謝英偉 金世鵬 閆 偉 王 偉 平 浩 劉躍新

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院泌尿外科，北京 100730)

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是男性中常見的惡性腫瘤。我國前列腺癌發(fā)病率遠低于歐美國家，但近年來呈上升趨勢，且增長比歐美發(fā)達國家更為迅速，目前已成為泌尿系統(tǒng)中發(fā)病率最高的腫瘤[1-2]?；蛉诤鲜侵富蛟谌旧w上發(fā)生位置錯位、 融合的現(xiàn)象，從而產(chǎn)生新的融合基因，該基因可能具有新的功能。TMPRSS2-ERG(T-E)基因融合是前列腺癌中已知最常見的遺傳改變。TMPRSS2-ERG融合和隨后ERG蛋白的過表達已被證明與Wnt相關(guān)雌激素受體信號通路的上調(diào)以及腫瘤壞死因子和細胞死亡通路的下調(diào)有關(guān)[3]。然而TMPRSS2-ERG在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的生物學(xué)作用尚不清楚。目前研究者對該基因融合的各個方面進行了廣泛的探索，但一些基本知識仍然還不完整。特別是在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的前列腺癌組織中TMPRSS2-ERG融合基因的發(fā)生率以及對預(yù)后的影響。本研究利用FISH檢測50例伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移前列腺癌標(biāo)本中的TMPRSS2-ERG融合基因，并對其與前列腺癌臨床病理資料及治療預(yù)后的關(guān)系進行了分析。

1 對象與方法

1.1 研究對象

本研究以2008年1月至2012年12月于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院行根治性前列腺癌切除術(shù)+擴大盆腔淋巴結(jié)切除術(shù)的患者為研究對象。所有患者術(shù)前檢查包括盆腔電子計算機斷層掃描(computed tomography， CT)、磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)及骨掃描未發(fā)現(xiàn)有轉(zhuǎn)移證據(jù)，術(shù)后病理提示切除標(biāo)本有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前接受新輔助治療；(2)術(shù)后未行內(nèi)分泌治療。所有手術(shù)切除前列腺以及淋巴結(jié)標(biāo)本由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院泌尿外科病理科兩位資深醫(yī)師獨立閱片，同時按照2002年美國癌癥聯(lián)合委員會(The American Joint Committee on Cancer，AJCC)的 TNM分期系統(tǒng)進行臨床分期。

根治性前列腺切除術(shù)+擴大淋巴結(jié)清掃術(shù)：手術(shù)切除范圍包括完整的前列腺、雙側(cè)精囊和雙側(cè)輸尿管壺腹段、膀胱頸部。淋巴結(jié)切除范圍包括髂外、髂內(nèi)、閉孔、髂總與輸尿管交叉處。

隨訪：要求患者治療后的前 6個月中每個月復(fù)查1次前列腺特異性抗原(prostate specific antigen，PSA)，此后每3個月進行PSA等相關(guān)檢查。隨訪終點為病情進展成去勢抵抗性前列腺癌(castration resistant prostate cancer, CRPC)：①血清睪酮達到去勢水平(<5 ng/mL)；②連續(xù)3 次PSA較最低值升高超過50%，且PSA值>0.2 ng/mL。

1.2 實驗材料

標(biāo)本為前列腺癌根治術(shù)后前列腺及淋巴結(jié)組織石蠟包埋切片以及前列腺增生組織石蠟包埋切片、 二甲苯、去離子水、蛋白酶K、2×SSC(2×檸檬酸鈉緩沖液)、70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇、85%(體積分?jǐn)?shù))乙醇、100%(體積分?jǐn)?shù))乙醇、0.1% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))NP-40/2×SSC、20 μL DAPI(4,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚二鹽酸鹽)、TMPRSS2：ERG(北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司)。

1.3 實驗步驟

1.3.1 切片預(yù)處理

將組織切片(厚度為3 μm)置于56 ℃下烤片過夜；室溫下將組織切片浸于二甲苯中脫蠟2次，每次10 min，隨后浸入100%(體積分?jǐn)?shù))乙醇中5 min。室溫下將組織切片依次置于100%(體積分?jǐn)?shù))乙醇、85%(體積分?jǐn)?shù))乙醇和70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇中各2 min復(fù)水。將組織切片室溫浸入去離子水中3 min，然后95 ℃下用水處理組織切片20 min。取40 mg胃蛋白酶溶于40 mL 0.01 mol/L HCL得到胃蛋白酶工作液(1 mg /mL)；將組織切片浸泡在蛋白酶K工作液中，37 ℃下孵育8 min左右；組織切片經(jīng)蛋白酶K消化后，于2×SSC溶液中漂洗5 min。室溫下將組織切片玻片依次置于70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇、85%(體積分?jǐn)?shù))乙醇和100%(體積分?jǐn)?shù))乙醇中各2 min脫水；自然干燥玻片后，進行以下雜交變性。

