鄧君健，張帆，包文婷，熊琳，劉遠(yuǎn)識(shí)，范黎，徐細(xì)明

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院，武漢430060)

結(jié)直腸癌(CRC)是臨床常見的腫瘤之一，其發(fā)病率居世界第三，而病死率居世界第四[1～4]。隨著年齡增大，CRC的發(fā)病危險(xiǎn)系數(shù)逐漸升高，全世界每年約有120萬(wàn)新發(fā)病例，同時(shí)每年約有60萬(wàn)患者死于CRC。約20%的CRC患者有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移的臟器往往是肝臟。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是癌細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的始動(dòng)因素及基礎(chǔ)環(huán)節(jié)，EMT發(fā)生時(shí)，腫瘤細(xì)胞中的部分胚胎基因重編程，該過程可逆[5～8]。EMT的標(biāo)志是上皮細(xì)胞間連接的溶解及細(xì)胞骨架的整體重組，從而導(dǎo)致上皮特征的喪失和間充質(zhì)形態(tài)的獲得，這一變化由基因差異表達(dá)決定[9，10]。當(dāng)前CRC的治療主要是手術(shù)切除及放化療，但伴隨放化療抵抗問題。腫瘤細(xì)胞EMT發(fā)生時(shí)，眾多EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子如ZEB1、ZEB2、TWIST、SNAIL的蛋白表達(dá)或活性急劇變化，調(diào)控下游系列基因簇的表達(dá)，與患者的預(yù)后相關(guān)[11]。EMT在增強(qiáng)細(xì)胞侵襲能力的同時(shí)，其相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子如SNAIL，還可促使癌細(xì)胞獲得腫瘤干細(xì)胞的特性，從而獲得放化療抵抗能力[12,13]。扭曲因子Twist是一種具有堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，可通過上調(diào)胚胎基因表達(dá)，介導(dǎo)胚胎的發(fā)育[14]。既往研究證實(shí)，Twist可促使腫瘤細(xì)胞部分基因簇重編程，從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的EMT行為[15]，然而其在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的更多作用，目前尚不清楚。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，Twist在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織。2014年2月～2018年5月，我們以結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116為研究對(duì)象，分析Twist對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞EMT及干細(xì)胞表型、化療抵抗的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 E-cadherin一抗購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，N-cadherin一抗、vimentin一抗、Twist一抗、P-gp一抗、α-tubulin一抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnol公司。Bmi-1一抗、Nanog一抗購(gòu)自美國(guó)Epitomics公司。Alexa Fluor 488/594標(biāo)記的二抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗、DAPI染液及Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。PrimeScript一步法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RT及熒光定量PCR SYBR染液購(gòu)自日本TAKARA公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組 研究所用的人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞購(gòu)自上海中科院細(xì)胞典藏中心，培養(yǎng)條件：37 ℃、5%CO2，培養(yǎng)基為McCoy′5a，10%胎牛血清，抗生素。本研究所有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為兩組：空載體組及Twist過表達(dá)組(Twist組)。轉(zhuǎn)染前，將細(xì)胞HCT116種至6孔板中，次日將10%的培養(yǎng)基換為無(wú)血清培養(yǎng)基，2 h后，空載體組及Twist過表達(dá)組分別將2 μg的空載體pcDNA3.1或pcDNA3.1-Twist載體(采用脂質(zhì)體2000包裹轉(zhuǎn)染)，轉(zhuǎn)染至HCT116細(xì)胞。并在轉(zhuǎn)染6 h后，將培養(yǎng)基換為含10%胎牛血清不含抗生素的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收取細(xì)胞。

