湯海濤,閆繼慈,周曉琳

(遼寧省人民醫(yī)院,沈陽 110015)

胰腺癌(PC)是一種常見的侵襲性惡性腫瘤，是腫瘤相關(guān)死亡的主要原因之一[1]。根據(jù)2018年發(fā)表的最新腫瘤統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)顯示，PC是全球腫瘤死亡的第七大原因，死亡人數(shù)為43萬左右，幾乎與病例數(shù)45萬相同[2]。由于缺乏有效可靠的早期檢測篩查方法，PC患者確診時已處于晚期，目前PC患者的治療效果不佳[3]，因此尋找PC的有效治療方法是改善患者預(yù)后的關(guān)鍵。遺傳學(xué)研究表明，癌基因的激活和腫瘤抑制基因的沉默在PC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[4，5]。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤內(nèi)含有一組細胞亞群，具有較強的自我更新和分化成異質(zhì)腫瘤的能力，這群細胞為腫瘤干細胞(CSCs)，與PC的惡性行為密切相關(guān)，CSCs是驅(qū)動腫瘤不斷生長的根源，成為腫瘤治療的一個難點[6]。乙二醛酶Ⅰ (GLO1) 是一種與甲基乙二醛(MG)降解功能相關(guān)的細胞保護關(guān)鍵酶，具有重要的腎臟保護作用，在肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌等常見的腫瘤中已觀察到GLO1高表達，并參與腫瘤的增殖、凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)功能[7～9]。而有研究報道GLO1在PC組織中呈高表達[10]，但GLO1在PC中是否具有生物學(xué)功能的研究尚未有報道，因此GLO1是否在PC細胞和CSCs的惡性行為調(diào)控中有重要作用有待探討。2017年1月～2018年12月，我們觀察了GLO1在PC細胞和CSCs中的表達，探討其對PC和CSCs增殖、侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 主要試劑：PrimeScriptTM RT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄和SYBR Premix Ex TaqTMqRT-PCR試劑盒等均購自日本TaKaRa公司；PC細胞系SW1990、PANC-1、BxPC3和人正常胰腺導(dǎo)管上皮細胞HPDE6-C7均購自美國ATCC細胞庫；L-15、DMEM、RPMI1640培養(yǎng)基和FBS均購自美國Gibco公司；GLO1引物由上海捷瑞生物有限公司設(shè)計合成；GLO1 siRNA購自上海生工公司；MTS購自美國Promega公司；Boyden基質(zhì)膠購自美國BD公司；RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白濃度檢測試劑盒均購自美國Thermo公司；Nanog抗體(ab109250)、OCT4抗體(ab19857)、SOX2抗體(ab97959)、GAPDH抗體(ab181602)均購自英國Abcam公司。

1.2 細胞培養(yǎng)、PC CSCs的分選與鑒定 L-15+10%FBS培養(yǎng)SW1990細胞，DMEM+10%FBS培養(yǎng)PANC-1、HPDE6-C7細胞，RPMI-1640+10%FBS培養(yǎng)BxPC3細胞，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2。將PANC-1細胞培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)出的腫瘤球制成單個細胞后，與小鼠抗人CD133抗體包被的磁珠孵育，分選出CD133陽性的細胞，并在無血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。采用流式細胞儀檢測CSCs中CD133陽性細胞率為94.11%。Western blotting法檢測干性標志分子Nanog、OCT4和SOX2在CD133細胞中的表達。

