唐應(yīng)麒 ，楊 艷，曾 峰，程曉明

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 甲狀腺乳腺外科，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科，貴州 遵義 563099)

甲狀腺癌(Thyroid carcinoma，TC)是目前發(fā)現(xiàn)的最常見內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤[1]，根據(jù)病理類型主要分為乳頭狀甲狀腺癌(Papillary thyroid carcinoma，PTC)、濾泡狀甲狀腺癌(Follicular thyroid carcinoma，F(xiàn)TC)、未分化型甲狀腺癌(Undifferentiated thyroid carcinoma，UTC)和髓樣癌(Medullary thyroid carcinoma，MTC)[2]。TC近年的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈持續(xù)上升趨勢(shì)[3]，TC發(fā)病率的升高主要是以PTC發(fā)病率的增加為主[4]。同其他惡性腫瘤一樣，TC的發(fā)病可能與基因的表達(dá)異常有關(guān)，如BRAF、TERT、LASS2等[5-8]。人源性長(zhǎng)壽保障基因2(Homo sapiens longevity assurance homologue 2，LASS2)，也被稱為腫瘤轉(zhuǎn)移抑制相關(guān)基因1(Tumor metastasis suppressor gene-1，TMSG-1)，是一種人類腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因。已有研究表明，LASS2的異常表達(dá)與肝癌[9]、前列腺癌[10]、膀胱癌[11]、乳腺癌[12]的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但LASS2與甲狀腺癌關(guān)系的研究卻鮮有報(bào)道。隨著對(duì)TC發(fā)病機(jī)制不斷研究，目前已有針對(duì)BRAF、RET/PTC、RAS等基因的靶向治療[13]。即便如此，甲狀腺癌的發(fā)病機(jī)制仍然不清，靶向治療具有一定局限性，所以需要更進(jìn)一步探尋其他可能存在的分子機(jī)制及分子標(biāo)記物，為臨床診治提供新的思路。本課題通過構(gòu)建LASS2過表達(dá)的BCPAP細(xì)胞，研究LASS2對(duì)BCPAP細(xì)胞遷移侵襲的影響及其可能存在的機(jī)制，為TC的診治提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 BCPAP細(xì)胞株購(gòu)自中科院干細(xì)胞庫；Adv-LASS2-GFP、Adv-GFP重組腺病毒購(gòu)自北京百奧川生物科技有限責(zé)任公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自GIBCO公司；RNA提取試劑盒、RT-qPCR試劑購(gòu)自Takara公司；GAPDH購(gòu)自華安生物技術(shù)有限公司；全蛋白提取試劑盒、Matrigel購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自雅酶生物科技公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自北京GenStar公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI7500)購(gòu)自美國(guó)ABI公司；Gel Doc XR+凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司；倒置顯微鏡(iX71)購(gòu)自日本Olympus公司；GAPDH抗體購(gòu)自華安公司；LASS2抗體購(gòu)自Santa公司；MMP2、MMP9抗體購(gòu)自abcam公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 BCPAP細(xì)胞采用含10%FBS、1%NEAA、1%丙酮酸鈉、1%Glutamax的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)密度達(dá)80%～90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，Adv-LASS2-GFP、Adv-GFP分別感染BCPAP細(xì)胞，分為實(shí)驗(yàn)組(Adv- LASS2-GFP，n=3)、空載組(Adv-GFP，n=3)和陰性對(duì)照組(n=3)，轉(zhuǎn)染48h后按各實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行收樣。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 RT-qPCR檢測(cè)LASS2 mRNA表達(dá)情況 轉(zhuǎn)染48h后，提取各組細(xì)胞中總RNA，測(cè)定RNA濃度與純度，并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，儲(chǔ)存于-80℃冰箱中備用。以GAPDH作為內(nèi)參，RT-qPCR檢測(cè)分析LASS2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平(擴(kuò)增體系25μL，反應(yīng)條件95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)；融解曲線：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s)，以2-ΔΔCt值表示基因相對(duì)表達(dá)量。目的基因引物序列：GAPDH上游5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′；LASS2上游5′-ATCGTCTTCGCCATTGTT-3′，下游5′-AGCAGTGGAAGCCTTACTCC-3′。

