白玉婷,蘇曉靈，劉彥民，年蔚，李衛(wèi)，魏曉娟，常榮

(1青海省人民醫(yī)院，西寧 810001；2深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院·廣東醫(yī)科大學附屬龍華中心醫(yī)院)

血管內(nèi)皮細胞(HUVEC)分布于整個循環(huán)系統(tǒng)中，將血管壁與循環(huán)血液分離，在幾乎所有的基本血管功能中發(fā)揮重要作用[1]。血管內(nèi)皮不僅提供了一種非黏附性、高選擇性的物理屏障來控制血管通透性，還釋放出大量的血管活性物質(zhì)來調(diào)節(jié)血管收縮和血管壁的重塑[2]。研究表明，血管內(nèi)皮功能障礙是動脈粥樣硬化和心血管疾病的早期特征[3],保護血管內(nèi)皮功能可預防心血管疾病的發(fā)生[4]。溶血磷脂酸(LPA)是一種具有廣泛生物活性的溶血磷脂，可引起調(diào)節(jié)細胞的增殖、遷移、存活等的多種生長因子樣反應[5]。焦磷酸酶/磷酸二酯酶2(ENPP2)是分泌LPA的一種重要的酶。有研究表明ENPP2/LPA軸參與血管生成、炎癥反應、神經(jīng)發(fā)育等多種病理生理過程[6,7]。2018年8月，我們以HUVEC為研究對象，進一步研究ENPP2/LPA軸對HUVEC增殖和遷移的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 HUVEC、過表達腺病毒Ad.ENPP2和對照病毒受贈予軍事科學院醫(yī)學研究院放射與輻射醫(yī)學研究所實驗血液學實驗室。胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司。RPMI1640細胞培養(yǎng)基購自美國Gibico公司。兔抗人AKT抗體、兔抗人磷酸化AKT(p-AKT)抗體、GAPDH抗體均購自美國Cell Signaling Technology。兔抗人ENPP2抗體購自美國Abcam公司。ECL發(fā)光液購自北京莊盟生物科技有限公司。HRP標記的山羊抗兔抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。SBYR熒光定量PCR試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司。TaqMan Gene Expression Master Mix購自美國ABI公司。TRIzol Reagent美國 Invitrogen公司。BCA蛋白定量檢測試劑盒購自美國Thermo公司。蛋白Marker購自中國Genstar公司。Transwell小室購自美國Corning公司。4%多聚甲醛、RIPA購自北京Solarbio公司。CCK-8試劑盒購自日本Dojindo公司。LPA檢測試劑盒購自上海古朵生物科技有限公司。結(jié)晶紫購自美國Cyagen公司。

1.2 過表達腺病毒Ad.ENPP2感染HUVEC細胞 HUVEC細胞計數(shù)后制成2×105/mL的細胞懸液，以1 mL/孔鋪入6孔板中過夜，次日更換培養(yǎng)基后隨機分為Ad.ENPP2組、Ad.Null組，分別感染腺病毒Ad.ENPP2、Ad.Null，感染劑量為20 MOI，6～8 h后根據(jù)細胞狀態(tài)給予補液，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，通過qRT-PCR法、Western blotting法檢測感染效率較高。

1.3 HUVEC細胞LPA受體、ENPP2表達檢測 采用qRT-PCR法。分別收集HUVEC細胞和感染了腺病毒Ad.ENPP2、Ad.Null的HUVEC細胞3×105/mL，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗1或2次，加入1 mL TRIzol，室溫靜置5 min，取上清至1.5 mL EP管，加入氯仿200 μL，振蕩15 s，室溫靜置5 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，吸取上層無色水相至新的EP管，加入異丙醇500 μL，輕輕混勻液體，室溫靜置10 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清，EP管中加入75%乙醇1 mL，輕微洗滌沉淀，4 ℃、7 500 r/min離心5 min，棄上清，真空干燥10 min，加入20 μL滅菌水溶解沉淀，分光光度計檢測RNA濃度。

逆轉(zhuǎn)錄反應體系：5 qRT Mix 4 μL，總RNA 2 μg，水補足至20 μL。反應條件：以上液體混勻后短暫離心，25 ℃、10 min，42 ℃、30 min，85 ℃、5 min，4 ℃。qRT-PCR反應體系：水3.3 μL，2SYBR PreMix 5 μL，Primer 1 μL，cDNA 0.5 μL，ROX Ⅱ 0.2 μL。將以上混合液加入96孔板中，每個樣品3個副孔，瞬時離心后上機，PCR擴增程序：95 ℃ 30 s(預變性)；95 ℃ 5 s、6 ℃ 30 s，40個循環(huán)(PCR階段)。

