尚雷鵬，劉金杰，張慶霞

（1.北京市海淀區(qū)公安司法鑒定中心，北京 100192；2.北京市公安司法鑒定中心，北京 100192）

1 dPCR技術簡介

1992年，SYKES等[1]使用有限稀釋、PCR和泊松分布模型的方法，檢測到了復雜背景下低豐度IgH重鏈突變基因，并對其進行了精細的定量研究。該研究提出了數(shù)字PCR的構想，與此同時闡明了dPCR檢測的原則:以“終點信號的有或無”作為定量方法，這是該方法被命名為dPCR技術的主要原因[2]。1997年，KALININA等[3]使用玻璃毛細管進行了微升級的PCR反應，通過使用熒光探針收集到了基因組DNA的單分子信號，進而促進了單分子定量技術的發(fā)展。1999年，VOGELSTEIN等[4]在分析結腸癌患者糞便，并檢測KRAS基因突變時，率先把樣本分配到384孔板中，然后對突變基因和正?；蚴褂貌煌瑹晒膺M行檢測，通過計算突變基因和正常基因的比例來得出突變率。基于該實驗方法的成功，他們正式提出了dPCR概念。目前，dPCR技術已經迅速發(fā)展成為一種核酸定量分析技術和核酸定量檢測技術。dPCR技術已經投入商業(yè)化生產，可以分成兩大類:微滴式 dPCR（droplet dPCR，ddPCR）和芯片式 dPCR （chip dPCR，cdPCR）技術。

2 dPCR技術原理

dPCR采用直接計數(shù)目標分子數(shù)而不依靠任何校準物或外標，通過計數(shù)單個分子從而實現(xiàn)絕對定量。dPCR將傳統(tǒng)PCR的指數(shù)數(shù)據(jù)轉換成數(shù)字信號，僅僅通過顯示程序設定的循環(huán)數(shù)后擴增是否發(fā)生，即可達到核酸的絕對定量。dPCR通過“油包水”的形式將反應體系分割成一個個小微滴，然后進行PCR擴增，并對所發(fā)生的擴增反應樣品進行計數(shù)[5]。dPCR在進行擴增反應前，將含有DNA模板的PCR溶液稀釋后分布到大量的獨立反應室，單分子間通過稀釋分離，并且獨自進行PCR擴增，最后分析每個擴增產物。具體而言，就是采用“分而治之”的檢測策略:將起始待測模板細分為若干小份，使每1份中至多分配到1個核酸分子，在每個小份中使得單個拷貝核酸分子進行PCR反應，最后計數(shù)有擴增反應小份的數(shù)量即可確定目標模板拷貝數(shù)。這種核酸定量方法實現(xiàn)了對單個DNA分子的擴增反應和檢測，每個模板 DNA分子的反應結果，根據(jù)有無熒光信號分別標記陽性微滴為“1”，陰性微滴為“0”，計數(shù)結果根據(jù)泊松分布原理以及陽性微滴的比例，進而計算出待檢靶分子的濃度或拷貝數(shù)[6-7]。這實現(xiàn)了通過先于PCR擴增的樣品分離。這種樣品的分配可以消除本底信號的影響，提高低豐度靶標的擴增靈敏度，簡單計算出DNA的模板拷貝數(shù)而不需要采用參考標準物或者外標。因此，dPCR技術是一種對待測核酸分子進行絕對定量的方法[8]。

3 dPCR技術的特點及其應用于法醫(yī)學的可行性

與傳統(tǒng)PCR技術相比，dPCR具有高靈敏度、高精確度、高耐受性和絕對定量的優(yōu)點，成為了法醫(yī)學研究中的重要工具。

3.1 高靈敏度

在法醫(yī)學實際案件中，常見的脫落細胞等接觸類檢材最為常見，通常其模板量低而不易獲得。而dPCR技術通過“油包水”的形式將反應體系進行微滴分割，每個微滴獨立進行PCR反應，經過40～45個循環(huán)的擴增，不僅能消除本底信號的影響，而且能提高低豐度靶標的擴增靈敏度，特別適用于痕量待測樣品。傳統(tǒng)的毛細管電泳和定量PCR的檢測靈敏度約為0.1%～1%；二代測序的靈敏度可達到10%；而最新的QX200微滴式數(shù)字PCR在高豐度野生型序列構成的干擾背景中檢測低頻率的突變序列，靈敏度可達到0.001%～0.0001%?；诖耍琩PCR技術還可以實現(xiàn)檢測大量樣品中的微量待測分子的目的，在病原微生物的檢測中有著廣泛的應用[9-10]。

3.2 高精確度

dPCR技術在計算數(shù)萬個反應單元中陽性反應單元的數(shù)量和比例時，能夠精確地檢測出變化微小的目的序列差異。目前對于低豐度目標序列的檢測，背景DNA會干擾定量 PCR、雜交、毛細管測序及NGS等方法，使其精確度檢測不夠準確。而經過微滴化處理的微滴式dPCR系統(tǒng)可將稀有核酸序列與大量的背景DNA分開，最終提高檢測的精確度及重復性。

