張春英，羅祖強(qiáng)，周正平，陳春兵，袁 丹

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 病理學(xué)教研室，貴州 遵義 563099;2.遵義醫(yī)科大學(xué) 電鏡室，貴州 遵義 563099;3.貴州省第二人民醫(yī)院 婦產(chǎn)科，貴州 貴陽 550001)

子宮內(nèi)膜癌是女性中第四大惡性腫瘤，盡管醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步改善了患者的存活率，但其死亡率仍在增加，并且趨向于影響年輕女性[1]。子宮內(nèi)膜癌最常見的組織學(xué)類型是子宮內(nèi)膜樣癌(Endometrial adenocarcinoma，EA)。研究發(fā)現(xiàn)，EA的發(fā)病因素，除了與女性內(nèi)分泌調(diào)控因素有關(guān)，還與細(xì)胞周期失控、癌基因和抑癌基因表達(dá)水平的異常密切相關(guān)，然而，其具體病因還不十分清楚。

p57KIP2、表皮生長因子受體2(C-erbB-2)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，p53的突變或異常表達(dá)是誘導(dǎo)腫瘤的重要機(jī)制[2]。關(guān)于聯(lián)合檢測(cè)p53、C-erbB-2在人類其他惡性腫瘤中的表達(dá)研究較多，在EA中表達(dá)的研究較少，且聯(lián)合檢測(cè)p57KIP2、p53、C-erbB-2在EA中表達(dá)的研究，目前在國內(nèi)外尚未見報(bào)道。本研究擬選用存檔的EA組織100例，另選取正常子宮內(nèi)膜(增生期、分泌期各30例)作為對(duì)照，采用免疫組織化學(xué)Envision法檢測(cè)p57KIP2、p53 及C-erbB-2蛋白在EA中的表達(dá)及與臨床病理特征的相關(guān)性，從而為臨床判斷患者的生物學(xué)行為提供一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源 標(biāo)本來源于2014年1月至2017年12月遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科和貴州省第二人民醫(yī)院病理科確診為EA的存檔石蠟包埋組織，從中選取未行放療、化療及內(nèi)分泌等治療的標(biāo)本組織100例。病理檢查結(jié)果均由2名具有豐富臨床工作經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師進(jìn)行最后確診?；颊吣挲g32～80歲，中位年齡50.20歲。根據(jù)2014年WHO女性生殖系統(tǒng)腫瘤進(jìn)行分級(jí)[3]：組織學(xué)Ⅰ級(jí)(39例)、Ⅱ級(jí)(40例)、Ⅲ級(jí)(21例)。盆腔淋巴結(jié)腫大48例，其中轉(zhuǎn)移(18例)和無轉(zhuǎn)移(30例)；子宮肌層浸潤深度：深肌層浸潤(浸潤深度≥1/2)(30例)和無或伴淺肌層浸潤(浸潤深度<1/2)(70例)。根據(jù)2014年FIGO病理分期[4]：Ⅰ～Ⅱ期76例，Ⅲ～Ⅳ期24例。隨機(jī)選取門診診刮或因卵巢囊腫等病變進(jìn)行子宮切除的正常子宮內(nèi)膜(增生期、分泌期各30例)作為對(duì)照組。

1.2 試劑 鼠抗人p57KIP2單克隆抗體(工作濃度1∶75)、鼠抗人C-erbB-2單克隆抗體(工作濃度1∶100)、鼠抗人p53單克隆抗體(工作濃度1∶150)以及免疫組化試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 方法 將存檔組織石蠟包埋，切片4μm厚，行Envision法染色。根據(jù)說明書步驟進(jìn)行操作。組織均采用高壓進(jìn)行抗原修復(fù)。用PBS代替一抗作為空白對(duì)照，公司提供的陽性組織作陽性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判斷 以出現(xiàn)黃色或棕褐色顆粒為陽性表達(dá)，p57KIP2、p53蛋白陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞核，C-erbB-2蛋白位于細(xì)胞膜。每張切片任意選取10個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞，根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)所占的百分比進(jìn)行判斷：陽性細(xì)胞數(shù)≥10%為陽性(+)，低于此百分比則為陰性(-)[5]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。資料均為分類資料采用χ2檢驗(yàn)，關(guān)聯(lián)強(qiáng)度用Spearman Correlation關(guān)聯(lián)系數(shù)描述。當(dāng)P≤0.05，表示結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩兩比較的檢驗(yàn)水準(zhǔn)調(diào)整為0.017。

2 結(jié)果

2.1 p57KIP2、p53與C-erbB-2蛋白在EA及增生期、分泌期組織中的表達(dá) p57KIP2蛋白在EA組織中陽性表達(dá)率為30%，在增生期組織中陽性表達(dá)率為3.3%，分泌期組織中陽性表達(dá)率為93.3%，3組總體差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；增生期中的陽性率低于分泌期中的陽性率(χ2=48.654，P<0.001)，增生期中的陽性率低于EA組織中的陽性率(χ2=9.037，P=0.003)，分泌期中的陽性率高于EA組織中的陽性率(χ2=37.460，P<0.001)。

p53蛋白在EA組織中陽性表達(dá)率為59%，在增生期組織中陽性表達(dá)率為3.3%，分泌期組織中不表達(dá)，3組總體差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在增生期中的陽性率高于分泌期中的陽性率(χ2=1.017，P=0.313)，增生期中的陽性率低于EA組織中的陽性率(χ2=28.774，P<0.001)，分泌期中的陽性率低于EA組織中的陽性率(χ2=32.408，P<0.001)。