1.3.2 變性雜交

將配制好的10 μL雜交探針緩沖液(2 μL探針和8 μL緩沖液)離心1～3 s，渦旋混勻后再次短暫離心；將10 μL 探針混合物滴加于玻片雜交區(qū)域，立即加蓋蓋玻片，用橡皮膠封邊；準(zhǔn)備水浴鍋、鐵板，共變性條件：86 ℃，10 min，然后放入濕盒雜交，雜交條件：42 ℃，16 h(注意保持濕盒里的濕度)。

1.3.3 玻片洗滌及復(fù)染

移去蓋玻片，將玻片置于46 ℃，0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NP-40/0.4×SSC溶液中，振蕩1～3 s，漂洗5 min；室溫下將玻片置于70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇中，漂洗3 min。暗處自然干燥玻片后，將20 μL DAPI復(fù)染劑滴加于雜交區(qū)域位置，立即蓋上蓋玻片。暗處放置10～20 min后，在熒光顯微鏡下選用合適的濾光片組觀察玻片，完成雜交的玻片置于-20 ℃避光儲存。為了長期保存還可以用中性樹膠將加蓋的蓋玻片四周密封，防止反復(fù)觀察移動蓋片。

1.4 FISH結(jié)果判讀

1.4.1 FISH技術(shù)對基因融合的檢測

TMPRSS2/ERG：正常時為兩個融合信號，即2個黃色信號；出現(xiàn)1個融合信號(即黃色)；1個綠信號時，提示ERG基因發(fā)生融合；1個融合信號，1個紅信號，1個綠信號，提示有ERG基因與其他基因的融合或重組。

1.4.2 建立閾值

隨機取前列腺增生病理石蠟標(biāo)本10例，制備玻片及進行FISH實驗。每份樣本隨機分析100個細胞，計算出顯示異常信號細胞數(shù)百分比的平均值及標(biāo)準(zhǔn)差，異常閾值定義為平均值+3倍標(biāo)準(zhǔn)差，即異常閾值=平均值(M)+3×標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。每例樣本隨機計數(shù)100個細胞，用異常閾值判斷檢測結(jié)果。檢測結(jié)果中顯示，異常信號細胞的計數(shù)的百分比大于閾值3.9%即為異常(例如：6%)，則判斷該患者存在融合基因，判定為陽性結(jié)果。檢測結(jié)果中顯示異常信號細胞計數(shù)的百分比小于閾值3.9%即正常(例如：3%)，則判斷該患者無融合基因的存在，判定為陰性結(jié)果。如果顯示異常信號方式細胞數(shù)的百分比等于閾值，加大檢測樣本的細胞數(shù)目，以判斷最后結(jié)果。利用FISH技術(shù)，對前列腺癌切片進行TMPRSS2/ERG基因融合狀況進行檢測，計算異常信號的百分比。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。使用Cohen的kappa統(tǒng)計量(k)評估原發(fā)腫瘤與轉(zhuǎn)移灶TMPRSS2-ERG融合基因之間的一致性。組間比較計量資料采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗。采用COX回歸分析影響患者生化復(fù)發(fā)的因素。患者疾病生化無復(fù)發(fā)生存期比較采用 Kaplan-Meier法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

本研究共納入50例患者，手術(shù)組的中位年齡為76(65～88)歲。原發(fā)腫瘤臨床分期pT2 6例， pT3a 23例， pT3b 21例。Gleason評分6分10例、7分26例、8分7例、9分7例。共切除淋巴結(jié)1 236枚，每例切除淋巴結(jié)19～32枚，平均22枚。共轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)1 236枚，每例轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)1～9枚，平均3枚。平均隨訪(30±12)個月，生化復(fù)發(fā)45例，死亡8例，前列腺癌特異性死亡4例。

在50例樣本中，19例(38%)在原發(fā)腫瘤中檢測到TMPRSS2-ERG融合基因，15例(32%)在淋巴結(jié)中檢測到TMPRSS2-ERG融合基因。一致性分析顯示，TMPRSS2-ERG融合基因在原發(fā)腫瘤及匹配淋巴結(jié)標(biāo)本中具有較高的一致性，Kappa=0.73(P<0.05)。10%的患者融合基因僅出現(xiàn)在原發(fā)腫瘤，2%的患者融合基因僅出現(xiàn)在轉(zhuǎn)移灶。詳見表1。