1.3 扭曲基因Twis對(duì)HCT116細(xì)胞的侵襲能力的影響檢測(cè) 采用博伊登小室進(jìn)行分析，預(yù)先包被基質(zhì)膠于小室內(nèi)，隨后種植細(xì)胞，細(xì)胞體積和數(shù)量分別為300 μL、1×105個(gè)細(xì)胞，小室上下培養(yǎng)基不同，上層為1%胎牛血清，此層進(jìn)行pcDNA3.1或pcDNA3.1-Twist載體轉(zhuǎn)染，下層為10%胎牛血清，此層培養(yǎng)基作為趨化劑，誘導(dǎo)細(xì)胞侵襲。細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，終止培養(yǎng)。以棉花拭子去除包被的基質(zhì)膠，加入PBS洗滌，隨后以濃度為4%的多聚甲醛固定30 min，加入結(jié)晶紫染色，拍照分析。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.4 Twis對(duì)HCT116細(xì)胞EMT影響檢測(cè) ①Western blotting法。培養(yǎng)的細(xì)胞以預(yù)冷的PBS洗滌3次，于冰上加入碧云天公司弱型RIPA裂解液進(jìn)行細(xì)胞裂解，反復(fù)吹打至細(xì)胞脫落，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移EP管中，隨后冰上超聲破碎細(xì)胞，繼續(xù)裂解30 min。將樣品于4 ℃低溫離心機(jī)中，12 000 r/min離心15 min，隨后吸取上清，測(cè)定空載體組及Twist組蛋白濃度，加入Loading buffer 100 ℃煮至蛋白變性，迅速降溫，置于-80 ℃冰箱低溫保存，直至使用。蛋白表達(dá)差異檢測(cè)，采用Bio-rad公司的蛋白電泳系統(tǒng)，程序如下：SDS-PAGE膠蛋白電泳完畢后，將蛋白電轉(zhuǎn)至 PVDF膜，再以濃度為5%的脫脂牛奶在室溫下封閉2 h。以TBST洗滌PVDF膜后，加入E-鈣黏蛋白，波形蛋白vimentin一抗工作液過夜(濃度為1∶1 000)。次日，于室溫下復(fù)溫1 h，再次以TBST洗脫，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗工作液進(jìn)行孵育(濃度為1∶10 000)，再依次洗滌，曝光，拍照并分析。②免疫熒光法。培養(yǎng)的細(xì)胞以預(yù)冷的PBS洗滌3次，加入4%多聚甲醛固定10 min，0.1%的Triton100打孔20 min。隨后加入E-鈣黏蛋白，波形蛋白vimentin一抗工作液過夜(濃度為1∶100)，4 ℃孵育過夜，次日加入熒光二抗工作液(1∶500)，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌后拍照分析。

1.5 腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物蛋白表達(dá)檢測(cè) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，通過光鏡觀測(cè)細(xì)胞形態(tài)變化，采用Western blotting法檢測(cè)兩組腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物Bmi-1、Nanog、CD44表達(dá)。

1.6 細(xì)胞活力檢測(cè) 將細(xì)胞種植于96孔板中，細(xì)胞密度為1×104，空載體組與Twist組分別進(jìn)行空載體pcDNA3.1或Twist載體轉(zhuǎn)染，細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后分別加入抗腫瘤藥物奧沙利鉑刺激，奧沙利鉑設(shè)置0～10 μmol/L的梯度濃度。測(cè)試之前，以PBS洗滌細(xì)胞，隨后加入MTT試劑，37 ℃孵育4 h，隨后去除孵育試劑，置換為DMSO溶液，于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定細(xì)胞活力。

1.7 P-gp蛋白表達(dá)檢測(cè) HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1、Twist過表達(dá)質(zhì)粒48 h后，采用 Western blotting法檢測(cè)P-gp蛋白表達(dá)。

1.8 化療抵抗相關(guān)分子ABCB1、ABCC1、ABCC2、ABCC3、ABCC4、ABCC5、ABCG2、ERCC1、XRCC1、MSH2、TUBB3、POLH、GSTπ、γ-GT1蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用酚氯仿法萃取提取化療抵抗相關(guān)分子RNA。向細(xì)胞培養(yǎng)板中加入TRIzol，反復(fù)吹打，吸取至EP管，室溫靜置10 min后，加入氯仿萃取，TRIzol∶氯仿=5∶1。再次室溫靜置15 min，4 ℃低溫下，12 000 r/min離心15 min，隨后小心吸出上層水相，加入等體積的異丙醇沉淀RNA，混勻后4 ℃低溫過夜。次日4 ℃低溫下，12 000 r/min離心10 min，獲得RNA，再依次以75%、95%乙醇洗滌RNA沉淀，隨后加入DEPC水溶解RNA。采用日本TAKARA公司的一步法逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成試劑盒合成cDNA。每次反應(yīng)采用的RNA為1 μg、20 μL體系。PCR反應(yīng)程序：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，降溫至4 ℃。待反應(yīng)完成，立即將樣本取出，并置于-80 ℃冰箱保存。采用TAKARA公司的熒光定量PCR Mix Buffer進(jìn)行定量擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min，隨后進(jìn)行39個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，包括95 ℃ 1 min，58 ℃ 30 s，最后5 min溶解曲線。PCR結(jié)果采用GAPDH校正，以校正值為統(tǒng)計(jì)值。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞侵襲能力比較 Twist組HCT116細(xì)胞的形態(tài)由圓形向長(zhǎng)梭形態(tài)分化，空載體組與Twist組HCT116細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(6.24±0.89)、(26.83±1.02)個(gè)/HP,兩組比較，P<0.05。

