李牧洋，王婷婷，2,陳 波△,李檸岑,卓雪茂,邢立瑩,陳澤林

1.天津中醫(yī)藥大學(xué)(天津301617)；2.遼寧省大連市婦幼保健院(大連 116033)

外泌體(Exosomes)是一種由細(xì)胞內(nèi)多囊泡體(Multivesicular body，MVB)與細(xì)胞膜融合后釋放到細(xì)胞外環(huán)境中的脂質(zhì)雙分子膜包裹的小囊泡，最早發(fā)現(xiàn)于體外培養(yǎng)的綿陽紅細(xì)胞上清液中[1]，隨后，在血液[2]、尿液[3]、乳汁[4]、羊水[5]中陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。外泌體可攜帶蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNA及microRNA等大量細(xì)胞內(nèi)生物信息，是生物體細(xì)胞間通訊的重要方式，是神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫不同細(xì)胞及系統(tǒng)之間信息交互的重要載體[6]。 “信息傳遞新方式——細(xì)胞囊泡運(yùn)輸”的發(fā)現(xiàn)2013年被授予諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎，使得囊泡研究成為醫(yī)學(xué)及生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)。

最新研究表明，過往發(fā)現(xiàn)的與針刺鎮(zhèn)痛密切相關(guān)的內(nèi)源性活性物質(zhì)也存在Exosomes運(yùn)輸形式。如Schuler等[7]人發(fā)現(xiàn)外泌體可作為阿片受體(MOR) siRNA的載體，透過血腦屏障治療嗎啡成癮。Arslan等[8]人發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞來源的Exosomes可以釋放ATP，減弱氧化應(yīng)激，激活PI3K/Akt通路起到心肌保護(hù)作用。Clayton等[9]人發(fā)現(xiàn)外泌體所含酶的活性決定了細(xì)胞外腺苷的含量，外泌體是腺苷轉(zhuǎn)運(yùn)的重要方式。以上實(shí)驗(yàn)都提示，與針刺鎮(zhèn)痛密切相關(guān)的諸多活性物質(zhì)可能存在共通的運(yùn)輸載體——Exosomes。本實(shí)驗(yàn)探討針刺對不同狀態(tài)(正常、佐劑性關(guān)節(jié)炎)大鼠血清中外泌體表達(dá)的影響。

材料與方法

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物:實(shí)驗(yàn)選用清潔級雄性健康Wistar大鼠60只，體重(220±10)g，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動物中心[許可證號：SCXK(軍)2014-0001]。

1.2 主要儀器與試劑:全自動凝膠成像儀(美國BIORAD公司)，化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀(美國Thermo Scientific公司)，0.22μm一次性濾膜(PALL，美國)，ExoQuick Precipitation試劑盒(美國SBI公司)，BCA蛋白定量試劑盒(武漢博士德公司)，鼠抗人CD63一抗(Abcam，英國)，羊抗鼠二抗(Affinity，中國)，CD63試劑盒(美國SBI公司)。

2 方 法

2.1 動物分組:針刺正常大鼠，將大鼠分為空白對照組(Control組)、正常+電針1 d組(EA1day)、正常+電針5 d組(EA5day)，每組4只，共12只。

針刺模型大鼠，將大鼠分為鹽水組、模型、模型針刺組，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組4只，共48只。

2.2 模型制備:將正常Wistar大鼠右后足足底注射完全弗式佐劑0.1 ml/只復(fù)制大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎動物模型。

2.3 干預(yù)方法:正常+電針組是在正常大鼠基礎(chǔ)上單純給予足三里-環(huán)跳穴電針刺激分別為1 d和5 d。給予模型針刺組1 d、5 d、10 d、20 d四個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的治療，鹽水組大鼠則于右后足同部位注射等量生理鹽水。

2.4 針刺操作:取雙側(cè)足三里穴(腓骨小頭前下5 mm處)、環(huán)跳穴(股骨大轉(zhuǎn)子和最后骶椎連線的外1/3處)，采用華佗牌一次性不銹鋼針灸針(0.25×13 mm)。進(jìn)針并后連接華佗牌SDZ-V型電子針療儀(上海寰熙醫(yī)療器械有限公司)刺激雙側(cè)穴位，足三里穴接正極，環(huán)跳穴接負(fù)極。參數(shù)為：疏密波，頻率2/10Hz，強(qiáng)度5/10/15(0.76/1.53/2.3 mA)，各10 min，共30 min。

2.5 外泌體提取:正常+電針組于針刺后取腹主動脈血液，離心取血清(4℃，2000 g×10 min)。鹽水組、模型、模型針刺組在造模/鹽水注射后1 d、5 d、10 d、20 d分別取大鼠腹主動脈血，靜置2 h后置于離心機(jī)上，4℃，2000 g×10 min，提取上層血清約2 ml，分裝于EP管中，每管500 μl，于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