1.3 GLO1 mRNA在PC細胞系和人正常胰腺導(dǎo)管上皮細胞HPDE6-C7中的表達檢測 采用qRT-PCR法。PC細胞系和人正常胰腺導(dǎo)管上皮細胞HPDE6-C7細胞PBS洗2次完全去除后，加入TRIzol裂解液，冰上完全裂解10 min，將上清移至新的EP管中，加入氯仿完全混合后靜置5 min，12 000 r/min、4 ℃離心30 min，將上層水相溶液與等體積的異丙醇混勻，12 000 r/min、4 ℃離心15 min，棄掉液體后用無水乙醇洗滌2次沉淀，加入DEPC水溶解RNA，并將其逆轉(zhuǎn)為cDNA。GLO1正向引物:5′- AGCAGACCATGCTACGAGTGA-3′，反向引物：5′-GAGAGCGCCCAGGCTATTT-3′，GAPDH正向引物:5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′，反向引物：5′-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3′，以cDNA為模板按照說明書進行qRT-PCR操作。以GAPDH作為內(nèi)參，分析各樣品的循環(huán)閾值(Ct)， 采用2-ΔΔCt法分析實驗數(shù)據(jù)。

1.4 GLO1蛋白在PC細胞系和人正常胰腺導(dǎo)管上皮細胞HPDE6-C7中的表達檢測 采用Western blotting法。細胞PBS洗2次完全去除后，加入蛋白RIPA裂解液，冰上完全裂解10 min后，將裂解液轉(zhuǎn)至EP管中，4 ℃、12 000 r/min離心30 min，上清液為蛋白裂解液，BCA檢測試劑盒檢測蛋白濃度后煮沸變性，以50 μg蛋白的質(zhì)量上樣，SDS-PAGE電泳進行蛋白分離，濕轉(zhuǎn)，5%脫脂牛奶在室溫封閉1 h，按抗體說明書進行一抗的稀釋，并4 ℃孵育過夜，TBST洗3次后，室溫孵育二抗1 h，采用ECL化學(xué)發(fā)光法曝光條帶。

1.5 細胞轉(zhuǎn)染及GLO1 mRNA表達檢測 將呈對數(shù)生長期時的PANC-1細胞、CSCs細胞胰酶消化后鋪至6孔板中，分為si-NC組和si-GLO1組，按照說明書將si-NC和GL01 siRNA轉(zhuǎn)染試劑與脂質(zhì)體2000混合后轉(zhuǎn)染至對應(yīng)組別的細胞中，放至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。qRT-PCR法檢測GLO1 mRNA在si-NC組和si-GLO1組中的表達。

1.6 細胞增殖能力檢測 采用MTS實驗。細胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集細胞進行計數(shù)，以每孔1 500個細胞接種于含150 μL培養(yǎng)基的96孔板中培養(yǎng)，設(shè)置6個復(fù)孔，在細胞貼壁第0、24、48、72和96 h時每孔加入30 μL MTS試劑，37 ℃細胞培養(yǎng)箱中孵育2 h后采用酶標儀檢測各孔490 nm處的光密度(OD)值，以時間為橫座標，OD值為縱坐標，繪制細胞存活曲線。

1.7 細胞侵襲能力檢測 采用Boyden實驗法。細胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集兩組細胞無血清培養(yǎng)基洗3次后進行計數(shù)，以每孔1×105個細胞制成100 μL無血清培養(yǎng)基的細胞懸液，接種于含有Boyden基質(zhì)膠的Transwell小室上室聚碳酸酯微孔膜的上室面，下室加入500 μL完全培養(yǎng)基作為趨化因子，放至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，顯微鏡下觀察細胞穿至下室超過10個時終止培養(yǎng)，PBS將上室面的細胞洗掉后中性甲醛固定10 min，蘇木素染色，晾干后取出聚碳酸酯微孔膜。顯微鏡下隨機計數(shù)3個視野膜上的細胞數(shù)目，取其均值代表細胞轉(zhuǎn)移能力。

1.8 PI3K/AKT信號通路關(guān)鍵蛋白的檢測 采用Western blotting法。細胞PBS洗2次完全去除后，加入蛋白RIPA裂解液，冰上完全裂解10 min后，將裂解液轉(zhuǎn)至EP管中，4 ℃、12 000 r/min離心30 min，上清液為蛋白裂解液，BCA檢測試劑盒檢測蛋白濃度后煮沸變性，以50 μg蛋白的質(zhì)量上樣，SDS-PAGE電泳進行蛋白分離，濕轉(zhuǎn)，5%脫脂牛奶在室溫封閉1 h，按抗體說明書進行pPI3K和p-AKT一抗的稀釋，并4 ℃孵育過夜，TBST洗3次后，室溫孵育二抗1 h，采用ECL化學(xué)發(fā)光法曝光條帶。

