張耀月，胡錫階，祁 瑩，趙佩翔，萬(wàn) 雪，萬(wàn)衛(wèi)紅，張 昊，劉祖林，余麗梅

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 貴州省細(xì)胞工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學(xué) 法醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義 563099； 3.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科，貴州 遵義 563099)

唐氏綜合征(Down’s syndrome,DS)又稱21-三體綜合征，為臨床常見的染色體數(shù)目異常疾病，以智力低下、特殊面容及心血管等多臟器畸形和功能異常為主要臨床表現(xiàn)，易導(dǎo)致流產(chǎn)、死胎，新生兒發(fā)病率約1/800～1/600[1]。目前，DS尚無(wú)有效的治療方法，及早發(fā)現(xiàn)，阻滯DS患兒出生，是主要的預(yù)防措施。血清學(xué)產(chǎn)前篩查、超聲檢查、無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前胎兒游離DNA基因檢測(cè)及羊水細(xì)胞染色體核型分析分別為臨床篩查和確診的依據(jù)，出生后根據(jù)患兒臨床表型，外周血染色體核型分析為確診金標(biāo)準(zhǔn)[2-4]。后兩種方法準(zhǔn)確性高、特異性好，但存在著技術(shù)難度高、操作復(fù)雜、檢測(cè)周期長(zhǎng)的突出問題，仍需繼續(xù)優(yōu)化檢測(cè)方法。

短串聯(lián)重復(fù)序列(Short tandem repeat,STR)分型技術(shù)廣泛應(yīng)用于法庭科學(xué)和群體遺傳學(xué)研究，具有檢測(cè)簡(jiǎn)單快速，靈敏度高、準(zhǔn)確性和重復(fù)性好、信息含量高及結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)[5]。以往的案例報(bào)道中，采用Identifiler、PowerPlex、Goldeneye 20A試劑盒經(jīng)STR分型及多重?zé)晒釶CR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了不同染色體三峰型(三帶型)三等位基因和其他染色體病[6-11]。本研究與染色體核型分析互為驗(yàn)證，采用符合中國(guó)人群基因座遺傳多態(tài)性特征的Goldeneye 20A試劑盒，與正常人比較，全面分析94例DS患者21號(hào)染色體所含D21S11與新增Penta D基因座峰型、峰高和峰面積等特征，以明確該試劑盒兩個(gè)基因座聯(lián)合在快速檢測(cè)DS中可能的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料 94例DS患者(男性50例，女性44例)血樣收集于2016～2019年遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科細(xì)胞遺傳室，經(jīng)染色體核型分析確診DS，剩余血樣用于基因組DNA提取。正常人血樣來自2017～2018年遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院貴州省細(xì)胞工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/司法鑒定中心法醫(yī)物證室日常親子鑒定檢案和檢驗(yàn)科細(xì)胞遺傳室染色體核型正常者，隨機(jī)選取100例(男性65例，女性35例)無(wú)關(guān)個(gè)體血樣。

1.2 儀器與試劑 美國(guó)ABI公司2720 Thermal cycler PCR擴(kuò)增儀、3500-DX遺傳分析儀和GeneMapper ID-X 1.4軟件，QIAamp? blood mini DNA試劑盒(Qiagen公司，德國(guó))，晶芯NanoQ微型分光光度計(jì)(北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司，中國(guó))，Goldeneye 20A PCR擴(kuò)增試劑盒為基點(diǎn)認(rèn)知公司(北京)有限公司產(chǎn)品(中國(guó))，GSL120高通量全自動(dòng)染色體掃描平臺(tái)(Leica公司,德國(guó))，CX41倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)，植物血凝素和秋水仙素分別購(gòu)于上海伊華醫(yī)學(xué)科技有限公司和美國(guó)Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 G顯帶染色體核型分析 DS患者抗凝外周靜脈血細(xì)胞培養(yǎng)72 h，20 μL秋水仙素處理1小時(shí)后，收集細(xì)胞沉淀，按照G顯帶技術(shù)要求，37 ℃，經(jīng)0.075 mol /L氯化鉀低滲，3:1甲醇/冰醋酸固定、制片，顯微鏡下觀察30個(gè)中期分裂相，用全自動(dòng)染色體掃描平臺(tái)和CytoVision.lnk軟件采集、分析染色體核型，確診DS。