1.4 ENPP2與LPAR1拮抗劑Ki16198干預HUVEC細胞后磷酸化AKT檢測 采用Western blotting法。Ad.ENPP2組、Ad.Null組分別收集感染了腺病毒Ad.ENPP2、Ad.Null的HUVEC細胞3×105/mL，加入細胞裂解液(RIPA 60～100 μL)，充分裂解細胞，加入1% PMSF，-80 ℃反復凍融(39 ℃)細胞3次后4 ℃、12 000 r/min離心30 min，收集上清。BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，取10～20 μL蛋白進行電泳，然后電轉(zhuǎn)至PVDF膜，50 g/L脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加GAPDH抗體、ENPP2抗體、AKT抗體、p-AKT抗體，室溫慢搖1 h或4 ℃過夜。TBST漂洗3次，每次10 min，加入含有HRP標記的二抗TBST 5 mL(1∶5 000)，室溫孵育45 min～1 h，TBST漂洗3次，每次10 min, ECL發(fā)光液1∶1配好后曝光，使用Image J軟件進行吸光度分析。Ad.ENPP2組、Ad.Null組加入LPAR1拮抗劑Ki16198干預HUVEC細胞，再次檢測AKT水平。1.5 細胞增殖檢測 采用CCK-8法。Ad.ENPP2組、Ad.Null組HUVEC細胞感染上述病毒后若效率超過85%，用胰酶消化細胞后計數(shù)，制成5×103/mL的細胞懸液，以100 μL/孔鋪入96孔板中，分別在24、48、72 h后每孔加入CCK-8 10 μL，避光孵育2 h后使用全波長酶標儀讀取450 nm波長處光密度(OD)值以檢測ENPP2對H9c2細胞增殖的影響。為研究ENPP2調(diào)控HUVEC細胞增殖的可能機制，予HUVEC細胞LPAR1拮抗劑Ki16198后再次檢測HUVEC細胞增殖情況。

1.6 細胞遷移檢測 采用 Transwell實驗。HUVEC細胞計數(shù)后制成2×104/mL的細胞懸液加至Transwell chamber上室中，用無血清的RPMI1640培養(yǎng)液補足至200 μL，下室加入含10%FBS的RPMI1640 800 μL，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 h。取出chamber，用移液搶吸干上室液體，PBS 800 μL清洗3次，4%多聚甲醛800 μL固定30 min。吸干上室多聚甲醛，800 μL PBS清洗3次，結(jié)晶紫800 μL染色20～30 min，吸干上室結(jié)晶紫，800 μL PBS清洗3次，濕棉簽輕輕擦拭上室，顯微鏡取9個視野拍照后計數(shù)。為研究ENPP2調(diào)控HUVEC細胞遷移的可能機制，予HUVEC細胞LPAR1拮抗劑Ki16198后再次檢測HUVEC細胞遷移情況。

1.7 LPA水平檢測 HUVEC細胞感染Ad.ENPP2、Ad.Null病毒后取細胞培養(yǎng)上清，按LPA檢測試劑盒說明書加入檢測液，用全波長酶標儀于450 nm波長處測量OD值。根據(jù)標準品的濃度及測得的OD值計算標準曲線的直線回歸方程，根據(jù)測得的樣品OD值在直線回歸方程上計算相應濃度。

2 結(jié)果

2.1 HUVEC細胞中LPA受體表達 HUVEC細胞中LPAR1～LPAR6的相對表達量分別為0.377±0.011、0.004±0.002、0.002±0.001、0.000±0.000、0.000±0.000、0.007±0.001，HUVEC細胞中LPAR1表達最高，其次為LPAR6、LPAR2、LPAR3、LPAR5、LPAR4。

2.2 HUVEC細胞感染腺病毒后ENPP2表達 Ad.ENPP2組、Ad.Null組ENPP2 mRNA相對表達量分別為0.186±0.004、0.002±0.000，ENPP2蛋白相對表達量分別為1.261±0.080、0.532±0.031，兩組HUVEC細胞中的ENPP2 mRNA、蛋白相對表達量比較，P均<0.05。

2.3 ENPP2、Ki16198對HUVEC細胞AKT信號通路的影響 HUVEC細胞過表達ENPP2后，Ad.ENPP2組、Ad.Null組AKT相對表達量分別為0.539±0.008、0.107±0.004，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。HUVEC細胞給予Ki16198后，Ad.ENPP2組、Ad.Null組AKT相對表達量分別為0.882±0.062、1.154±0.074，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.4 過表達ENPP2對HUVEC細胞增殖的影響 Ad.ENPP2組在24、48、72 h時HUVEC細胞的增殖倍數(shù)分別為2.355±0.018、4.365±0.096、4.980±0.111，Ad.Null組分別為1.983±0.050、4.017±0.077、4.728±0.059。與Ad.Null組相比，Ad.ENPP2組過表達ENPP2后HUVEC細胞于24、48和72 h增殖倍數(shù)增加(P均<0.05)。

2.5 過表達ENPP2對HUVEC細胞遷移的影響 Ad.ENPP2組、Ad.Null組細胞遷移個數(shù)分別為(569.333±70.465)、(401.000±62.610)個/HP,與Ad.Null組相比，Ad.ENPP2組HUVEC細胞遷移能力增加(P<0.05)。

