楊長(zhǎng)青 郭曉姝 李 季 趙 莉 趙甘婷 盛淑婷 魏子白

長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院消化科(046000)

背景：利福昔明可明顯緩解腸易激綜合征患者的腹痛，但機(jī)制不明。目的：探討利福昔明對(duì)大鼠內(nèi)臟敏感性的影響及其作用機(jī)制。方法：建立慢性避水應(yīng)激大鼠模型，并將大鼠分為對(duì)照組、模型組和利福昔明組。行肌電圖評(píng)估大鼠內(nèi)臟敏感性，免疫熒光法檢測(cè)L6S1 DRG中TRPV1、VGLUT2/3免疫活性，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)L6S1段脊髓中TRPV1、VGLUT2/3蛋白表達(dá)，行16S rDNA菌群測(cè)序分析。結(jié)果：慢性避水應(yīng)激能誘導(dǎo)大鼠內(nèi)臟敏感性增高，L6S1 DRG中TRPV1、VGLUT2/3免疫活性明顯增高，L6S1段脊髓中TRPV1、VGLUT2/3蛋白表達(dá)明顯增高，腸道菌群發(fā)生紊亂。給予利福昔明后，內(nèi)臟敏感性明顯降低，L6S1 DRG中TRPV1、VGLUT2/3免疫活性明顯降低，L6S1段脊髓中TRPV1、VGLUT2/3蛋白表達(dá)明顯降低，腸道菌群紊亂明顯改善。TRPV1拮抗劑可明顯降低VGLUT2/3免疫活性。結(jié)論：利福昔明通過腸道菌群和TRPV1-VGLUT2/3通路改善應(yīng)激誘導(dǎo)的大鼠內(nèi)臟高敏感。

腸易激綜合征(IBS)是消化科門診的常見病，全世界發(fā)病率為10%～20%[1]。患者表現(xiàn)以腹痛為主并伴排便習(xí)慣改變，但腹痛癥狀目前尚無有效的治療方法，研究顯示內(nèi)臟高敏感可能是引起腹痛的主要原因之一[2]。

利福昔明是一種腸道非吸收性抗菌藥物，能改變大鼠回腸的細(xì)菌種類，導(dǎo)致乳酸桿菌增加，從而預(yù)防慢性心理應(yīng)激誘導(dǎo)的內(nèi)臟高敏感[3]。利福昔明已被FDA批準(zhǔn)用于IBS患者的治療，可有效改善腹痛癥狀[4]，但其具體作用機(jī)制尚未完全闡明。

有研究[5]結(jié)果顯示瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1(transient receptor potential vanilloid 1, TRPV1)參與內(nèi)臟高敏感的形成。囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-3(vesicular glutamate transporter 3, VGLUT3)參與結(jié)直腸擴(kuò)張(CRD)誘導(dǎo)的內(nèi)臟痛覺轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，旋毛蟲一過性腸道感染可引起外周和中樞神經(jīng)VGLUT3表達(dá)增加，參與內(nèi)臟高敏感的形成[6]。目前尚未見利福昔明是否通過腸道菌群和TRPV1-VGLUT3通路誘導(dǎo)內(nèi)臟高敏感的報(bào)道。本研究通過制備慢性避水應(yīng)激(water avoidance stress, WAS)動(dòng)物模型，并檢測(cè)背根神經(jīng)節(jié)(DRG)和脊髓TRPV1、VGLUT2/3表達(dá)以及評(píng)估腸道菌群情況，旨在探討利福昔明改善IBS腹痛的可能機(jī)制，從而為利福昔明改善IBS患者腹痛癥狀提供新的理論基礎(chǔ)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年雄性Sprague-Dawley大鼠30只，體質(zhì)量200～250 g，在標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)。所有實(shí)驗(yàn)程序均經(jīng)長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

