分；棕黃色，2分；棕褐色，3分。陽性面積：<10%為0分，10%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分。染色總分為強(qiáng)度與陽性面積之積，總分0分為不表達(dá)，1～3分為弱表達(dá)，4～6分為中度表達(dá)，7～9分為強(qiáng)表達(dá)，將0～3分定義為陰性，4～9分定義為陽性。

2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測Foxa2 mRNA含量：提取各組組織RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。行實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。Foxa2引物由天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成，引物序列上游：5’-GCG ACC CCA AGA CCT ACA G-3’，下游：5’-GGT TCT GCC GGT AGA AGG G-3’；以GAPDH作為內(nèi)參，上游：5’-CAT GAG AAG TAT GAC AAC AGC CT-3’，下游：5’-AGT CCT TCC ACG ATA CCA AAG T-3’。采用2-△△Ct法計(jì)算Foxa2 mRNA相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

3.蛋白質(zhì)印跡法檢測Foxa2蛋白表達(dá)：各組組織勻漿離心后制成細(xì)胞裂解液，行SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。加入一抗GAPDH(杭州賢至生物科技有限公司)、Foxa2(R&D Systems)，稀釋比例為1∶1 000，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜5～6次。加入HRP的標(biāo)記二抗(武漢博士德生物工程有限公司)(1∶50 000稀釋)，37 ℃搖床孵育2 h，TBST充分洗滌。顯色，攝片。采用Image J圖像分析軟件測定條帶灰度值，以Foxa2條帶灰度值與GAPDH灰度值的比值作為Foxa2蛋白的相對(duì)表達(dá)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、Foxa2蛋白在不同病理組織中的表達(dá)

不同組別中Foxa2表達(dá)見圖1。與正常結(jié)直腸黏膜組相比，增生性息肉組、腺瘤性息肉組、結(jié)直腸癌組Foxa2表達(dá)率均顯著升高(31.1%、62.2%、86.7%對(duì)13.3%，P<0.05)；與增生性息肉組相比，腺瘤性息肉組、結(jié)直腸癌組Foxa2表達(dá)率均顯著升高(P<0.05)；結(jié)直腸癌組又顯著高于腺瘤性息肉組(P=0.002)。此外，腺瘤性息肉組中Foxa2表達(dá)率隨著絨毛含量的增加而有所升高，但組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05；表1)。

在135例腺瘤性息肉中，低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變?yōu)?7例，陽性表達(dá)率為61.4%(35/57)；高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變?yōu)?例，陽性表達(dá)率為75%(6/8), 兩者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.723)。

二、Foxa2 mRNA表達(dá)

Foxa2 mRNA在正常組織、增生性息肉、腺瘤性息肉、結(jié)直腸癌中的表達(dá)逐漸增加，且兩兩之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05;圖2、表2)。

A：正常結(jié)直腸黏膜；B：增生性息肉；C：管狀腺瘤；D：管狀絨毛狀腺瘤；E：絨毛狀腺瘤；F：結(jié)直腸癌

圖1 Foxa2蛋白在不同病理組織中的表達(dá)(免疫組化SP法，×400)

表1 不同病理組織中Foxa2表達(dá)情況

*與正常結(jié)直腸黏膜組比較，P<0.05；#與增生性息肉組比較，P<0.05；▲與腺瘤性息肉組比較，P<0.05

1：正常結(jié)直腸黏膜組；2：增生性息肉組；3：腺瘤性息肉組；4：結(jié)直腸癌組

a與正常結(jié)直腸黏膜組比較，P<0.05；b與增生性息肉組比較，P<0.05；c與腺瘤性息肉組比較，P<0.05

圖2 不同病理組織中Foxa2 mRNA表達(dá)(實(shí)時(shí)熒光定量PCR法)

表2 各組組織中Foxa2 mRNA和蛋白表達(dá)情況

*與正常結(jié)直腸黏膜組比較，P<0.05；#與增生性息肉組比較，P<0.05；▲與腺瘤性息肉組比較，P<0.05

三、Foxa2蛋白表達(dá)

Foxa2蛋白含量在正常組織、增生性息肉、腺瘤性息肉、結(jié)直腸癌中的表達(dá)逐漸增加，且兩兩之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05;圖3、表2)。

1：正常結(jié)直腸黏膜組；2：增生性息肉組；3：腺瘤性息肉組；4：結(jié)直腸癌組

a與正常結(jié)直腸黏膜組比較，P<0.05；b與增生性息肉組比較，P<0.05；c與腺瘤性息肉組比較，P<0.05

圖3 不同病理組織中Foxa2蛋白表達(dá)(蛋白質(zhì)印跡法)

四、Foxa2表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

Foxa2表達(dá)與腺瘤性息肉大小、是否有蒂有關(guān)(P<0.05)，而與患者的性別、年齡、息肉部位均無明顯相關(guān)性(P>0.05；表3)。Foxa2表達(dá)與結(jié)直腸癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)(P<0.05；表4)。