3.3 高耐受性

在dPCR技術的第一步反應體系分配過程中，某些反應單元會一定程度地富集低豐度的目的序列。在該類反應單元中低豐度的目的序列會顯著地降低背景序列和抑制物對反應的干擾；dPCR技術對每個反應單元的結果判讀簡單，僅需要判斷陽性／陰性狀態(tài)即可。因此，基于dPCR技術對背景序列和抑制物的高度耐受能力以及無需依賴Ct值，很少受擴增效率影響的特點，使得在法庭科學案件的檢測當中dPCR技術較之于常規(guī)PCR技術具有很大的優(yōu)勢。

3.4 絕對定量

在法醫(yī)學應用中，該技術的絕對定量優(yōu)勢體現(xiàn)在當應用dPCR直接計算目的序列的拷貝數(shù)時，無需依賴Ct值和標準曲線就可以進行精確的絕對定量檢測，其精確定量能力優(yōu)于常規(guī)的RT-PCR技術。

4 dPCR技術在法醫(yī)學中的實際應用

4.1 dPCR技術在下一代測序方面的應用

二代測序文庫的定量是確保測序平臺準確、高效的重要前提，dPCR為高通量測序提供了靈敏的和絕對的校準[11]。下一代測序（next generation sequencing,NGS）如 454，Solexa和 SOLiD平臺需要通過測序校正分子數(shù)量。然而，dPCR可以精確定量454和Solexa測序文庫，使其制備達到納克級，同時在儀器滴定的成本和時間方面節(jié)省了花費。

WHITE等[12]的研究結果首次證明了使用454平臺進行皮克級DNA樣品測序，在無預擴增時對DNA樣品的需求量降為原來的1/1000以下。dPCR技術實現(xiàn)了測序文庫的絕對定量，消除了一些不確定因素如構建和PCR定量標準曲線等，相對標準偏差低于10%，無滴定情況下，符合直接測序的精度要求。dPCR微滴擴增產物可以方便回收，為測序文庫預擴增提供了新的手段，有利于減少擴增偏好性的不利影響，增加稀有序列的覆蓋度，對稀有突變和拷貝數(shù)變異具有極大的優(yōu)勢。

TOSHIKATSU MITSUI等[13]首次采用 NGS對甲狀旁腺功能減退癥病人進行了全基因組測序，測序結果發(fā)現(xiàn)GCM2相關的突變。在對該突變位點進行確認的時候采用了aCGH和微滴式數(shù)字PCR兩種不同的平臺。aCGH未能確認 NGS的結論，但是ddPCR的結果完美地支持了NGS的推論。這也是首次采用ddPCR方法驗證NGS發(fā)現(xiàn)的亞微觀水平的缺失。

4.2 dPCR技術在種屬鑒定和定量方面的應用

目前常用的方法有毛細管電泳法和實時熒光定量PCR技術。但這兩種檢驗方法對于樣本DNA的含量要求拷貝數(shù)高于十個拷貝且實時熒光定量PCR技術只能進行相對定量，所得結果易受多種因素影響[14]。

微滴式dPCR技術，是將樣本通過微滴發(fā)生器進行微滴化處理，制成若干微滴后進行的 PCR反應。 PCR反應結束后，由微滴檢測器對每個微滴逐個檢測，最終經分析軟件計算出目標DNA分子的濃度（copies/μL）[15]。微滴式數(shù)字PCR 技術與傳統(tǒng)方法相比，在低濃度樣本檢測中，具有更高的靈敏度和穩(wěn)定性。

實時熒光定量PCR等傳統(tǒng)方法因受到非目標DNA或雜質的干擾，使得檢測靈敏度及精確性都達不到精細定量的要求，而微滴式數(shù)字PCR通過微滴化處理，使得目標片段從大量的非目標DNA或雜質中分離出來，在單個微滴中獨立地進行PCR反應，從而提高了檢測的靈敏度[16-17]。當模板DNA濃度低到個位數(shù)拷貝每微升的時候，檢測結果會出現(xiàn)一定的偏差，這和模板DNA稀釋過程中的誤差、樣本加入時的取樣誤差相關。

4.3 dPCR技術在病原微生物的檢測的應用

2016年5 月，美國奧巴馬政府宣布美國國家微生物組計劃啟動，微生物組學研究成為熱點。dPCR技術高通量擴增和分析的優(yōu)點使同時研究自然界的多個細菌單細胞的多個不同基因得以實現(xiàn)。利用dPCR靈敏度高的特點，可以對各種樣品中的病原微生物展開廣泛的研究，還有可能在宏基因組學的研究中對低豐度、特定種屬的微生物進行檢測，彌補NGS的不足。如HIV抗逆轉錄病毒治療過程中病毒殘留量的監(jiān)控；HBV耐藥突變的檢測；HCV的分子分型；抗甲氧西林金黃色葡萄球菌的院內感染監(jiān)控；環(huán)境微生物不同功能基因之間的連鎖分析等等。dPCR技術無需核酸標準品和標準曲線即可實現(xiàn)對病原微生物的絕對定量，有利于不同環(huán)境檢測機構間的數(shù)據(jù)比較和分析，為危害公共衛(wèi)生安全的疾病的防控提供量化標準和參考。