從-80℃冰箱中取出血清500 μl，以3000×g，4℃，離心15 min，棄沉淀，保留上清；將上清液過0.22 μm一次性濾器，收集濾液，約300 μl。參照實(shí)驗(yàn)說明書，加入沉淀劑(ExoQuick Precipitation)，血清∶沉淀劑=4∶1，蓋緊管蓋，顛倒混勻3次。置于4℃冰箱過夜反應(yīng)，至少12 h，將孵育好的樣品以1500×g，4℃，再次離心30 min，去除上清后留取沉淀，此時(shí)的沉淀即為Exosomes小顆粒(含有部分細(xì)胞碎片)，將沉淀用100 μl 1×PBS重懸。

2.6 Western blot檢測外泌體特異性標(biāo)志蛋白:SDS-PAGE凝膠電泳及圖像分析：將提取的外泌體加入1/4體積的RIPA蛋白裂解液，使用BCA法測定蛋白濃度。根據(jù)BCA蛋白定量結(jié)果調(diào)整蛋白濃度，加入5×loading buffer，97 ℃煮沸5 min，上樣。4%濃縮膠低電壓80V電泳30 min，隨后轉(zhuǎn)120V電壓，電泳80 min，室溫下以0.25%考馬斯亮藍(lán)染液染色2 h，烤染脫色液脫色2 h，Bio-Rad凝膠成像儀掃描并分析圖像。

Western blot檢測外泌體表面CD63：如前所述進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白分離后將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜。以5% BCA(1×TBST，含0.05%Tween-20)室溫封閉2 h。室溫避光加入一抗(孵育鼠抗人CD63抗體，1∶2500)，4℃過夜。1×TBST洗膜后(5 min×6)，室溫避光加入二抗(HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG1∶5000)，室溫孵育1 h，洗膜，滴加預(yù)混化學(xué)發(fā)光底物于PVDF膜，暗室曝光。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,多組(≥3)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。使用LSD檢驗(yàn)法，正態(tài)分布的各項(xiàng)統(tǒng)計(jì)指標(biāo)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 電針對正常大鼠血清外泌體表達(dá)水平的影響 對正常大鼠持續(xù)電針發(fā)現(xiàn)：針刺1 d后，血清中外泌體水平顯著升高。針刺5 d后，外泌體繼續(xù)升高，說明電針可能促進(jìn)了正常大鼠血清外泌體釋放(圖1)。

圖1 電針正常大鼠足三里-環(huán)跳穴對血清exosome表達(dá)的影響

2 電針對CFA大鼠血清外泌體表達(dá)水平的影響 造模后(急性炎性狀態(tài)下)，大鼠血清中外泌體較鹽水組升高，針刺1 d后，外泌體降低。針刺5 d后，模型組與電針組仍高于對照組，電針組略高于模型組。針刺10 d后，大鼠踝關(guān)節(jié)局部轉(zhuǎn)為慢性炎癥，模型組與電針組血清中外泌體較對照組降低，且二者比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。針刺20 d后，模型組與電針組仍低于對照組，但電針組明顯高于模型組，且接近于對照組。CFA致炎后，炎癥急性發(fā)展期，大鼠血清中與炎癥密切關(guān)聯(lián)的外泌體可能大量釋放，電針在此過程中可能抑制在炎癥初期與病理模型密切相關(guān)的外泌體的釋放。在炎癥后期，電針?biāo)碌牧夹匝装Y反應(yīng)可能釋放與電針抗炎相關(guān)的外泌體，以抑制模型炎癥過程(圖2)。

圖2 電針佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠足三里-環(huán)跳穴對血清外泌體表達(dá)的影響

討 論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種以侵蝕性關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的自身免疫病,基本病理表現(xiàn)為滑膜炎、血管翳形成,并逐漸出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨和骨破壞,最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失,可并發(fā)肺部疾病、心血管疾病、惡性腫瘤及抑郁癥等[10-11]歷代文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎屬于中醫(yī)“骨痹”范疇，或成為“膝痹”，其致病之本為肝、脾、腎虧虛，加之外感風(fēng)寒濕邪，氣血瘀滯，痰濕阻絡(luò)，不通則痛，發(fā)為本病。

本研究選取足三里穴和環(huán)跳穴予以相應(yīng)治療，足三里為強(qiáng)身健體之要穴，具有調(diào)理脾胃、通經(jīng)活絡(luò)、補(bǔ)中益氣、扶正祛邪的作用。針刺足三里補(bǔ)益氣血，可有效延緩膝關(guān)節(jié)炎的癥狀加重?！鹅`樞》：“著痹不去，久寒不已，卒取其三里骨為干?！睆?qiáng)調(diào)足三里對著痹，即關(guān)節(jié)炎類疾病有獨(dú)特療效?！夺樉募滓医?jīng)》：“脛痛不可屈伸，痹不仁，環(huán)跳主之?！薄断胭x》：“冷風(fēng)冷痹疾難愈，環(huán)跳腰間針與燒。”說明針灸對痹癥所致的麻痹不仁、纏綿難愈具有一定作用[12]。