1.2.3 WB檢測(cè)LASS2、MMP2、MMP9蛋白相對(duì)水平 轉(zhuǎn)染48 h后，按照全蛋白提取試劑盒說明提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法定量蛋白濃度，根據(jù)說明用2%SDS和上樣緩沖液將蛋白稀釋至2 μg/μL，蛋白變性后，每個(gè)泳道上樣量20 μg，10%SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，4℃濕轉(zhuǎn)過夜、封閉、洗膜、一抗(鼠抗LASS2單克隆抗體稀釋倍數(shù)1∶500，鼠抗GAPDH單克隆抗體稀釋倍數(shù)1∶5 000，兔抗MMP2多克隆抗體稀釋倍數(shù)1∶2 000，兔抗MMP9多克隆抗體稀釋倍數(shù)1∶2 000)4℃孵育過夜、洗膜、二抗(羊抗鼠、羊抗兔二抗稀釋倍數(shù)均為1∶4 000)室溫孵育2 h，洗膜、成像，測(cè)量條帶灰度值并統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，計(jì)算LASS2蛋白、MMP2、MMP9相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 體外遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 用無血清RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24 h，消化、離心并重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/mL，混勻后取200 μL細(xì)胞懸液接種于Transwell小室上室，下室加入500 μL含20%FBS的培養(yǎng)基，輕輕搖勻后置入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室，倒置風(fēng)干，各孔加入適量0.1%結(jié)晶紫，染色30 min，PBS清洗并置顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取3個(gè)視野，拍照計(jì)數(shù)。每組設(shè)定3個(gè)復(fù)孔。

1.2.4.2 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 將Matrigel基質(zhì)膠置4℃條件下過夜融化，無血清RPMI 1640培養(yǎng)基與Matrigel按1∶8比例稀釋，混勻后均勻包被Transwell小室上室，37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)120 min，使Matrigel聚合成膠，按細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)步驟培養(yǎng)細(xì)胞24 h，取出Transwell小室，用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞，移去Transwell，倒置，風(fēng)干，各孔加入適量0.1%結(jié)晶紫，染色30 min，PBS清洗并置顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取3個(gè)視野，拍照計(jì)數(shù)。每組設(shè)定3個(gè)復(fù)孔。

1.2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞接種于6孔板中(密度1×105/孔)，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日細(xì)胞集合率為70%，用無菌100 μL槍頭垂直于板面沿培養(yǎng)板底劃線，棄培養(yǎng)基且PBS清洗3次，加入新鮮培養(yǎng)基后顯微鏡下記錄0h劃痕寬度，各組細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染Adv-GFP、Adv-LASS2-GFP并繼續(xù)培養(yǎng)24 h，測(cè)量遷移距離。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 RT-qPCR、WB法驗(yàn)證過表達(dá)LASS2 BCPAP細(xì)胞構(gòu)建成功 Adv- LASS2-GFP 、Adv-GFP轉(zhuǎn)染BCPAP細(xì)胞48 h后分別用RT-qPCR、WB法檢測(cè)3組細(xì)胞內(nèi)LASS2 mRNA及蛋白的表達(dá)量，結(jié)果示：Adv-LASS2-GFP組細(xì)胞中LASS2 mRNA及蛋白的表達(dá)水平均明顯高于NC組和Adv-GFP組，提示：過表達(dá)LASS2 BCPAP細(xì)胞構(gòu)建成功(見圖1)。

*：Adv-LASS2-GFP組分別與NC組、Adv-GFP組相比，P<0.05。圖1 RT-qPCR、WB分別檢測(cè)各組LASS2 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)水平