2 結(jié)果

2.1 PC CSCs的鑒定 Western blotting檢測結(jié)果顯示，干性標志分子Nanog、OCT4和SOX2在CD133陽性細胞中的相對表達量分別為5.24±0.29、3.99±0.25、7.62±0.98，在CD133陰性細胞中的相對表達量分別為1.01±0.02、1.04±0.05、1.05±0.03，Nanog、OCT4和SOX2在CD133陽性細胞中的表達高于在CD133陰性細胞中的表達(P均<0.05)。

2.2 GLO1在PC細胞系和人正常胰腺導(dǎo)管上皮細胞HPDE6-C7中的表達 qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，GLO1 mRNA在PC細胞系SW1990、PANC-1、BxPC3和HPDE6-C7中的相對表達量分別為2.13±1.22、11.30±0.93、8.27±0.95、1.00±0.05，GLO1 mRNA在PC細胞系SW1990、PANC-1、BxPC3中的表達均高于在人正常胰腺導(dǎo)管上皮細胞HPDE6-C7中的表達(P均<0.05)，其中在PANC-1中的表達最高。Western blotting檢測結(jié)果顯示，GLO1蛋白在PC細胞系SW1990、PANC-1、BxPC3和HPDE6-C7中的相對表達量分別為2.98±0.19、14.32±1.37、9.01±2.10、1.00±0.01，GLO1蛋白在PC細胞系SW1990、PANC-1、BxPC3中的表達均高于人正常胰腺導(dǎo)管上皮細胞HPDE6-C7中的表達(P均<0.05)，其中在PANC-1中的表達最高。

2.3 si-NC組和si-GLO1組中GLO1 mRNA表達比較 PANC-1細胞中，GLO1 mRNA在si-NC組和si-GLO1組的表達量分別為1.00±0.00、0.22±0.03，GLO1 mRNA在si-GLO1組中的表達低于在si-NC中的表達(t=28.63，P=0.000)。CSCs細胞中，GLO1 mRNA在CSCs(CD133陽性)、PANC-1(CD133陰性)中的表達量分別為8.67±1.01、1.00±0.05，二者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=24.61，P=0.000)。PC CSCs細胞中，GLO1 mRNA在si-NC組、si-GLO1組的相對表達量分別為1.01±0.02、0.31±0.11，GLO1 mRNA在si-GLO1組中的表達低于si-NC組中(t=17.35，P=0.001)，

2.4 GLO1 siRNA對PC細胞PANC-1增殖的影響 si-NC組0、24、48、72、96 h時OD值分別為0.36±0.04、0.53±0.06、0.68±0.12、0.99±0.11、1.28±0.14，si-GLO1組0、24、48、72、96 h時OD值分別為0.36±0.04、0.40±0.14、0.50±0.13、0.59±0.11、0.69±0.15，與si-NC組相比，48、72和96 h時si-GLO1組細胞增殖能力減慢(P<0.05)。

2.5 GLO1 siRNA對PC細胞PANC-1侵襲能力的影響 GLO1 siRNA轉(zhuǎn)染PANC-1細胞后，si-NC和si-GLO1組細胞穿膜數(shù)分別為(85.94±18.97)、(51.03±12.38)個。si-GLO1組細胞侵襲能力低于si-NC組(P<0.05)。

2.6 GLO1 siRNA對PC CSCs細胞增殖的影響 si-NC組0、24、48、72、96 h時OD值分別為0.29±0.03、0.50±0.07、0.71±0.11、1.02±0.10、1.32±0.13，si-GLO1組分別為0.29±0.04、0.37±0.08、0.47±0.07、0.59±0.12、0.67±0.10，48、72、96 h時OD值比較，P<0.05。GLO1 siRNA轉(zhuǎn)染CSCs后，與si-NC組相比，si-GLO1組細胞增殖能力減慢(P<0.05)。