2.6 LPAR1拮抗劑Ki16198對HUVEC細胞增殖的影響 HUVEC細胞給予Ki16198后，Ad.ENPP2組在24、48、72 h時HUVEC細胞的增殖倍數(shù)分別為2.416±0.010、4.351±0.233、4.994±0.208，Ad.Null組分別為2.355±0.018、4.219±0.116、4.980±0.111，兩組24、48、72 h時HUVEC細胞的增殖倍數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。

2.7 LPAR1拮抗劑Ki16198對HUVEC細胞遷移的影響 HUVEC細胞給予Ki16198后，Ad.ENPP2組細胞遷移個數(shù)分別為(314.333±21.733)、(423.667±27.683)個/HP，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.8 過表達ENPP2對HUVEC細胞培養(yǎng)上清中LPA水平的影響 Ad.ENPP2組、Ad.Null組細胞培養(yǎng)上清中LPA水平分別為(612.267±69.940)、(476.184±15.995)nmoL/L，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討論

新生血管是局部組織再生及修復的最主要因素，血管內(nèi)皮細胞的增殖、分化、遷移以及匯聚是組織新生血管化的重要步驟，而其功能的障礙貫穿冠狀動脈粥樣硬化性心臟病及心血管事件的整個過程[8]。內(nèi)皮功能障礙是動脈粥樣硬化的一個重要特征，包括細胞增殖缺陷和異常凋亡，其中內(nèi)皮細胞的增殖能力通過修復血管內(nèi)皮來應對損傷是維持內(nèi)皮細胞壁完整性所必需的[9]。

ENPP2是維持LPA水平的主要酶ENPP2/LPA信號通路的異常與心血管疾病密切相關(guān)。為研究ENPP2/LPA軸在HUVEC細胞中的調(diào)控作用，我們首先研究了ENPP2對HUVEC細胞增殖和遷移的影響。結(jié)果顯示，過表達ENPP2可以促進HUVEC細胞的增殖和遷移。提示ENPP2在新生血管化中發(fā)揮重要作用。

LPA是一種小的、普遍存在的磷脂，通過結(jié)合并激活G蛋白偶聯(lián)受體(LPAR1～6)而發(fā)揮細胞外信號分子作用，具有神經(jīng)發(fā)生、血管生成、促進細胞遷移、存活及致癌作用[10]。其中LPAR1、LPAR3～5廣泛分布于心血管組織中。Shlyonsky等[11]研究顯示，在慢性低氧誘導的肺動脈高壓模型中，大鼠肺組織和血清中LPA水平明顯升高，低氧組動物的血清對大鼠原發(fā)性肺成纖維細胞具有明顯的趨化作用，LPAR1和LPAR3的拮抗劑可阻止細胞遷移，LPA可以促進血管生成，有助于肺血管的重塑。為了進一步研究ENPP2促進HUVEC細胞增殖和遷移的可能作用機制，我們檢測了HUVEC細胞中LPA受體表達及細胞培養(yǎng)上清中LPA濃度。結(jié)果顯示，HUVEC細胞可表達LPAR1～6，主要表達LPAR1、LPAR6、LPAR2。進一步研究，結(jié)果顯示，過表達ENPP2可以促進HUVEC細胞LPA濃度的升高，提示ENPP2可能通過促進LPA產(chǎn)生并與LPA受體結(jié)合進一步促進HUVEC細胞的增殖和遷移。LPAR1主要通過活化MAPK、PI3K/AKT、Rho等途徑發(fā)揮作用，介導細胞的增殖、存活和遷移[13]。另外，有研究表明，ENPP2/LPA軸可通過調(diào)控AKT信號通路促進H9c2細胞的增殖和遷移[14]。Hwang等[14]認為，LPA通過激活LPA1/3受體，刺激血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移、絲裂原活化蛋白激酶磷酸化、Rho和Ca2+活化，發(fā)揮血管生成效應。本研究結(jié)果顯示，過表達ENPP2可以上調(diào)HUVEC細胞p-AKT活性，提示AKT信號通路參與ENPP2調(diào)控的HUVEC細胞的增殖和遷移。Ki16198是LPA受體拮抗劑，可同時拮抗LPAR1和LPAR3，本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，Ki16198對HUVEC細胞的增殖沒有影響，但能抑制HUVEC細胞的遷移，與此同時，我們檢測了HUVEC細胞給予Ki16198后AKT信號通路表達的情況，結(jié)果顯示，Ki16198可以下調(diào)HUVEC細胞p-AKT表達，提示Ki16198可能通過拮抗LPAR1進而調(diào)控AKT信號通路影響HUVEC細胞的遷移。

綜上所述，ENPP2/LPA軸可能通過調(diào)節(jié)AKT信號通路調(diào)控HUVEC細胞的增殖和遷移，LPA受體拮抗劑Ki16198可能通過抑制LPAR1進而抑制AKT信號通路而調(diào)控HUVEC細胞的遷移。