2.2 過表達(dá)LASS2對(duì)BCPAP細(xì)胞體外侵襲能力的影響 細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果示：與NC組、Adv- GFP組穿膜的細(xì)胞數(shù)(46.67 ±2.08、50.67 ±1.53)相比，Adv-LASS2-GFP組穿膜細(xì)胞的數(shù)(19.00±3.61)明顯降低，P<0.05。NC組與Adv-GFP組無明顯差異(P均>0.05)。結(jié)果表明：過表達(dá)LASS2可以有效抑制BCPAP細(xì)胞體外侵襲能力(見圖2)。

*：Adv-LASS2-GFP組分別與NC組、Adv-GFP組相比，P<0.05。圖2 體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組穿膜的細(xì)胞數(shù)

2.3 過表達(dá)LASS2對(duì)BCPAP細(xì)胞體外遷移能力的影響 細(xì)胞體外遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果示:與NC組、Adv- GFP組的穿膜細(xì)胞數(shù)(88.67±4.04、86.00 ±5.00)相比，Adv-LASS2-GFP組穿膜的細(xì)胞數(shù)(44.67±3.06)明顯降低，P<0.05。NC組與Adv-GFP組無明顯差異(P均>0.05)。結(jié)果表明：過表達(dá)LASS2可以有效抑制BCPAP細(xì)胞體外遷移能力(見圖3)。

*：Adv-LASS2-GFP組分別與NC組、Adv-GFP組相比，P<0.05。圖3 體外遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組穿膜的細(xì)胞數(shù)

2.4 過表達(dá)LASS2對(duì)BCPAP細(xì)胞劃痕的影響 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后， Adv-LASS2-GFP組細(xì)胞的劃痕寬度(198.33±6.51 μm)明顯高于NC組、Adv- GFP組細(xì)胞的劃痕寬度(92.67±3.51 μm、91.67±4.51μm)，P<0.05。NC組與Adv-GFP組無明顯差異(P均>0.05)。結(jié)果表明：過表達(dá)LASS2可以有效抑制BCPAP細(xì)胞體外遷移能力(見圖4)。

*：Adv-LASS2-GFP組分別與NC組、Adv-GFP組相比，P<0.05。圖4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞遷移能力

2.5 過表達(dá)LASS2對(duì)MMP2、MMP9表達(dá)的影響 Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示：Adv-LASS2-GFP組MMP2、MMP9蛋白的表達(dá)量明顯低于NC組、Adv- GFP (P<0.05，見圖5)。結(jié)果提示：過表達(dá)LASS2能抑制BCPAP細(xì)胞MMP2、MMP9蛋白的表達(dá)。

*：Adv-LASS2-GFP 組分別與 NC 組、Adv-GFP 組相比，P<0.05。圖5 過表達(dá)LASS2對(duì)MMP2及MMP9的影響

3 討論

TC的發(fā)病率逐年升高，發(fā)病隱匿，部分患者確診時(shí)已發(fā)生侵襲或轉(zhuǎn)移，TC發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移會(huì)影響患者預(yù)后及術(shù)后治療，研究TC侵襲及遷移的作用機(jī)制對(duì)TC在臨床上的診治有一定意義。TC的侵襲和轉(zhuǎn)移受多種因素影響，有研究表明，STAT3(傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3基因)、HOBX9等基因可抑制TC細(xì)胞遷移及侵襲能力[17-18]，BRAF基因、CRNDE基因(結(jié)直腸腫瘤差別表達(dá)基因)等基因促進(jìn)TC細(xì)胞遷移及侵襲[19-20]。TC細(xì)胞的遷移及侵襲能力可能是通過PI3K/AKT、Wnt等信號(hào)通路被調(diào)節(jié)[21-24]。