2.2 兩組E-鈣黏蛋白、波形蛋白表達(dá)比較 空載體組與Twist組EMT相關(guān)分子蛋白E-鈣黏蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.82±0.09、0.24±0.04，波形蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.12±0.02、1.05±0.12，兩組E-鈣黏蛋白、波形蛋白表達(dá)比較，P均<0.05。

2.3 兩組細(xì)胞向腫瘤干細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化情況比較 過表達(dá)Twist可顯著上調(diào)HCT116細(xì)胞成球能力，空載體組與Twist組HCT116細(xì)胞成球數(shù)量分別為(2.43±0.14)、(10.19±0.58)個(gè)/HP，兩組比較，P<0.05。熒光定量PCR及Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，Twist可促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物Bmi-1、Nanog、CD44表達(dá)，空載體組與Twist組干細(xì)胞相關(guān)分子Nanog相對(duì)表達(dá)量分別為0.06±0.01、0.88±0.07，Bmi1相對(duì)表達(dá)量分別為0.23±0.04、1.26±0.88，CD44相對(duì)表達(dá)量分別為1.45±0.09、8.92±0.89，兩組Nanog、Bmi1、CD44表達(dá)比較，P均<0.05。

2.4 兩組細(xì)胞對(duì)化療藥物的抵抗能力及P-gp蛋白表達(dá)比較 上調(diào)Twist可顯著抑制化療藥物奧沙利鉑對(duì)HCT116細(xì)胞的殺傷作用，在高濃度藥物情況下，產(chǎn)生明顯抵抗。Twist可顯著上調(diào)ABCB1的表達(dá)，而對(duì)其余分子表達(dá)變化并無(wú)影響。Twist可顯著上調(diào)ABCB1基因的編碼產(chǎn)物P-gp蛋白表達(dá)。Twist組在奧沙利鉑濃度0、0.1、1、5、10 μmol/L刺激HCT116細(xì)胞后細(xì)胞活力分別為1.00±0.08、0.84±0.09、0.70±0.10、0.53±0.07、0.48±0.06，空載體組分別為1.00±0.07、0.76±0.08、0.58±0.05、0.27±0.04、0.08±0.04，奧沙利鉑各濃度刺激HCT116細(xì)胞后兩組細(xì)胞活力比較，P均<0.05。奧沙利鉑刺激HCT116細(xì)胞后，Twist組腫瘤化療抵抗相關(guān)的調(diào)控分子 ABCB1、ABCC1、ABCC2、ABCC3、ABCC4、ABCC5、ABCG2、ERCC1、XRCC1、MSH2、TUBB3、POLH、GSTπ、γ-GT1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為3.20±0.35、1.10±0.11、1.14±0.18、1.09±0.09、0.88±0.09、1.09±0.12、1.30±0.14、0.98±0.10、1.02±0.13、1.13±0.08、1.42±0.25、1.09±0.08、0.92±0.10、1.29±0.35，空載體組分別為1±0.10、1±0.14、1±0.13、1±0.15、1±0.09、1±0.12、1±0.11、1±0.15、1±0.14、1±0.13、1±0.15、1±0.09、1±0.15、1±0.17，兩組ABCB1表達(dá)比較，P<0.05。