1.3.2 DNA提取與定量 DS患者血樣使用QIAamp? blood mini DNA 試劑盒提取DNA，NanoQ微型分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度，樣本DNA濃度稀釋至0.35 ng/μL；正常人EDTA抗凝靜脈血80 μL制成FTA血卡，手動(dòng)打孔取1.0 mm2血斑加于EP管。

1.3.3 PCR擴(kuò)增與毛細(xì)管電泳 按Goldeneye 20A試劑盒說明書要求，對(duì)樣本DNA進(jìn)行復(fù)合PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95℃，5 min，94℃，30 s，60℃，60 s，70℃，60 s，27個(gè)循環(huán)，陰性對(duì)照(water)、陽(yáng)性對(duì)照(9947A)和樣本同一批次擴(kuò)增。取1.2 μL擴(kuò)增產(chǎn)物在3500-DX遺傳分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳，GeneMapper ID-X 1.4軟件分析STR分型圖譜，并自動(dòng)計(jì)算等位基因熒光峰峰高、峰面積。Goldeneye 20A試劑盒等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物分型圖譜，D21S11基因座可見25種等位基因座，Penta D基因座存在15種等位基因座，陰性對(duì)照無(wú)熒光峰，陽(yáng)性對(duì)照STR分型峰均衡，均符合質(zhì)控要求。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 SPSS 18.0軟件計(jì)算D21S11和Penta D基因座等位基因峰高比值、峰面積比值和等位基因頻率；兩組間等位基因頻率比較采用卡方檢驗(yàn)，兩組間樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 染色體核型 正常人外周血細(xì)胞染色體核型分析可見23對(duì)(46條)染色體，未見明顯染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常(見圖1A)。94例確診為DS患者的均顯示21號(hào)染色體出現(xiàn)了典型的三條染色單體(見圖1B)，其余22對(duì)染色體未見明顯異常。

圖1 正常人(A)與DS患者(B,紅色箭頭所示)外周血細(xì)胞G顯帶染色體核型分析結(jié)果

2.2 正常人STR分型 參照歐洲臨床細(xì)胞遺傳學(xué)分子遺傳學(xué)會(huì)《QF-PCR診斷非整倍體最佳操作指南》對(duì)常染色體STR峰型特征的描述[12-13]：峰面積比值在0.8～1.4間的兩個(gè)峰為正常二倍體(重復(fù)序列長(zhǎng)度>24bp的等位基因，該比值可高至1.5)，比值<0.65或>1.8失衡的兩個(gè)峰，或者出現(xiàn)1個(gè)峰，且峰面積是相鄰雜合子單峰峰面積3倍時(shí)，判定為三等位基因。比值介于中間范圍0.65～0.8和1.4～1.8的非結(jié)論性結(jié)果，可以通過使用單標(biāo)記物重新檢測(cè)來解決，本研究則采用21號(hào)染色體上D21S11和PentaD兩個(gè)基因座聯(lián)合分析，與重復(fù)檢測(cè)確定。

100例正常人的STR分型結(jié)果中，D21S11檢出11種等位基因，Penta D檢出8種等位基因。96例D21S11和Penta D基因座檢出的純合子單峰型等位基因和雜合子雙峰型等位基因中均未見三等位基因(見圖2)，另有4例D21S11雙峰型等位基因峰面積比值雖然介于0.68～0.78之間，但Penta D單、雙峰型等位基因的峰高比值、峰面積比值均在正常范圍，重復(fù)檢測(cè)后比值均在正常范圍。

A、B：D21S11S和Penta D基因座雙峰型等位基因；C、D：D21S11S和Penta D基因座單峰型等位基因。圖2 正常人D21S11S和Penta D基因座STR分型圖譜(紅色箭頭所示)