表3 Foxa2表達(dá)與結(jié)直腸腺瘤性息肉患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系(n)

*近端結(jié)直腸：距肛緣≤7 cm；遠(yuǎn)端結(jié)直腸：距肛緣>7 cm

表4 Foxa2表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系(n)

討 論

結(jié)直腸癌發(fā)生的原因復(fù)雜多樣，涉及多基因、多因素的相互作用。結(jié)直腸腺瘤為目前公認(rèn)的結(jié)直腸癌癌前病變，因此，對(duì)結(jié)直腸息肉性質(zhì)的準(zhǔn)確判斷以及防治是預(yù)防結(jié)直腸癌發(fā)生的重要手段。目前，早期診斷結(jié)直腸癌的常用分子生物學(xué)標(biāo)志物包括SEPT9、vimentin、癌胚抗原(CEA)、細(xì)胞角蛋白20(CK20)、表皮生長因子受體(EGFR)等[7]。近年有研究發(fā)現(xiàn)Foxa2在結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲等過程中具有一定作用[6]。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)正常結(jié)直腸黏膜、增生性息肉、腺瘤性息肉、結(jié)直腸癌等組織中Foxa2的表達(dá)進(jìn)行研究，并探討Foxa2、腺瘤性息肉、結(jié)直腸癌三者之間的關(guān)系，旨在為Foxa2預(yù)測結(jié)直腸息肉的癌變風(fēng)險(xiǎn)提供理論依據(jù)。

有研究表明，結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展與Wnt-β-catenin、Hedgehog等信號(hào)通路關(guān)系密切[8-10]。Foxa2蛋白是一種調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和修復(fù)基因的DNA結(jié)合蛋白，通過結(jié)合順序調(diào)控序列來調(diào)節(jié)相關(guān)目標(biāo)基因的表達(dá)，參與細(xì)胞增殖和分化過程，其表達(dá)異常與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，如膀胱癌[11]、乳腺癌[12]、肺癌[13]、肝癌[14]、胰腺癌、甲狀腺癌等。有研究[15]證實(shí)，在食管腺癌形成過程中，Hedgehog信號(hào)通路被激活，從而誘導(dǎo)其下游目的基因Foxa2的表達(dá)，導(dǎo)致食管腺癌組織中Foxa2蛋白表達(dá)增加。Villacorte等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，在子宮內(nèi)膜腺癌形成過程中，Wnt/β-catenin信號(hào)通路通過調(diào)節(jié)Foxa2基因及其上游區(qū)域，控制細(xì)胞周期從而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖。另一項(xiàng)研究[17]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxa2基因與其鄰近基因lncRNA-NEF相互促進(jìn)表達(dá)，抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路，從而抑制肝癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。上述研究結(jié)果提示Foxa2可通過Wnt/β-catenin、Hedgehog等信號(hào)通路在腫瘤的形成和發(fā)展中起有重要作用。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxa2在增生性息肉中的表達(dá)率明顯高于正常結(jié)直腸黏膜(P<0.05)。這可能是增生性息肉產(chǎn)生過程中，Hedgehog信號(hào)通路有所上調(diào)，激活下游目標(biāo)基因Foxa2的表達(dá)。腺瘤性息肉和結(jié)直腸癌中Foxa2表達(dá)率明顯高于增生性息肉，這可能是在腺瘤性息肉發(fā)生和發(fā)展過程中，Wnt/β-catenin信號(hào)通路和Hedgehog信號(hào)通路共同激活Foxa2表達(dá)所致[18]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，分化程度越低、TNM分期越晚、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織中，F(xiàn)oxa2表達(dá)陽性率越高。Wang等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，siR-Foxa2干擾組HCT116和HT29細(xì)胞出現(xiàn)G1/S期阻滯，細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和侵襲減少，提示下調(diào)Foxa2可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。本研究中，腺瘤性息肉組織中Foxa2表達(dá)隨息肉絨毛含量的增加而增加，但差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變中的表達(dá)高于低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變，差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Foxa2表達(dá)在高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組與結(jié)直腸癌組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.754)，但低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組與結(jié)直腸癌組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.005)；Foxa2表達(dá)與腺瘤性息肉大小、是否有蒂有關(guān)(P<0.05)，而與患者的性別、年齡、息肉部位均無關(guān)(P>0.05)。說明Foxa2蛋白表達(dá)隨著結(jié)直腸息肉惡變風(fēng)險(xiǎn)的增加而明顯增強(qiáng)，息肉大小、是否有蒂可影響Foxa2蛋白的表達(dá)。

綜上所述，F(xiàn)oxa2在結(jié)直腸腺瘤性息肉和結(jié)直腸癌中高表達(dá)，且隨著息肉癌變風(fēng)險(xiǎn)提高而增加。因此，通過檢測Foxa2表達(dá)有望預(yù)測結(jié)直腸息肉癌變風(fēng)險(xiǎn)。但Foxa2參與結(jié)直腸息肉癌變和結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步深入研究。