C-erbB-2蛋白在EA組織中陽性表達(dá)率為50%，在增生期中陽性表達(dá)率為6.7%，分泌期中陽性表達(dá)率為3.3%，3組總體差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；增生期中的陽性率高于分泌期中的陽性率(χ2<0.001，P>0.999)，增生期中的陽性率低于EA組織中的陽性率(χ2= 18.056，P<0.001)，分泌期中的陽性率低于EA組織中的陽性率(χ2=21.080，P<0.001，見表1、圖1)

表1 p57KIP2蛋白、p53蛋白和C-erbB-2蛋白在不同子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)

a:與分泌期比較，P≤0.017；b:與EA比較，P≤0.017。

A：p57KIP2蛋白陽性表達(dá)；B：p53蛋白陽性表達(dá)；C：C-erbB-2蛋白陽性表達(dá)；×400。圖1 p57KIP2、p53與C-erbB-2在EA組織中陽性表達(dá)

2.2 p57KIP2、p53與C-erbB-2蛋白表達(dá)與EA臨床病理特征的關(guān)系 在EA組織中，p57KIP2、p53、C-erbB-2蛋白與組織學(xué)分級(jí)總體比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；p57KIP2蛋白在Ⅰ級(jí)中表達(dá)最高，在Ⅲ級(jí)中表達(dá)最低，但僅在Ⅰ級(jí)和Ⅲ級(jí)、Ⅱ級(jí)和Ⅲ級(jí)中比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≤0.017)；p53和C-erbB-2蛋白在Ⅲ級(jí)中表達(dá)最高，在Ⅰ級(jí)中表達(dá)最低，但p53蛋白在組織學(xué)分級(jí)間兩兩比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.017)；C-erbB-2蛋白僅在Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)、Ⅰ級(jí)和Ⅲ級(jí)中比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≤0.017)；p57KIP2蛋白在無或淺肌層中的陽性表達(dá)高于深肌層(P<0.05)；p53和C-erbB-2在深肌層中的陽性表達(dá)高于無或淺肌層中(P<0.05)；手術(shù)分期中，p57KIP2在Ⅰ～Ⅱ期的陽性表達(dá)高于Ⅲ～Ⅳ期(P<0.05)；C-erbB-2在Ⅲ～Ⅳ期中的陽性表達(dá)高于Ⅰ～Ⅱ期(P<0.05)，p53蛋白的表達(dá)與手術(shù)分期無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；三者均與年齡和是否有盆腔淋巴轉(zhuǎn)移無關(guān)(P>0.05，見表2)。

表2 p57KIP2、p53與C-erbB-2蛋白表達(dá)與EA臨床病理特征的關(guān)系

2.3 p57KIP2、p53與C-erbB-2蛋白在EA中表達(dá)的相關(guān)性分析 p57KIP2與p53蛋白之間的表達(dá)無關(guān)聯(lián)(P>0.05)、p57KIP2與C-erbB-2蛋白之間的表達(dá)無關(guān)聯(lián)(P>0.05)；p53和C-erbB-2蛋白之間的表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.05，見表3～5) 。

表3 p57KIP2與 p53 蛋白在EA中的表達(dá)的相關(guān)性分析(n=100)

表4 p57KIP2與C-erbB-2在EA中的表達(dá)的相關(guān)性分析(n=100)

表5 p53與C-erbB-2蛋白在EA中的表達(dá)的相關(guān)性分析(n=100)

3 討論

p57KIP2是新近發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑CIP/KIP家族成員，通過阻斷G1期進(jìn)展，發(fā)揮抗腫瘤作用，它的低表達(dá)或缺乏，促進(jìn)了惡性腫瘤的發(fā)生[6-7]。在肝癌、乳腺癌、前列腺癌等多種癌癥中都存在p57KIP2表達(dá)的下調(diào)或缺乏[8-10]。Kim等[11]研究顯示，p57KIP2在分泌期子宮內(nèi)膜中顯著增加，在增生期中最低，而張苗等[12]研究認(rèn)為，p57KIP2在增生期組織中高表達(dá)，在EA組織中低表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，p57KIP2在分泌期子宮內(nèi)膜中陽性表達(dá)最高，在增生期中陽性表達(dá)最低，在EA組織中的陽性表達(dá)介于分泌期、增生期組織中的表達(dá)，與Kim等研究相似，但與張苗等研究不一致，可能與張苗未選用分泌期組織，且樣本量較少有關(guān)。p57KIP2的這種變化，可能與女性激素的誘導(dǎo)有關(guān)，表明了p57KIP2主要參與細(xì)胞的分化而非增殖。本研究在分析p57KIP2與EA臨床病理特征的關(guān)系中顯示：EA組織學(xué)分級(jí)越高、手術(shù)分期越晚、肌層浸潤越深，p57KIP2表達(dá)越低，表明了隨著p57KIP2的衰減，對(duì)內(nèi)膜細(xì)胞增殖的抑制作用也逐漸減弱，導(dǎo)致其向分化更差、分期更晚的方向發(fā)展。提示在EA的發(fā)生發(fā)展過程中可能有p57KIP2的參與，它的高表達(dá)可能提示低病理組織學(xué)分級(jí)和手術(shù)分期，且不易發(fā)生深肌層浸潤。