2.3 DS患者D21S11和Penta D三峰型三等位基因圖譜 94例DS患者的STR分型圖譜中，D21S11共檢出13種等位基因，Penta D基因座檢出9種等位基因。21號(hào)染色體三峰型三等位基因存在3種情況：(1)兩個(gè)基因座同時(shí)為三峰型三等位基因16例(見圖3A)；(2)D21S11基因座為三峰型三等位基因29例，其中含Penta D雙峰型三等位基因25例(見圖3B)，單峰型三等位基因4例(見圖3C)；(3)Penta D基因座為三峰型三等位基因18例，其中含D21S11雙峰型三等位基因15例(見圖3D)，3例為單峰型三等位基因(見圖3E)。

A：D21S11和Penta D均為三峰型等位基因；B： D21S11為三峰型等位基因，且Penta D為雙峰型等位基因；C：D21S11為三峰型等位基因，且Penta D為單峰型等位基因；D：Penta D為三峰型等位基因，且D21S11為雙峰型等位基因；E：Penta D為三峰型等位基因，且D21S11為單峰型等位基因。圖3 DS患者D21S11和Penta D基因座STR分型三峰型圖譜(紅色箭頭所示)

2.4 DS患者D21S11和Penta D雙峰型三等位基因圖譜 94例DS患者中，D21S11和Penta D同時(shí)為雙峰型三等位基因16例(見圖4A)，D21S11為雙峰型三等位基因及Penta D為單峰三等位基因者5例(見圖4B)，7例Penta D為雙峰型三等位基因及相應(yīng)D21S11為單峰三等位基因(見圖4C)，仍有2例D21S11和Penta D兩次檢測(cè)峰高、峰面積比值均不符合三等位基因判斷標(biāo)準(zhǔn)，他們的峰高比值/峰面積比值分別為0.87/0.85、0.97、0.97，且前一例還存在TPOX的單峰型三等位基因。另見1例Penta D和D21S11均為純合子單峰型三等位基因(見圖4D)。

本研究中所有DS患者1、2、13、18等其他17個(gè)常染色體STR基因座均與正常人的峰型、峰高和峰面積相似，未見三等位基因。

A:D21S11和Penta D均為雙峰型等位基因；B:D21S11為雙峰型等位基因，同時(shí)Penta D為單峰型等位基因; C:D21S11為單峰型等位基因，同時(shí)Penta D為雙峰型等位基因；D:D21S11和Penta D基因座同為單峰型等位基因。圖4 DS患者D21S11和Penta D基因座STR分型雙峰型圖譜

2.5 DS患者D21S11和Penta D雙峰型等位基因峰高比值與峰面積比值 D21S11、Penta D基因座除外三峰型三等位基因和重復(fù)檢測(cè)雙峰型峰高比值和峰面積比值仍然>0.8者，D21S11、Penta D雙峰型等位基因者分別為21和23例，除2例D21S11雙峰峰高比值/峰面積比值為0.66/0.66、0.75/0.75，相應(yīng)Penta D為雙峰型三等位基因，1例Penta D雙峰峰高比值/峰面積比值為0.81/0.77，相應(yīng)D21S11為雙峰型三等位基因，其余患者D21S11和Penta D雙峰型等位基因峰高比值/峰面積比值均介于0.34～0.64之間。正常人的雙峰型等位基因的峰高比值/峰面積比值均介于0.8～1.0之間，在這些雙峰型等位基因中，DS患者D2S11和Penta基因座的峰高比值、峰面積比值都小于正常人。

表1 DS患者D21S11和Penta D基因座雙峰型等位基因峰高、峰面積比值

與正常人比較，*：P<0.01。

2.6 DS患者D21S11和Penta D基因座等位基因頻率比較 DS患者和正常人D21S11基因座均為30、29等位基因頻率最高，30.2較低，DS患者各等位基因頻率與正常人無(wú)明顯差異(P>0.05，表2)。DS患者和正常人Penta D基因座均為9等位基因頻率最高，分別為15、7等位基因頻率最低，兩組人群中等位基因頻率沒有明顯差異(P>0.05，表3)。上述等位基因均在陽(yáng)性質(zhì)控中可見。

