麻小娟，楊 彬，茍婧琨

(遵義醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，貴州 遵義 563099)

1型糖尿病是以胰島β細(xì)胞損傷、胰島素絕對(duì)缺乏為特征的自身免疫病，患者血糖升高，兼具多飲、多食、多尿和體重減少的癥狀[1]。雖然各個(gè)年齡段的人群均具1型糖尿病的患病可能性，但該病好發(fā)于兒童和青少年，他們的血糖控制更加困難。目前基礎(chǔ)加餐時(shí)胰島素治療是1型糖尿病的首選胰島素治療方案，該方案的實(shí)施需要每日多次注射胰島素[2]，有用藥不方便的弊端。胰腺、胰島移植或者胰島β細(xì)胞再生治療給1型糖尿病治療帶來新的希望，然而移植手術(shù)存在創(chuàng)傷大、供體器官短缺等問題；并且胰島β細(xì)胞再生治療也仍存在很多技術(shù)壁壘[3-4]。目前尚無(wú)1型糖尿病有效的非注射、單藥口服治療方案。

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，建立1型糖尿病小鼠模型，探索降糖B套餐的降糖效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 18只7周齡雌性昆明小鼠(26±2g)由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，所用飼料為重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司提供的普通鼠料。

1.2 材料與儀器 羅氏血糖儀(卓越型，德國(guó))及試紙，鏈脲佐菌素(STZ，美國(guó) sigma 公司)；谷草轉(zhuǎn)氨酶試劑盒(AST,南京建成生物工程研究所)。降糖B套餐為食美萃健康管理咨詢有限公司提供的套餐，包括秘制營(yíng)養(yǎng)肉、月餅和雞蛋，圓包菜和黃豆購(gòu)自農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，其余試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 小鼠糖尿病模型的建立 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為兩組，空白對(duì)照組6只，建模組12只。參照陳冬志等報(bào)道的1型糖尿病小鼠建模方式[5]：注射前禁食8h，不禁水，每只小鼠注射1% STZ(60 mg/kg)，空白對(duì)照組小鼠腹腔注射相同體積建模劑(0.1 mol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉溶液)，連續(xù)注射 5 d。參照Lee等報(bào)道的模型納入標(biāo)準(zhǔn)[6]，從STZ注射開始連續(xù)4周進(jìn)行小鼠空腹血糖的周監(jiān)測(cè)，后2周空腹血糖值≥16.7 mmol/L的小鼠，隨機(jī)分為模型組和降糖B套餐治療組，每組6只。

1.3.2 降糖B套餐的使用 根據(jù)食美萃公司提供的方案，結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的問題(如有的小鼠對(duì)產(chǎn)品中的不同食物有喜好等)采取的喂養(yǎng)方式如下：降糖B套餐治療組每周周一到周五(除去周三)用降糖B套餐替換小鼠飼料，喂法為將3種產(chǎn)品按1∶1∶1(w/w/w)混合打碎，周三和周末兩天用蔬菜和煮熟的黃豆按1:1(w/w)替換小鼠飼料。其余各組小鼠正常喂養(yǎng)。各組小鼠提供自由飲水，干預(yù)期持續(xù)14 d。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè) 適應(yīng)期結(jié)束檢測(cè)并記錄各組小鼠空腹血糖濃度，作為初始血糖值。建模階段和降糖B套餐干預(yù)期每周固定時(shí)間監(jiān)測(cè)小鼠空腹血糖值，并記錄各組小鼠每天攝食、飲水情況、觀察墊料濕度、隔天稱重記錄體重值。降糖B套餐喂養(yǎng)第14天，小鼠摘眼球取血，4 ℃離心分離血清(3 000 rpm，10 min)，分裝后-20°C凍存，利用谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)小鼠肝功能。