二、方法

1.動(dòng)物分組和模型制備：大鼠隨機(jī)分為WAS組、對(duì)照組和利福昔明組，每組各6只。將大鼠置于盛有水(25 ℃)的有機(jī)玻璃槽中央的玻璃板上，水平面低于玻璃板1 cm。限制大鼠活動(dòng)，每天1 h，連續(xù)10 d，以制備慢性WAS模型。對(duì)照組玻璃槽中無水。利福昔明組大鼠先灌胃利福昔明(150 mg/kg，Sigma)，2次/d，連續(xù)10 d，然后行慢性WAS實(shí)驗(yàn)。

2.內(nèi)臟運(yùn)動(dòng)反應(yīng)檢測(cè)和肌電圖分析：檢測(cè)前禁食24 h，乙醚輕度麻醉動(dòng)物，將直徑為2 mm的一次性導(dǎo)尿管氣囊由肛門插入遠(yuǎn)端結(jié)腸，球囊近端距肛門2 cm，以醫(yī)用膠布將導(dǎo)管與大鼠尾部固定。將大鼠置入透明有機(jī)玻璃固定盒中，蘇醒后適應(yīng)10 min，首次使用0.1 mL擴(kuò)張球囊10 s，間隔5 min后使用0.2 mL的球囊進(jìn)行擴(kuò)張(以后容積每次增加0.1 mL)。使用放置在腹部肌肉的同心圓電極記錄信號(hào)，以BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)收集并分析信號(hào)。

3.免疫熒光法：L6S1的DRG取材后置于4%多聚甲醛液，4 ℃過夜，包埋，切片，固定組織。置于1% Triton X-100中浸泡2 h，以3%過氧化氫消除內(nèi)源性過氧化酶15 min。PBS洗滌，封閉。加入購自Abcam公司的兔抗TRPV1(工作濃度為1∶200)、鼠抗VGLUT2(工作濃度為1∶1 000)和兔抗VGLUT3(工作濃度為1∶200)4 ℃孵育過夜；加入購自Abcam公司的熒光標(biāo)記的二抗羊抗兔(工作濃度為1∶2 000)和羊抗鼠(工作濃度為1∶2 000)37 ℃孵育30 min。DAPI封片后于激光共聚焦顯微鏡下采集圖像并行定量檢測(cè)分析。

為觀察L6S1 DRG中TRPV1與VGLUT2/3的相關(guān)性，6只大鼠行CRD前15 min神經(jīng)鞘內(nèi)預(yù)注射TRPV1拮抗劑SB366791(100 μmol/L，美國(guó)Selleck公司)，6只大鼠注射0.9%NaCl溶液作為對(duì)照組，觀察兩者的熒光活性。

4.蛋白質(zhì)印跡法：將大鼠麻醉后處死，快速分離L6S1段脊髓，-80 ℃保存。取各組組織，提取蛋白質(zhì)，調(diào)整各樣本蛋白總量，行10% SDS-PAGE電泳，分離蛋白后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h，加入兔抗TRPV1(工作濃度為1∶500)、鼠抗VGLUT2(工作濃度為1∶1 000)、兔抗VGLUT3(工作濃度為1∶500)、β-actin(工作濃度為1∶1 500)(均購自英國(guó)Abcam公司)4 ℃孵育過夜，TBST洗滌，再分別與HRP標(biāo)記的羊抗鼠和羊抗兔二抗(工作濃度為1∶1 000)室溫避光孵育1 h，染色條帶曝光顯影，以目的條帶與β-actin的比值作為目的蛋白的表達(dá)。

5.16S rDNA序列分析：大鼠新鮮糞便采用QIAamp快速DNA糞便試劑盒(Qiagen)分離微生物基因組DNA，對(duì)DNA的16S V3～V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。正向引物：5’-ACT CCT ACG GGR SGC AGC AG-3’，反向引物：3’-GGA CTA CVV GGG TAT CTA ATC-5’。以稀釋后的基因組DNA為模板，使用KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR試劑盒(羅氏公司)高保真酶進(jìn)行PCR，確保擴(kuò)增的準(zhǔn)確性和高效性。使用Illumina HiSeq 2500進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、內(nèi)臟敏感性