表2 DS患者和正常人D21S11基因座等位基因頻率分布的比較

表3 DS患者和正常人 Penta D基因座等位基因頻率分布的比較

3 討論

DS的染色體病變最主要是由于卵細(xì)胞形成的減數(shù)分裂Ⅰ期21號(hào)染色體不分離造成，也可能在減數(shù)分裂Ⅱ期21號(hào)染色體不分離，或少數(shù)涉及精子減數(shù)分裂不分離、易位或嵌合等[14-15]，≥35歲高齡孕婦胎兒DS患病風(fēng)險(xiǎn)增高3～5倍，嚴(yán)重影響人口素質(zhì)，給患兒、家庭及社會(huì)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)。在出生缺陷的二級(jí)預(yù)防和出生后的分子遺傳學(xué)檢測(cè)中，除孕婦外周血胎兒游離DNA高通量測(cè)序外，研究者們采用多重?zé)晒釶CR、STR分型等技術(shù)，不斷探索檢測(cè)羊水及出生后臍帶血和外周血細(xì)胞21號(hào)染色體S100B、SOD1等特定基因和分析D21S11基因座等三峰型三等位基因[7,10,14]，在保證特異性前提下，提高DS檢測(cè)的準(zhǔn)確性，一直是實(shí)現(xiàn)快速篩查或診斷的關(guān)鍵。

常染色體STR基因座的遺傳多態(tài)性和呈孟德爾方式遺傳，是STR分型檢測(cè)被應(yīng)用于群體遺傳學(xué)研究及法庭科學(xué)的重要基礎(chǔ)。正常情況下，1個(gè)STR基因座上只有 2個(gè)等位基因，其分型圖譜顯示為正常的純合子單峰型或雜合子雙峰型熒光峰。研究報(bào)道，針對(duì)D21S11、D21S1442、D21S2039和 D21S1809 等STR位點(diǎn)，聯(lián)合檢測(cè)DS，2、4和6個(gè)基因座聯(lián)合，對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)型DS檢出率可達(dá)到83%、92%和99.5%[15-18]，表明聯(lián)合多個(gè)高遺傳多態(tài)性的STR位點(diǎn)可提高診斷的準(zhǔn)確性。Goldeneye 20A試劑盒即在核心序列D21S11基礎(chǔ)上，增加了在中國(guó)人群中遺傳多態(tài)性良好的Penta D基因座，前者是位于21q21.1的TCTA TCTG復(fù)雜重復(fù)序列，后者是位于21q22.3的AAAGA核心重復(fù)序列。該試劑盒的法庭科學(xué)應(yīng)用，系統(tǒng)效能良好，中國(guó)人群中19個(gè)常染色體STR基因座也具有理想的雜合度、等位基因數(shù)和個(gè)體識(shí)別力[11]，也在檢案中已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)TPOX基因座、D21S11和Penta D基因座均顯示1∶1∶1三峰型三等位基因[19-21]。