1.3.4 組織標(biāo)本制備 降糖B套餐喂養(yǎng)第14天，取各組小鼠肝臟和胰腺，于4%多聚甲醛溶液固定30 h，作常規(guī)石蠟包埋、切片，經(jīng)HE染色、封片后用顯微鏡(Olympus公司)進(jìn)行觀察(×400)并拍攝圖像。

2 結(jié)果

2.1 成功建立糖尿病小鼠模型 隨著建模的進(jìn)行，模型組小鼠活動(dòng)減少，毛發(fā)發(fā)黃失去光澤。更換墊料發(fā)現(xiàn)模型組小鼠的墊料濕度明顯大于空白對(duì)照組，提示出現(xiàn)多尿的癥狀。血糖檢測(cè)結(jié)果顯示空白對(duì)照組小鼠連續(xù)28d血糖值較為平穩(wěn)，而建模組從第7天起血糖值與建模前相比出現(xiàn)顯著升高(P=0.000)。建模第14天到第28天血糖值變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。到建模第28天小鼠血糖均值達(dá)到24.44 mmol/L，見圖1。在血糖升高的同時(shí)，小鼠出現(xiàn)了體重減輕、攝食量和飲水量顯著增加的情況。說明小鼠模型建立成功。小鼠成模率為100%，期間無(wú)死亡現(xiàn)象。

2.2 降糖B套餐對(duì)1型糖尿病小鼠的干預(yù)作用

2.2.1 降糖B套餐對(duì)1型糖尿病小鼠血糖的干預(yù)作用 降糖B套餐間隔食用7 d就能夠顯著降低小鼠血糖(血糖均值從23.42 mmol/L降到18.25 mmol/L)，見表1。干預(yù)14 d后，模型組小鼠血糖持續(xù)升高，降糖B套餐治療組小鼠血糖維持在5.24 mmol/L的下降幅度，說明該降糖產(chǎn)品對(duì)1型糖尿病小鼠有很好的降糖效果。

表1 降糖B套餐對(duì)1型糖尿病小鼠血糖水平(mmol/L)的影響

*：與模型組相比，P<0.05；**：與模型組相比，P<0.01。

*：與建模前相比，P<0.05；**：與0d(a)/第1周(c和d)相比，P<0.01；##：與建模開始7d(a)/第2周(c和d)相比，P<0.01;△：與第3周相比，P<0.05。圖1 建模期間小鼠血糖、體重、攝食量和飲水量的變化情況

2.2.2 降糖B套餐對(duì)1型糖尿病小鼠攝食量和飲水量的影響 由于降糖套餐中含有的水分較多，而普通小鼠飼料為干料，不同干預(yù)組攝食、飲水量存在較大差異。為便于觀察各組小鼠攝食、飲水量隨干預(yù)時(shí)間的變化，將第1周的攝食、飲水量作為參考，計(jì)算出第二周與第一周的比值，見表2?？梢娊堤荁套餐治療組小鼠第二周攝食和飲水量均比第一周減少，且減少的幅度大于其它各組。

2.2.3 降糖B套餐對(duì)1型糖尿病小鼠胰腺組織病理學(xué)的影響 各組小鼠的胰腺HE染色觀察結(jié)果見圖2?？瞻讓?duì)照組小鼠胰島數(shù)量多，體積較大，形狀多為圓形或橢圓形，邊界清晰，胰島內(nèi)細(xì)胞大小均勻，排列整齊；模型組小鼠胰島數(shù)量明顯減少，胰島體積縮??；降糖B套餐治療組小鼠胰島體積較模型組增大，胰島內(nèi)細(xì)胞大小更加均勻。