擴(kuò)張容積為0.1、0.4 mL時(shí)，各組間EMG相比無明顯差異(P>0.05)。擴(kuò)張容積為0.2、0.3 mL時(shí)，WAS組EMG均顯著高于對(duì)照組(P=0.000；P=0.004)，利福昔明組又顯著低于WAS組(P=0.015；P=0.005；圖1、表1)。

二、TRPV1和VGLUT2/3免疫活性

免疫熒光法顯示，與對(duì)照組相比，WAS組大鼠L6S1 DRG中TRPV1和VGLUT2/3免疫活性信號(hào)明顯增強(qiáng)(P=0.03;P=0.013;P=0.01)；與WAS組相比，利福昔明能明顯減少TRPV1和VGLUT2/3的免疫活性信號(hào)(P=0.006;P=0.007;P=0.018；圖2、表2)。

以TRPV1拮抗劑預(yù)處理后，大鼠L6S1 DRG中VGLUT2/3免疫活性明顯降低(VGLUT2: 191.33±29.12對(duì)132.72±13.04,P=0.014; VGLUT3: 46.78±12.68對(duì)27.22±5.94,P=0.025；圖3)。

三、TRPV1和VGLUT2/3蛋白表達(dá)

蛋白質(zhì)印跡法顯示，與對(duì)照組相比，WAS組L6S1段脊髓中TRPV1和VGLUT2/3蛋白表達(dá)明顯增加(P=0.02;P=0.02;P=0.02)。與WAS組相比，利福昔明組TRPV1和VGLUT2/3蛋白表達(dá)明顯減少(P=0.02;P=0.04;P=0.03；表3、圖4)。

四、腸道菌群分析

利福昔明組、WAS組和對(duì)照組大鼠腸道菌群的主要類型分別為Spirochaetaies、Bacillales和Anaero-truncus(圖5A)。在屬水平上，Treponema、Alistipes、Bifidobacterium、Anaerotruncus和Gemella對(duì)三組大鼠腸道菌群的影響較大。與對(duì)照組相比，WAS組和利福昔明組在屬水平上Treponema和Alistipes的相對(duì)豐度明顯下降(P<0.05；圖5B)。Alpha多樣性分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，WAS組Shannon指數(shù)明顯降低(4.28±0.38對(duì)6.19±0.35,P=0.002 7)；利福昔明組顯著高于WAS組(5.99±0.29對(duì)4.28±0.38,P=0.001)。

圖1 各組CRD后內(nèi)臟運(yùn)動(dòng)反射的肌電活性

表1 各組大鼠CRD后內(nèi)臟運(yùn)動(dòng)反射的肌電活性

*與對(duì)照組比較，P<0.05；#與WAS組比較，P<0.05

圖2 各組大鼠L6S1 DRG中TRPV1和VGLUT2/3的免疫熒光活性

圖3 TRPV1受體拮抗劑對(duì)大鼠L6S1 DRG中TRPV1和VGLUT2/3免疫熒光活性的影響

表2 各組大鼠TRPV1和VGLUT2/3免疫活性

*與對(duì)照組比較，P<0.05；#與WAS組比較，P<0.05

表3 各組大鼠TRPV1和VGLUT2/3蛋白表達(dá)

*與對(duì)照組比較，P<0.05；#與WAS組比較，P<0.05

*P<0.05

討 論

腸道菌群在大鼠內(nèi)臟痛覺過敏中起有關(guān)鍵作用，本研究結(jié)果表明慢性WAS誘導(dǎo)的腸道菌群紊亂會(huì)導(dǎo)致周圍和中樞神經(jīng)元TRPV1-VGLUT2/3通路激活，從而導(dǎo)致內(nèi)臟痛覺過敏，抗菌藥物利福昔明能改善WAS所致的大鼠內(nèi)臟高敏感。