100例正常人未檢出三等位基因的結(jié)果不但有利于進(jìn)一步的峰面積、峰高比值分析，也表明了聯(lián)合D21S11和Penta D基因座檢測(cè)DS的高特異性。對(duì)94例經(jīng)染色體核型分析確診DS患者的STR分型圖譜的全面分析中，按照歐洲有關(guān)三等位基因峰面積判斷標(biāo)準(zhǔn)，本研究聯(lián)合應(yīng)用21號(hào)染色體上的兩個(gè)不同位置的D21S11或Penta D基因座同時(shí)分析，結(jié)果顯示，Penta D與D21S11基因座相似，三帶型三等位基因以峰高比均衡約1∶1∶1者為主，分別占88.2%(30/34)和84.4%(38/45)；但也發(fā)現(xiàn)了與大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道不盡相同的STR圖譜特征，即存在6種三峰型、雙峰型和單峰型三等位基因：(1)兩個(gè)基因座均為三峰型；(2)1個(gè)基因座為三峰型加另1個(gè)基因座為雙峰型；(3)1個(gè)基因座為三峰型加另1個(gè)基因座為單峰型；(4)兩個(gè)基因座均為雙峰型；(5)1個(gè)基因座為雙峰型加另1個(gè)基因座為單峰型；(6)兩個(gè)基因座均為單峰型。因此，單獨(dú)依據(jù)D21S11或Penta D三峰型三等位基因的DS陽(yáng)性檢出率僅為47.87%(45/94例)、36.17%(34/94例)；兩個(gè)基因座中任一者呈現(xiàn)三峰型三等位基因即滿足結(jié)果判斷，DS陽(yáng)性檢出率則可達(dá)67.02%(63/94例)，與僅檢測(cè)D21S11基因座發(fā)現(xiàn)DS的研究比較，明顯提高了DS陽(yáng)性檢出率。在非三峰型三等位基因的DS患者中，除1例D21S11或Penta D基因座均為單峰型三等位基因的DS圖譜外，單獨(dú)依據(jù)D21S11或Penta D基因座為雙峰型三等位基因的DS陽(yáng)性檢出率分別為22.34%(21/94例)和24.47%(23/94例)；兩個(gè)基因座中任一者呈現(xiàn)雙峰型三等位基因即滿足結(jié)果判斷，DS陽(yáng)性檢出率可達(dá)29.79%(28/94例)，意味著DS的總漏檢率降低了29.79%。

聯(lián)合應(yīng)用D21S11、Penta D基因座的多種三峰型和雙峰型及單峰型三等位基因特征與峰高、峰面積分析，總計(jì)DS陽(yáng)性檢出率可高達(dá)97.87%(92例/94例)，較僅采用D21S11基因座三峰和雙峰型而言，增加Penta D和單峰型三等位基因后將DS陽(yáng)性檢出率顯著提高了26.67%，大大降低了單基因和易被忽略的單峰型DS者的漏檢。對(duì)于8例雙峰型基因座峰高、峰面積比值介于0.65～0.8之間的DS患者，重復(fù)檢測(cè)后仍有2例Penta D和D21S11基因座峰高、峰面積均>0.8，不符合三等位基因判斷標(biāo)準(zhǔn)，表明采用Goldeneye 20A試劑盒中Penta D和D21S11兩個(gè)基因座聯(lián)合檢測(cè)分析，仍然存在2.13%的漏檢率，也提示這2例致病機(jī)制顯然不是標(biāo)準(zhǔn)型21號(hào)染色體減數(shù)分裂I期不分離所致，其中1例存在復(fù)合染色體病變，伴有2號(hào)染色體TPOX基因座的三等位基因。TPOX是甲狀腺過氧化物酶基因內(nèi)的一個(gè)多態(tài)性適中、突變率低，可穩(wěn)定遺傳的STR基因座，在序列圖的位置為1483854-1484085(bp)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，核心序列為AATC，在中國(guó)人群中存在4-15的不同等位基因，TPOX基因座是以往研究中發(fā)現(xiàn)最多的三峰型三等位基因之一[19,22]。上述結(jié)果若結(jié)合父母的STR分型結(jié)果，還可判讀染色體不分離的來源。然而，DS患者D21S11和Penta D基因座等位基因頻率與正常人沒有明顯差異，與眾多研究所述等位基因頻率的差異受種族、地域等因素影響更為明顯，而DS在等位基因變化上可能存在較大的隨機(jī)性。

總之，采用Goldeneye 20A試劑盒中Penta D和D21S11兩個(gè)基因座聯(lián)合檢測(cè)DS，對(duì)STR分型圖譜6種三峰型、雙峰型和單峰型特征及峰高、峰面積比值全面的分析，使DS檢出的準(zhǔn)確性大大提高，而且與染色體核型分析相比，STR基因座分型技術(shù)僅需要6 h左右，即可完成樣本檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析，不但方法簡(jiǎn)便、快速高效，且檢測(cè)所需樣本量較少，成本較低等優(yōu)點(diǎn)，更適于臨床快速檢測(cè)，尤其是進(jìn)行胎兒羊水細(xì)胞、新生兒血片篩查或臍帶血篩查等都可能對(duì)具有較好的應(yīng)用價(jià)值。