2.7 GLO1 siRNA對PC CSCs侵襲能力的影響 GLO1 siRNA轉(zhuǎn)染CSCs后，si-NC組和si-GLO1組細胞穿膜數(shù)分別為(53.28±11.35)、(36.21±9.21)個。si-GLO1組細胞侵襲能力低于si-NC組(P<0.05)。

2.8 沉默GLO1 siRNA對PI3K/AKT信號通路的影響 在PANC-1細胞中，si-NC組、si-GLO1組pPI3K蛋白相對表達量分別為1.00±0.01、7.98±1.24，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=15.67,P=0.021);pAKT蛋白相對表達量分別為1.00±1.00、14.35±2.04，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=23.98,P=0.007)。在CSCs細胞中，si-NC組、si-GLO1組pPI3K蛋白相對表達量分別為1.00±0.00、11.04±2.57，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=19.54,P=0.011)；pAKT蛋白相對表達量分別為1.00±0.05、19.87±3.04，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=32.05,P=0.001)。

3 討論

目前PC的發(fā)病機制尚未完全明確，從分子水平研究PC發(fā)生發(fā)展的機制是尋找PC治療方法的新途徑。已有研究報道PC中存在潛在的藥物靶點，GPR68又稱卵巢癌G蛋白偶聯(lián)受體1，在包括PC的多種惡性腫瘤中表達上調(diào)，調(diào)控多種信號通路，密切參與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，是治療腫瘤的潛在新型治療靶點，開發(fā)靶向GPR68的藥物具有較好應(yīng)用前景[11]。密蛋白CLDN7在PC組織和細胞系中高表達，敲除PC細胞中CLDN7的表達可誘導(dǎo)細胞周期阻滯于G1期，并能降低細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2的去磷酸化，最終導(dǎo)致細胞增殖抑制，可作為用于治療PC的新型分子靶標[12]。

GLO1基因位于6p21,3-6p21,2，具有核苷酸多態(tài)性，其核苷酸位置332(rs4746)處的單核苷酸多態(tài)性使其mRNA外顯子4中的腺苷/胞嘧啶交換，導(dǎo)致處于氨基酸蛋白質(zhì)序列第111位的Ala變?yōu)镚lu[13]。GLO1屬于氧化還原系統(tǒng)酶，是一種谷胱甘肽依賴性酶，廣泛表達于各種組織中，同時是GLO1糖酵解副產(chǎn)物甲基乙二醛(MGO)代謝過程中的關(guān)鍵限速酶，GLO1在限制MGO的細胞內(nèi)積累和細胞毒性方面起關(guān)鍵的細胞保護作用，GLO1表達異常會導(dǎo)致MGO的代謝平衡失調(diào)，進而引起二羰基應(yīng)激產(chǎn)生晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)，而AGES修飾蛋白的累積導(dǎo)致肥胖、心血管及糖尿病等與年齡相關(guān)的疾病[14]。研究發(fā)現(xiàn)，AGEs可導(dǎo)致自由基和活性氧的產(chǎn)生，而自由基和活性氧與腫瘤的發(fā)生和惡性進展密切相關(guān)[15]，此外，GLO1被報道在多種腫瘤中表達增加[7～9]，Jandial等[16]報道，采用shRNA靶向抑制多形性膠質(zhì)母細胞瘤細胞中GLO1的表達，可致AGEs免疫球蛋白樣受體的表達顯著升高，引起腫瘤細胞凋亡，抑制GLO1可能在最具攻擊性且難以治療的神經(jīng)惡性腫瘤治療中有潛在價值。本研究結(jié)果顯示，與鄰近的癌旁組織相比，GLO1在PC組織中呈高表達。而GLO1在PC中發(fā)揮的作用及相關(guān)機制卻鮮有報道。