3 討論

基因的異常激活是CRC獲得惡性表型的始動(dòng)因素之一，腫瘤細(xì)胞的EMT表型轉(zhuǎn)化是化療抵抗產(chǎn)生原因之一，而EMT相關(guān)的驅(qū)動(dòng)分子同時(shí)亦可促使腫瘤細(xì)胞向干細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化。腫瘤干細(xì)胞具有無(wú)限增殖、遭受打擊時(shí)保持休眠的特點(diǎn)，從而在放化療刺激下保證存活，并在適當(dāng)時(shí)機(jī)再次惡性增殖、轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致CRC的復(fù)發(fā)。然而當(dāng)前關(guān)于結(jié)直腸癌的治療措施仍是傳統(tǒng)手術(shù)切除及放化療，進(jìn)展緩慢，術(shù)后復(fù)發(fā)及放化療抵抗等遠(yuǎn)期不良預(yù)后仍較常見[19]。腫瘤細(xì)胞放化療抵抗是患者不良預(yù)后的主要原因，腫瘤細(xì)胞在遭受放化療的初次打擊后，部分細(xì)胞殘存下來(lái)，成為異質(zhì)細(xì)胞群，該群細(xì)胞具有增殖及侵襲能力、抗打擊能力強(qiáng)的特點(diǎn)。部分細(xì)胞獲得了腫瘤干細(xì)胞特性，腫瘤干細(xì)胞具有自我更新和無(wú)限增殖的能力，同時(shí)其轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)大，并可在損傷打擊下進(jìn)行休眠，從而逃避打擊[20,21]。

EMT是高度協(xié)調(diào)的動(dòng)態(tài)過程，以上皮細(xì)胞失去少部分或多數(shù)上皮特征并呈現(xiàn)間充質(zhì)表型為特點(diǎn)。上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化在胚胎發(fā)育過程中必不可少，EMT的產(chǎn)生可促使胚胎期細(xì)胞間黏附及極性喪失，從而獲得遷移和侵入能力。胚胎期細(xì)胞的EMT對(duì)機(jī)體的正常發(fā)育有積極作用，而成熟細(xì)胞EMT的異常激活則利于腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移，并獲得治療抵抗力。腫瘤細(xì)胞EMT及治療抵抗時(shí)，腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組重編程，眾多基因簇表達(dá)失衡[22]。通過過表達(dá)手段我們發(fā)現(xiàn)，扭曲基因Twist可促使HCT116細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮?，且上調(diào)其侵襲能力。Twist可顯著上調(diào)EMT相關(guān)標(biāo)志物vimentin表達(dá)，而抑制上皮相關(guān)的E-鈣黏蛋白表達(dá)，提示Twist可通過轉(zhuǎn)錄及翻譯層面調(diào)控CRC細(xì)胞的EMT變化，促使其侵襲并轉(zhuǎn)移至其他組織或器官。

腫瘤細(xì)胞EMT相關(guān)的部分轉(zhuǎn)錄因子snail、Twist可驅(qū)動(dòng)腫瘤干細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)，從而促使腫瘤細(xì)胞獲得干性[19]。干細(xì)胞具有體外培養(yǎng)時(shí)成球的特性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Twist可促使HCT116細(xì)胞成球并可上調(diào)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物Bmi-1、Nanog、CD44表達(dá)。腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT、干細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換時(shí)，其增殖及抗凋亡能力將顯著上調(diào)，我們的研究證實(shí)，過表達(dá)Twist的HCT116細(xì)胞在遭受奧沙利鉑打擊時(shí)，其活力相較對(duì)照細(xì)胞顯著上調(diào)。提示Twist在促使HCT116細(xì)胞EMT及干細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化之后，導(dǎo)致其對(duì)化療藥物的打擊失去了敏感性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Twist對(duì)HCT116細(xì)胞的化療抵抗調(diào)控作用是通過ABCB1/P-gp途徑實(shí)現(xiàn)的。既往研究表明，P-gp是能量依賴性“藥泵”調(diào)節(jié)分子，可通過消耗ATP將腫瘤細(xì)胞內(nèi)的化療藥物逆濃度泵至細(xì)胞外，從而降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)化療藥物濃度，促使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。

綜上所述，Twist可促使結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞發(fā)生EMT表型轉(zhuǎn)化，獲得干細(xì)胞特性，進(jìn)一步通過ABCB1/P-gp途徑，增強(qiáng)其自身耐藥。