LASS2是一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，在細(xì)胞增殖、細(xì)胞侵襲和細(xì)胞遷移方面起到抑制的作用，并且還可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14]，目前研究均認(rèn)為L(zhǎng)ASS2是通過調(diào)節(jié)神經(jīng)酰胺合成、與囊泡型ATP依賴型質(zhì)子泵(V-ATPase質(zhì)子泵)的結(jié)合來發(fā)揮其功能。LASS2可以誘導(dǎo)神經(jīng)酰胺合成酶的活性，通過神經(jīng)酰胺的生物學(xué)作用抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[15]，與V-ATPase的c亞基(ATP6L)相互作用可抑制V-ATPase活性，使細(xì)胞外H+減少可抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲能力，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)H+累積可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[16]。但LASS2與TC侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系的相關(guān)研究相對(duì)較少。相關(guān)研究[10]表明沉默LASS2基因增加了V-ATPase活性及細(xì)胞外H+濃度，進(jìn)而激活分泌MMP-2和MMP-9分泌，導(dǎo)致增強(qiáng)前列腺癌(PCa)細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移；在Zeng等[ 25]關(guān)于LASS2和PTC的研究中，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)LASS2抑制PTC細(xì)胞增殖，并通過p53依賴性途徑引起B(yǎng)CPAP細(xì)胞G0/G1期阻滯。上述表明LASS2和PTC密切相關(guān)，但具體機(jī)制如何？MMP2、MMP9 是否作為調(diào)節(jié)因子參與其中？仍待進(jìn)一步研究。

為研究LASS2對(duì)PTC侵襲、遷移的影響，本實(shí)驗(yàn)采用Adv重組腺病毒載體構(gòu)建人源重組LASS2腺病毒表達(dá)載體，通過構(gòu)建過表達(dá)LASS2的BCPAP細(xì)胞，并將Adv-GFP、Adv-LASS2-GFP 腺病毒表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染 BCPAP細(xì)胞，分別采用 qRT-PCR和WB實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證LASS2在BCPAP細(xì)胞中過表達(dá)成功。分別設(shè)立實(shí)驗(yàn)組(Adv-LASS2-GFP)、空載組(Adv-GFP)和陰性對(duì)照組(NC)BCPAP細(xì)胞，進(jìn)而研究LASS2過表達(dá)對(duì)甲狀腺癌BCPAP 細(xì)胞遷移侵襲的影響。我們首先觀察到過表達(dá)LASS2對(duì)BCPAP細(xì)胞體外侵襲能力的影響，結(jié)果表明：過表達(dá)LASS2有效抑制了BCPAP細(xì)胞的侵襲能力(P<0.05)；同樣，在過表達(dá)LASS2對(duì)BCPAP細(xì)胞遷移能力影響實(shí)驗(yàn)中得到類似結(jié)果，(P<0.05)；最后在劃痕實(shí)驗(yàn)中觀察到LASS2上調(diào)能夠明顯抑制細(xì)胞遷移能力(P<0.05)。這與游海燕等[26]通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究LASS2對(duì)肝癌HCCLM3的生物學(xué)影響的結(jié)果類似。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)主要作用于腫瘤周圍的細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的IV型膠原和明膠，其中MMP2、MMP9是作用較強(qiáng)的一種,在多數(shù)腫瘤中均有一定表達(dá)。相關(guān)研究[27]結(jié)果表明，LASS2抑制細(xì)胞侵襲、遷移的機(jī)制可能與MMP-2和MMP-9有關(guān)，周少飛[28]發(fā)現(xiàn)甲狀腺癌組中MMP2、MMP9的表達(dá)均明顯增高，表明MMP2、MMP9和PTC的相關(guān)性。為研究LASS2抑制細(xì)胞遷移侵襲是否與MMP2、MMP9異常表達(dá)有關(guān)，我們采用WB檢測(cè)BCPAP細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白的相對(duì)表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：MMP-2和MMP-9在LASS2過表達(dá)組中的蛋白相對(duì)表達(dá)水平較Adv-GFP組和NC組中明顯下調(diào)(P<0.05)，表明過表達(dá)LASS2抑制BCPAP細(xì)胞的侵襲和遷移可能與MMP-2和MMP-9下調(diào)相關(guān)。

綜上所述，過表達(dá)的LASS2能有效抑制BCPAP細(xì)胞侵襲和遷移，作用機(jī)制可能與MMP-2和MMP-9表達(dá)下調(diào)相關(guān)，可能作為PTC的治療提供潛在的治療靶點(diǎn)。