原發(fā)性腫瘤和相應(yīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的TMPRSS2-ERG融合基因陽性與陰性組之間腫瘤特征差異無統(tǒng)計學(xué)意義，詳見表2。

表2 TMPRSS2-ERG(T-E)融合基因陽性與陰性組之間的腫瘤特征Tab.2 Tumor characteristics between positive and negative groups of TMPRSS2-ERG fusion gene

單因素COX回歸分析顯示，患者無生化復(fù)發(fā)生存期與Gleason評分、分期、清掃淋巴結(jié)數(shù)、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)、原發(fā)腫瘤融合基因陽性、淋巴結(jié)融合基因陽性有關(guān)，詳見表3。多因素COX回歸分析顯示，患者無生化復(fù)發(fā)生存期與Gleason評分、原發(fā)腫瘤融合基因陽性有關(guān)，詳見表4。

單因素生存分析顯示，原發(fā)腫瘤中TMPRSS2-ERG融合基因陽性組比陰性組預(yù)后差，無生化復(fù)發(fā)生存率差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.01；圖1)。原發(fā)腫瘤/淋巴結(jié)TMPRSS2-ERG融合基因(+/+)組與原發(fā)腫瘤/淋巴結(jié)融合基因(+/-)組預(yù)后低于原發(fā)腫瘤/淋巴結(jié)融合基因(-/-)組，無生化復(fù)發(fā)率差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.03)。原發(fā)腫瘤/淋巴結(jié)TMPRSS2-ERG融合基因(+/+)組與原發(fā)腫瘤/淋巴結(jié)融合基因(+/-)組之間無生化復(fù)發(fā)生存率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.17；圖2)。

表4 多因素COX回歸分析患者無生化復(fù)發(fā)生存期影響因素Tab.4 Multivariate COX regression analysis of factors influencing patients without biochemical recurrence

圖1 原發(fā)腫瘤中TMPRSS2-ERG融合基因陽性組與陰性組無生化復(fù)發(fā)生存期Fig.1 Biochemical recurrence-free survival of the patients in the TMPRSS2-ERG fusion gene positive and negative groups with primary tumors

3 討論

TMPRSS2-ERG融合基因是前列腺癌中最常見的已知遺傳改變。自2005年Tomlins等[4]首次報道前列腺癌的跨膜絲氨酸蛋白酶編碼基因TMPRSS2-ERG與ETS轉(zhuǎn)錄因子家族成員ERG、ETV1等之間發(fā)生融合后，國內(nèi)外對融合基因及其蛋白表達在前列腺癌發(fā)病機制、檢測、診斷及預(yù)后判斷等方面做出了廣泛的研究。

TMPRSS2-ERG融合基因的發(fā)生率在不同人種之間存在明顯差異。歐美幾個研究中心樣本量超過500例的研究顯示，TMPRSS2-ERG融合基因發(fā)生率約為50%[5]。Furusato 等[6]利用ERG蛋白免疫組織化學(xué)法檢測230例日本前列腺癌標(biāo)本(包括穿刺和根治標(biāo)本)顯示陽性率為20.1%，Suh等[7]同樣利用ERG免疫組化檢測303例前列腺癌標(biāo)本顯示陽性率為24.4%。在中國人前列腺癌組織中，TMPRSS2-ERG融合基因檢出率分別為19.8%、23.2%、14.3%[8-10]。不同研究中心的檢測結(jié)果存在一定差異，這可能與研究的人種、標(biāo)本類型、樣本量大小、檢測方法等的不同相關(guān)。研究TMPRSS2-ERG融合基因在原發(fā)腫瘤及其轉(zhuǎn)移灶中的流行情況可能有助于進一步闡明該突變的生物學(xué)作用。目前關(guān)于TMPRSS2-ERG融合基因與PCa侵襲性的關(guān)系仍無定論[11-12]，但 Attard等[13]卻發(fā)現(xiàn)多數(shù)病情進展迅速的PCa患者存在TMPRSS2-ERG融合基因 mRNA大量復(fù)制，Gopalan等[14]的研究不僅證實了這一現(xiàn)象，而且還發(fā)現(xiàn)復(fù)制不是TMPRSS2-ERG融合基因的特異性擴增，而是染色體拷貝數(shù)的增加，從而導(dǎo)致遺傳學(xué)不穩(wěn)定性，進而促進PCa的侵襲進展。 另有研究[15-16]顯示，在多病灶的原發(fā)性PCa患者中，TMPRSS2-ERG融合基因陽性者外周轉(zhuǎn)移率較陰性者高；不同病灶位點各自克隆增生，并向外周轉(zhuǎn)移。在Perner等[17]的研究中，26例原發(fā)性前列腺癌與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的TMPRSS2-ERG融合基因狀態(tài)完全一致，他們認(rèn)為TMPRSS2-ERG融合基因陽性的病灶更容易出現(xiàn)淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移。劉彼得等[18]研究發(fā)現(xiàn)前列腺癌患者T-E融合基因的總陽性率為 40.0%， 其中轉(zhuǎn)移性 PCa 組、局限性 PCa 組及良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia,BPH)組分別為 45.0%、 30.0%、 0.0%。本研究選取的標(biāo)本為前列腺癌根治術(shù)后伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的標(biāo)本，原發(fā)腫瘤中TMPRSS2-ERG融合基因陽性率為38%。外周淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中TMPRSS2-ERG融合基因陽性率為30%。其中原發(fā)腫瘤與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中TMPRSS2-ERG融合基因一致性較好(Kappa為0.73)。這表明這種突變可能是特征性侵襲性腫瘤的特征。