我們采用qRT-PCR方法檢測GLO1 mRNA在PC細胞系中的表達，結(jié)果顯示GLO1 mRNA在PC細胞系SW1990、PANC-1、BxPC3中的表達均高于在人正常胰腺導(dǎo)管上皮細胞HPDE6-C7中的表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，同時我們采用Western blotting法檢測GLO1 蛋白在PC細胞系中的表達，結(jié)果同樣顯示GLO1 蛋白在SW1990、PANC-1、BxPC3中的表達均顯著高于HPDE6-C7中，GLO1在PC中表達上調(diào)，表明GLO1可能為促癌基因。而對于GLO1是否具有促癌基因功能的研究，我們選擇qRT-PCR和Western blotting法檢測，結(jié)果均顯示PC細胞系中GLO1表達最高的PC細胞PANC-1作為工具細胞，采用小干擾RNA(siRNA)技術(shù)轉(zhuǎn)染PANC-1細胞，干擾細胞中GLO1表達后觀察細胞的增殖和侵襲能力，MTS實驗及Boyden實驗結(jié)果顯示，干擾GLO1的表達，PANC-1細胞的增殖和侵襲能力均顯著降低，表明GLO1具有生物學(xué)功能?？焖僭鲋?、高侵襲轉(zhuǎn)移和對化療藥物的耐藥性是PC患者死亡的重要原因[17]，而研究表明,腫瘤增殖、侵襲轉(zhuǎn)移和耐藥等惡性表型與腫瘤中存在的細胞亞群CSCs密切相關(guān)[6]，CSCs具有較強的自我更新和分化為異質(zhì)腫瘤的能力，越來越多的證據(jù)表明，PC中同樣存在CSCs，且可作為治療PC的藥物靶點，Ma等[18]報道，α-Mangostin可通過抑制細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力而靶向抑制PC CSCs，有效治療PC。此外，Tamori等[19]發(fā)現(xiàn)，GLO1對ALDH1陽性的乳腺癌干細胞存活至關(guān)重要，是治療基底樣乳腺癌的潛在治療靶點，在PC中GLO1是否可以靶向CSCs作為潛在治療靶點尚有待進一步研究。

CSCs屬于腫瘤細胞中的一小部分側(cè)群，需一定的技術(shù)手段將其分離出，目前CSCs的分離方法主要為無血清懸浮培養(yǎng)和基于CSCs表面免疫學(xué)分子分選。無血清懸浮培養(yǎng)可將自我更新能力較強的細胞分離出，而PC中CSCs表面會表達CD133的免疫學(xué)分子[18]，本研究結(jié)合兩種方法從PC細胞系PANC-1篩選出94.11%的CD133陽性細胞，采用Western blotting檢測CD133陽性細胞中干性標志蛋白Nanog、OCT4和SOX2的表達顯著升高，表明CD133陽性細胞為CSCs。而qRT-PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GLO1 mRNA在CSCs中的表達顯著高于PC細胞PANC-1中，提示GLO1在CSCs中可能具有重要的生物學(xué)功能，同樣采用siRNA干擾CSCs中GLO1表達后，MTS實驗及Boyden實驗結(jié)果顯示，抑制GLO1基因表達后CSCs增殖和侵襲能力均下降，CSCs的生物學(xué)特性受抑?？梢姼蓴_GLO1表達能抑制PC細胞和CSCs的增殖和侵襲，但具體的作用機制仍需進一步研究。研究報道，調(diào)控腫瘤增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的部分經(jīng)典信號通路在調(diào)控CSCs生物學(xué)特性中同樣發(fā)揮重要作用[20]，其中PI3K/AKT信號通路在調(diào)控PC細胞惡性生物學(xué)行為方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn)，干擾GLO1表達后細胞中pPI3K和p-AKT促癌蛋白表達受抑。表明GLO1可能通過激活PI3K/AKT信號通路促進PC細胞和CSCs的增殖和侵襲。

綜上所述，GLO1在PC細胞系和CSCs中呈高表達，GLO1可能通過抑制PI3K/AKT信號通路抑制PC細胞和CSCs的增殖與侵襲，GLO1有望作為治療PC的候選靶點。