本研究以外泌體特有的標(biāo)記蛋白 CD63為標(biāo)志物進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)電針可促進(jìn)正常大鼠血清外泌體釋放，且在D1-D5范圍內(nèi)，外泌體表達(dá)隨著針刺次數(shù)增加而升高；在佐劑性關(guān)節(jié)炎炎癥急性發(fā)展期，電針可抑制與炎癥密切相關(guān)的外泌體釋放，在炎癥后期，電針刺激可能釋放與電針抗炎有關(guān)的外泌體，起到抑制炎癥的作用[13-15]。

外泌體是所有細(xì)胞分泌的納米級微囊泡，細(xì)胞間通訊的重要方式，是神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)的重要載體，過往發(fā)現(xiàn)的與針刺鎮(zhèn)痛密切相關(guān)的內(nèi)源性活性分子也以外泌體方式傳遞信息。電針激活神經(jīng)系統(tǒng)在健康或者是疼痛的情況下是各不相同的，并且可以同時(shí)減輕痛感覺和痛反應(yīng)。在生理狀態(tài)下，持續(xù)電針大鼠發(fā)現(xiàn)：針刺1 d后，血清中外泌體水平升高顯著。針刺5 d后，外泌體繼續(xù)升高，說明電針能有促進(jìn)正常大鼠血清外泌體釋放的趨勢。在此過程中，外泌體中攜帶的活性鎮(zhèn)痛物質(zhì)(如阿片肽、ADO、5-HT、SP等)可能參與了大鼠足底熱輻射痛的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。在病理狀態(tài)下，造模后，大鼠血清中外泌體較鹽水組升高顯著，針刺1 d后，外泌體降低。針刺5 d后，電針組持續(xù)升高。針刺10 d后，大鼠踝關(guān)節(jié)局部轉(zhuǎn)為慢性炎癥，模型組與電針組血清中外泌體較對照組降低，且二者無顯著差異。針刺20 d后，電針組明顯高于模型組，且接近于鹽水組。由此猜測，CFA致炎后，炎癥急性發(fā)展期，大鼠血清中與炎癥密切關(guān)聯(lián)的外泌體可能大量釋放，電針在此過程中可能抑制在炎癥初期與病理模型密切相關(guān)的外泌體的釋放。在炎癥后期，電針?biāo)碌牧夹匝装Y反應(yīng)可能釋放與電針抗炎相關(guān)的外泌體，以抑制模型炎癥過程。

以往大量研究表明，電針的啟效機(jī)制是通過神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)模式來達(dá)到鎮(zhèn)痛、抗炎效應(yīng)，而外泌體是神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)細(xì)胞間通訊的重要方式，與炎癥相關(guān)的多種生物分子，如CGRP、NE、IL、TNF-α等化學(xué)物質(zhì)，這些信號分子可以將針刺信息級聯(lián)放大， 激活人體神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)發(fā)揮針刺網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)效應(yīng)[16-17]，故推測外泌體攜帶多種特定的信息進(jìn)行體內(nèi)長距離的運(yùn)輸，其內(nèi)含物質(zhì)在針刺傳導(dǎo)的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)中可能發(fā)揮重要作用[18-19]。外泌體內(nèi)含物質(zhì)作為供體和受體細(xì)胞生理調(diào)節(jié)物，參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和功能的許多方面，包括突觸溝通、調(diào)節(jié)突觸的強(qiáng)度、神經(jīng)再生、神經(jīng)退行性疾病、腦腫瘤進(jìn)展等[20]。 同時(shí)， 外泌體還可以通過細(xì)胞間物質(zhì)的運(yùn)輸和交換進(jìn)行內(nèi)分泌及免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)、 擴(kuò)增和/或調(diào)節(jié)[21]， 如中性粒細(xì)胞衍生的胞外囊泡的定向運(yùn)輸使血小板介導(dǎo)先天免疫反應(yīng)等[22],針刺的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)是復(fù)雜的，而這種復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)之中相互關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵物質(zhì)啟效時(shí)間必然存在差異。我們前期研究發(fā)現(xiàn)相比于電針鎮(zhèn)痛效應(yīng)，抗炎效應(yīng)出現(xiàn)較晚且較為持久，這可能與外泌體攜帶的信息物質(zhì)有關(guān)。為了維持機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡，抑制炎癥早期出現(xiàn)的疼痛反應(yīng)，外泌體攜帶的信息以“鎮(zhèn)痛”為主要目標(biāo)，隨著炎癥發(fā)展，鎮(zhèn)痛已不能滿足機(jī)體自身對于穩(wěn)態(tài)失衡的調(diào)節(jié)，繼而以“抗炎”為主要任務(wù)。