表2 降糖B套餐對(duì)1型糖尿病小鼠攝食量和飲水量的干預(yù)作用

A:空白對(duì)照組；B：模型組；C：降糖B套餐治療組；HE ×400。圖2 降糖B套餐對(duì)小鼠胰腺組織病理學(xué)的影響

2.2.4 降糖B套餐對(duì)1型糖尿病小鼠肝臟組織病理學(xué)的影響 各組小鼠的肝臟HE染色結(jié)果見圖3。空白對(duì)照組小鼠的肝臟呈現(xiàn)索狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核大而圓；模型組小鼠肝臟索狀結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞核出現(xiàn)不同程度的腫脹或皺縮；降糖B套餐治療組小鼠肝臟有恢復(fù)索狀結(jié)構(gòu)的趨勢(shì)。提示降糖產(chǎn)品對(duì)糖尿病小鼠的肝臟可能具有一定保護(hù)作用。

A:空白對(duì)照組；B：模型組；C：降糖B套餐治療組；HE ×400。圖3 降糖B套餐對(duì)小鼠肝臟組織病理學(xué)的影響

2.2.5 降糖B套餐對(duì)1型糖尿病小鼠肝功能的影響 降糖B套餐對(duì)1型糖尿病小鼠肝功能的影響結(jié)果見圖4?？梢娊?jīng)過14d的治療，降糖B套餐治療組小鼠血清AST活性顯著低于模型組，提示該降糖產(chǎn)品對(duì)糖尿病小鼠的肝臟具有一定保護(hù)作用。

**：P<0.01。圖4 降糖B套餐對(duì)小鼠血清AST活性的影響

3 討論

糖尿病是當(dāng)前嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一，調(diào)查顯示2013年我國(guó)成人糖尿病的發(fā)病率高達(dá)10.9%[7]，且糖尿病發(fā)病率近年來呈迅速上升趨勢(shì)[8]，為國(guó)家和家庭帶來了沉重經(jīng)濟(jì)和醫(yī)療負(fù)擔(dān)。其中1型糖尿病由于體內(nèi)胰島素絕對(duì)缺乏，迄今尚無(wú)有效的非注射、單藥口服治療方案，注射外源胰島素是患者生命的基石。然而，外源胰島素治療存在很多弊端，如大多數(shù)患者難以達(dá)到精確的血糖控制、低血糖的出現(xiàn)、反復(fù)注射的痛苦、不能阻止遠(yuǎn)期并發(fā)癥的出現(xiàn)等[9]。據(jù)估計(jì)，到2035年，全球1型糖尿病患者數(shù)量將超過5.5億人[10]，因此對(duì)1型糖尿病有效單藥口服藥物的探索顯得尤為重要。

降糖B套餐藥方為山東省知名中醫(yī)張方來遺留，主要包括天花粉、麥門冬、山藥、鐵皮石斛、人參、山萸肉等已報(bào)道用于糖尿病治療的單味中藥[11-14]在內(nèi)的十余種中藥成分。食物基質(zhì)主要包括雜糧、肉類和雞蛋。

本課題實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，降糖B套餐在間隔食用7d可以降低小鼠血糖，食用14d后血糖與食用7d差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而，從小鼠攝食和飲水量的變化分析，食用降糖B套餐7d后小鼠的多飲、多食癥狀仍有明顯的改善，說明該降糖產(chǎn)品在食用7d后對(duì)STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病小鼠仍然發(fā)揮作用。1型糖尿病的發(fā)病是由于胰島損傷造成的胰島素分泌量絕對(duì)減少[15]，而小鼠胰腺HE染色結(jié)果顯示降糖B套餐治療組胰島較模型組有一定改善。推斷降糖B套餐可能是通過胰島修復(fù)干預(yù)1型糖尿病。

STZ是糖尿病動(dòng)物模型常用誘導(dǎo)劑，該藥物在損害胰腺的同時(shí)能夠造成肝損傷[16-17]，本課題通過肝臟HE染色和肝功能的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)降糖B套餐對(duì)1型糖尿病小鼠肝臟可能存在保護(hù)作用。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果為降糖B套餐對(duì)1型糖尿病小鼠治療效果的初探，對(duì)于糖耐量、胰島素耐量、毒副作用及相關(guān)信號(hào)通路等在后續(xù)研究中將針對(duì)性開展。