腹痛是IBS患者常見的癥狀之一，內(nèi)臟痛覺過敏是引起腹痛的重要因素之一，可引起從腸道到大腦的信號(hào)被夸大。本研究中，當(dāng)擴(kuò)張容積分別為0.2 mL和0.3 mL時(shí)，WAS組的肌電活動(dòng)較對(duì)照組明顯增加，給予利福昔明后可明顯降低應(yīng)激引起的肌電活動(dòng)。說明即使輕度刺激也能引起WAS大鼠內(nèi)臟痛覺，利福昔明主要作用是能提高引起WAS的痛覺閾值。但當(dāng)擴(kuò)張容積超過0.4 mL時(shí)，各組間肌電活性無明顯差異。

腸道菌群是一個(gè)龐大的生態(tài)系統(tǒng)，在人體中發(fā)揮多種功能。研究表明腸道菌群在調(diào)節(jié)腸道功能中起有重要作用，IBS患者與健康組腸道菌群存在顯著差異[7]。近年研究表明益生菌對(duì)IBS患者有一定的療效[8-9]。利福昔明已被FDA批準(zhǔn)用于IBS的治療，可有效改善腹痛[4,10]。本研究中，與對(duì)照組相比，WAS組和利福昔明組在屬水平上Treponema和Alistipes菌的相對(duì)豐度明顯下降。利福昔明對(duì)應(yīng)激大鼠腸道菌群相對(duì)豐度的作用還應(yīng)增加樣本數(shù)行進(jìn)一步研究證實(shí)。

細(xì)菌可通過不同的機(jī)制在痛覺感受器神經(jīng)元中觸發(fā)鈣通道和動(dòng)作電位。羅伊桿菌(DSM 17938)可降低辣椒素和空腸脊髓神經(jīng)動(dòng)作電位擴(kuò)張誘發(fā)的激發(fā)反應(yīng)，其中80%的反應(yīng)被TRPV1通道拮抗劑所阻斷[11]。腸道菌群紊亂會(huì)改變結(jié)腸初級(jí)傳入神經(jīng)元中的神經(jīng)遞質(zhì)，從而導(dǎo)致內(nèi)臟直覺的改變。有研究發(fā)現(xiàn)，TRPV1是新霉素的靶點(diǎn)，腹腔內(nèi)新霉素給藥可抑制內(nèi)臟痛覺[12]。VGLUT2主要在痛覺初級(jí)傳入神經(jīng)元中起主導(dǎo)作用[13]。在神經(jīng)元末梢中VGLUT3能將胞質(zhì)中的神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸逆濃度轉(zhuǎn)運(yùn)至囊泡。在DRG中，TRPV1和VGLUT3陽性神經(jīng)元均為C-和Aδ-類纖維。在DRG、脊髓以及大腦黑質(zhì)、海馬中，辣椒素能增加突觸前Ca2+釋放，增強(qiáng)突觸前TRPV1的活性和谷氨酸的釋放[14-15]。研究顯示，VGLUT3可能與機(jī)械和內(nèi)臟痛覺過敏密切相關(guān)[6]。研究還表明，VGLUT2在TRPV1熱痛覺過敏中發(fā)揮重要作用[14]。本研究結(jié)果顯示，WAS大鼠TRPV1和VGLUT2/3表達(dá)顯著增加，而利福昔明可抑制其升高。給予TRPV1拮抗劑后，大鼠外周神經(jīng)元VGLUT2/3顯著降低。因此，推測(cè)腸道菌群失衡可激活TRPV1通道，從而誘導(dǎo)VGLUT2/3釋放神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸，導(dǎo)致大鼠內(nèi)臟痛覺過敏。

圖5 各組腸道菌群差異分析

總之，利福昔明可能是通過腸道菌群和TRPV1-VGLUT2/3通道來改善大鼠內(nèi)臟高敏感，但該研究結(jié)論仍需行進(jìn)一步研究證實(shí)。