圖2 原發(fā)腫瘤/淋巴結(jié)TMPRSS2-ERG融合基因(+/+)組、原發(fā)腫瘤/淋巴結(jié)融合基因(+/-)組與原發(fā)腫瘤/淋巴結(jié)融合基因(-/-)組無生化復(fù)發(fā)生存期Fig.2 Biochemical recurrence-free survival of primary tumors/lymph nodes TMPRSS2-ERG fusion gene (+/+) group, primary tumors/lymph nodes fusion gene (+/-) group and primary tumors/lymph nodes fusion gene (-/-) group

關(guān)于TMPRSS2-ERG融合基因在前列腺癌根治術(shù)中患者預(yù)后相關(guān)性的研究存在一定爭議。根據(jù)生存曲線，TMPRSS2-ERG融合基因是一個不好的[19]，好的[20]或無相關(guān)性的[14]預(yù)后因素。多項研究[21-26]顯示ERG蛋白表達與PCa的生化復(fù)發(fā)之間的關(guān)系是一致的。Hagen等[23]研究結(jié)果顯示，28例ERG水平高的患者中有13例(46.4%)復(fù)發(fā)，而25例ERG水平低的患者中只有3例(12%)復(fù)發(fā)(P=0.006)。Font-Tello等[24]觀察到在25例ERG陰性患者中有3例(12%)PSA進展，38例ERG陽性患者中有13例(34.2%)PSA進展(P=0.04)。但這些研究沒有特別關(guān)注患者的淋巴結(jié)狀態(tài)，以及分析TMPRSS2-ERG融合基因在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后中的作用。筆者的研究隊列非常適合評估這個未解決的問題。本研究納入的患者全部接受了根治性前列腺癌切除術(shù)+擴大盆腔淋巴結(jié)切除術(shù)，術(shù)后接受內(nèi)分泌治療。在隨訪過程中，90%的患者出現(xiàn)了生化復(fù)發(fā)。筆者在多因素分析中發(fā)現(xiàn)，原發(fā)腫瘤中TMPRSS2-ERG融合基因是患者生化復(fù)發(fā)的不良獨立預(yù)測因素。同時筆者在單因素生存分析中發(fā)現(xiàn)，原發(fā)腫瘤中TMPRSS2-ERG融合基因陽性組比陰性組預(yù)后差(P=0.01)。進一步分析發(fā)現(xiàn)，原發(fā)腫瘤/淋巴結(jié)TMPRSS2-ERG融合基因(+/+)組預(yù)后低于原發(fā)腫瘤/淋巴結(jié)融合基因(-/-)組，無生化復(fù)發(fā)率差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.03)。但原發(fā)腫瘤/淋巴結(jié)融合基因TMPRSS2-ERG(+/+)組與原發(fā)腫瘤/淋巴結(jié)融合基因(+/-)組之間無生化復(fù)發(fā)生存率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.17)。筆者認(rèn)為未來需要納入更多的病例以及延長隨訪時間來進一步分析。

綜上，本研究顯示TMPRSS2-ERG融合基因在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移前列腺癌中的陽性率為38%。原腫瘤與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中TMPRSS2-ERG融合基因具有較好的一致性(Kappa=0.73)。TMPRSS2-ERG融合基因是轉(zhuǎn)移性前列腺癌生化復(fù)發(fā)的不良預(yù)后因素。