促凋亡基因p53，參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)與凋亡，直接或間接控制細(xì)胞周期相關(guān)基因和凋亡基因的表達(dá)，發(fā)揮抗腫瘤作用。但p53易發(fā)生突變，在所有人類腫瘤中發(fā)現(xiàn)了超過50%的基因變異[13]。突變的p53轉(zhuǎn)變?yōu)榘┗颢@得新的致癌特性，導(dǎo)致細(xì)胞增殖異常和癌變[14]。有研究顯示：在突變型p53的影響下，子宮內(nèi)膜可跳過增生改變迅速發(fā)展成癌[15]。p53的突變和異常蛋白的表達(dá)常發(fā)生在內(nèi)膜癌晚期，據(jù)此我們可以對(duì)內(nèi)膜癌的惡性情況作出一定的評(píng)估[16]。子宮內(nèi)膜息肉顯示異常p53的患者更可能患有子宮內(nèi)膜癌[2]。C-erbB-2是一種致癌基因，編碼185-kPa蛋白，通過上調(diào)血管通透因子和血管內(nèi)皮生長因子抑制細(xì)胞凋亡，形成腫瘤血管，通過根除身體組織的抗侵襲屏障來增加腫瘤侵襲性，參與了腫瘤的發(fā)病機(jī)制[17]。C-erbB-2及其蛋白質(zhì)產(chǎn)物(P185)在多種腫瘤組織中如乳腺癌、胃癌和卵巢癌等都存在高表達(dá)和擴(kuò)增[18-20]，其過表達(dá)加速了癌細(xì)胞的擴(kuò)散。本研究顯示：p53、C-erbB-2在EA組織中表達(dá)最高，在分泌期子宮內(nèi)膜組織中表達(dá)最低，且兩種蛋白的陽性表達(dá)隨著病理組織學(xué)分級(jí)、手術(shù)分期和癌組織浸入子宮肌層深度的增加呈遞增式的表達(dá)，提示p53、C-erbB-2與EA的發(fā)展密切相關(guān)，兩種蛋白表達(dá)越高，EA預(yù)后越差。p53蛋白在組織學(xué)分級(jí)中兩兩比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示可能需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量再進(jìn)行觀察比較。

然而一種腫瘤的發(fā)生更多表現(xiàn)為多基因聯(lián)合作用的結(jié)果。p57KIP2、p53和C-erbB-2之間可相互作用、相互影響，產(chǎn)生聯(lián)結(jié)效應(yīng)，共同參與腫瘤的發(fā)生機(jī)制。p57KIP2的缺乏導(dǎo)致T細(xì)胞發(fā)育受阻，其缺失和p53的過度活化，加速了淋巴瘤的發(fā)展[21]。在食管鱗狀細(xì)胞癌中，p57KIP2和p53存在顯著的負(fù)相關(guān)，p57KIP2的低表達(dá)和p53的高表達(dá)提示患者預(yù)后不良[22]。p53和C-erbB-2在滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤組織中表達(dá)越高預(yù)后可能越差，根據(jù)其表達(dá)情況可預(yù)判滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤的生物學(xué)行為[23]；在結(jié)直腸癌患者中，同樣也存在p53和C-erbB-2的表達(dá)，二者表達(dá)越高，預(yù)后越差[24]。本研究中，我們還發(fā)現(xiàn)，p53、C-erbB-2蛋白在EA中表達(dá)呈正相關(guān)，且在EA組織中的陽性表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在增生期、分泌期等正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)，意味著兩種蛋白可能在子宮內(nèi)膜組織的惡性轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮了共同的促進(jìn)作用。

腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移嚴(yán)重威脅著人類的健康，對(duì)腫瘤患者預(yù)后的判斷及治療極其重要。然而，在評(píng)估腫瘤預(yù)后方面，分析多因素指標(biāo)比單一指標(biāo)更具有指導(dǎo)意義。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，p57KIP2、p53和C-erbB-2可能共同參與了EA的發(fā)生發(fā)展。在EA組織中，p57KIP2表達(dá)越低、C-erbB-2和p53表達(dá)越高，意味著患者有較高的組織學(xué)分級(jí)、肌層浸潤較深、手術(shù)分期較晚，預(yù)示EA患者可能有更差的預(yù)后。因此，通過聯(lián)合檢測(cè)EA患者癌組織中p57KIP2、p53與C-erbB-2蛋白的表達(dá)情況，對(duì)于指導(dǎo)臨床評(píng)估EA患者的治療和預(yù)后有較為積極的指導(dǎo)意義。