另外，dPCR技術對 PCR抑制物不敏感，能克服環(huán)境樣本（如污水、污泥、土壤等）中大量含有的抑制物的影響，高靈敏的檢出可能存在的病原微生物，實現(xiàn)超早期準確預警。NEJC RACKI等[9]通過對梯度稀釋的輪狀病毒RNA和不同濃度污水處理廠廢水組合樣本的系統(tǒng)測試，以及不同地表水樣本的實際檢測，利用ddPCR單分子計數(shù)的定量方式，在無標準品校正情況下不僅實現(xiàn)了對微量病毒高靈敏的絕對定量檢出，同時展示出 qPCR不可比擬的重復性及精確度，以及對廢水中 PCR抑制物的耐受能力。

4.4 dPCR技術在甲基化水平分析檢測的應用

DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾，是表觀遺傳學（Epigenetics）的重要組成部分。在法庭科學領域，DNA甲基化在組織體液鑒定、同卵雙生子鑒定、年齡推斷、性別推斷和親子鑒定等方面具有一定的應用價值，有望成為一種新的法醫(yī)學遺傳標記。以目前法庭科學領域的熱點、難點問題同卵雙生子鑒別為例，表觀遺傳研究顯示，同卵雙生子雖具有完全相同的基因組DNA，但同卵雙生子個體間DNA甲基化和組蛋白乙酰化差異顯著，某些CpG島區(qū)域的甲基化程度差異甚至超過了無關個體間的差異[18]。

OLLIKAINEN等[19]研究發(fā)現(xiàn)，同卵雙生子新生兒不同組織IGF/H19相關的4個差異甲基化區(qū)域的甲基化狀態(tài)有顯著差異，并認為DNA甲基化可作為同卵雙生子個體甄別的有效生物學標記。然而現(xiàn)有的甲基化水平分析方法存在回收率不高，會造成大量 DNA的損失；轉化效率不穩(wěn)定，轉化不徹底或轉化過度；DNA的降解和處理中片段化等問題，降低了后續(xù)分析的準確度。而微滴式dPCR系統(tǒng)憑借其優(yōu)異的靈敏度、精確度和對目標因子的絕對拷貝數(shù)定量的特性，為甲基化程度的精確分析提供了一種新的方法。

KUNIO MIYAKE等[20]對一對患有雷特氏綜合癥的同卵雙生雙胞胎進行了基因組學以及表觀遺傳學的研究，文章對該雙胞胎姐妹（其中一個為非典型 RTT，另一個為典型RTT）采用了第一代毛細管測序，二代測序、SNP和 CNV芯片、基因組 DNA甲基化芯片、定量 PCR以及微滴式數(shù)字 PCR（QX100）各種分析方法，得出結論:是表觀遺傳學水平上的差異，導致了 2姐妹不同的臨床表現(xiàn)，而非基因組水平上的差異。表觀遺傳學上的差異也許主要源自 X染色體失活。TODD BLEVINS[21]率先將ddPCR技術應用到植物學（擬南芥）檢測領域，文章鑒定了脫乙酰化酶 6（HDA6）和甲基化轉移酶MET1之間的關系。他們發(fā)現(xiàn)這兩種酶在維持甲基化中的伙伴關系，可以解釋導致沉默位點識別的表觀遺傳記憶永久性，并解釋這兩種植物特異基因沉默酶的招募基礎。研究人員利用 QX100微滴式數(shù)字PCR對相關基因的表達水平進行了分析，以判斷相關基因沉默發(fā)生與否。

4.5 dPCR技術的挑戰(zhàn)與展望

盡管dPCR概念的提出至今已經有二十多年，但其應用仍處于初級階段，其在法醫(yī)學領域面臨很大的挑戰(zhàn)[22-25]。如dPCR技術并不成熟，微滴發(fā)生與制備技術的不完善，所使用的現(xiàn)行儀器并不能實現(xiàn)更多微滴的產生。另外，微滴檢測的絕對定量能力方面仍需要進一步的提升。

綜合dPCR技術的特點和優(yōu)勢，dPCR具有測量獨立性與無需任何校準物的特點。因此，該技術是潛在的核酸測量基準方法，并從原理上為核酸計量提供了保證。相比其他方法，dPCR作為絕對定量方法能準確定量目標DNA和提供可靠的定量數(shù)據(jù)。dPCR技術已經在二代測序文庫制備及驗證、種屬鑒定、病原微生物檢測、甲基化分析檢測、稀有突變檢測及復雜樣本基因表達檢測等方面有著廣泛的應用。dPCR技術作為一個嶄新的檢測技術平臺，開辟了一種全新的技術思路和手段，因此在未來幾年內，dPCR有望從一種小眾的技術手段發(fā)展成為實驗室的標準工具，其應用領域的不斷拓展，必然會促進法醫(yī)學的發(fā)展。