李 玲，呼興華，吳 永，張選國△

1.陜西省中醫(yī)醫(yī)院老年病科 (西安710003)；2. 陜西省中醫(yī)藥研究院文獻(xiàn)所 (西安710003)；3.陜西省中醫(yī)藥大學(xué)2016級(jí)研究生 (咸陽 712046)

阿爾茲海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病。其主要臨床表現(xiàn)為認(rèn)知障礙、行為異常、忽視親屬、無法照顧自己。它給社會(huì)和家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)。

因此目前對(duì)AD發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)及其治療顯得尤為重要。AD的主要病理特征是Aβ淀粉樣蛋白沉積形成的老年斑和過度磷酸化的Tau蛋白形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)。隨著AD的發(fā)展和完善，炎癥反應(yīng)理論越來越受到人們的關(guān)注[1]。何明大主任醫(yī)師的經(jīng)驗(yàn)用方腦靈湯，其組成為淫羊藿、何首烏、白參、紅景天等藥,其功能為補(bǔ)腎益氣填髓、活血開竅祛痰。通過查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷、紅景天苷均能抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生[2-3]。為了觀察腦靈湯對(duì)AD模型大鼠的保護(hù)作用及其初步探討相關(guān)的炎癥機(jī)制，采用雙側(cè)海馬CA3區(qū)注射Aβ1-42[4]。具體方法及結(jié)果如下。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)Sprague-Dawley (SD)大鼠40只(280±30 g，雌雄各半)，由中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物條件符合國家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》，湘雅二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室,濕度控制在45%～60%,溫度在20℃～30 ℃，明暗比為1∶1，白12 h夜12 h。

2 藥物及試劑 腦靈湯組成為淫羊藿、紅景天、何首烏、白參等八味藥,由中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院藥劑科提供。腦復(fù)康片杭州民生藥業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn),批號(hào):080315。Aβ1-42、一抗NF-κB(p65)、一抗IκBа均購于北京博奧森生物公司，余常規(guī)試劑均來源中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室。

3 方 法

3.1 造模方法：首先使用10%水合氯醛(350 mg/kg)按大鼠體重計(jì)算對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，將其固定在腦立體定位儀上，正中豎著劃開長約2～3 cm切口，剝離皮下組織及骨膜，暴露前囟，以bregma點(diǎn)為原點(diǎn)(十字中心)，使用此點(diǎn)的三坐標(biāo)位置(前囟后3.0 mm、左右旁開2.2mm、皮層往下2.8 mm)，用5 μl微量注射器將10 μl(每側(cè)5 μl)Aβ1-42溶液分別緩慢注入左右兩側(cè)海馬區(qū)。假手術(shù)組注射等量醫(yī)用生理鹽水。造模后對(duì)所有存活大鼠進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，有行為記憶能力下降的動(dòng)物納入實(shí)驗(yàn)研究，否則不納入。

3.2 動(dòng)物分組：所有動(dòng)物在統(tǒng)一條件下,每周記錄體重變化,觀察一般情況，記錄異常等。待所有動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。分為五組：正常組、假手術(shù)組、模型組、西藥組(腦復(fù)康組)、中藥組(腦靈湯組)，每組8只，正常組和假手術(shù)組給予等體積生理鹽水(10 ml/kg)連續(xù)30 d，中藥組給予腦靈湯10 ml/(kg·d)(腦靈湯連續(xù)30 d)；西藥組腦復(fù)康溶液以10 ml/kg計(jì)算(臨床等效測(cè)量比例分別為成人和動(dòng)物體表面積的15倍),1次/d，連續(xù)30 d。分組時(shí)依照隨機(jī)數(shù)字表法。

3.3 行為學(xué)檢測(cè)：采用Y迷宮實(shí)驗(yàn)和Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)。Y迷宮實(shí)驗(yàn)中觀察電擊刺激后大鼠逃逸至安全區(qū)的反應(yīng)。以連續(xù)9次以上達(dá)到正確反應(yīng)所需的電擊總數(shù)作為學(xué)習(xí)成績的標(biāo)準(zhǔn)，以學(xué)習(xí)后10次電擊中的正確反應(yīng)總數(shù)(N/10)作為記憶成績的標(biāo)準(zhǔn)。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，大鼠在水池中游泳，直到發(fā)現(xiàn)藏在水下的平臺(tái)。每天早晨和下午訓(xùn)練一次，持續(xù)3 d，得到隱藏的平臺(tái)搜索數(shù)據(jù)，反映了大鼠的學(xué)習(xí)能力。第4天，平臺(tái)被移除，在60 s內(nèi)測(cè)量大鼠穿過目標(biāo)(原始平臺(tái)位置)的次數(shù)為探索性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，反映了大鼠的記憶能力。為了消除感覺和運(yùn)動(dòng)功能障礙對(duì)空間學(xué)習(xí)和記憶的影響，進(jìn)行可視平臺(tái)實(shí)驗(yàn)。

3.4 剛果紅染色：從冰箱中取出冷凍切片，放入多聚賴氨酸玻片上，自然空氣在室溫下干燥，Harris蘇木精5～10 min，自來水沖洗幾分鐘；1%鹽酸乙醇處理幾秒鐘，自來水沖洗幾分鐘；0.5%甲醇剛果紅染色15 min，自來水沖洗幾分鐘，0.2%堿性酒精幾秒鐘，自來水沖洗，常規(guī)酒精脫水，二甲苯透明，封片。

3.5 HE染色：冷凍切片從冰箱取出，貼在經(jīng)多聚賴氨酸處理的玻片上，自然干燥，用蒸餾水洗滌1～2 s，然后用Harris蘇木精(60℃)染色30～60 s，用流動(dòng)水洗滌5～10 s，然后分化。用1%鹽酸乙醇洗1～3s，用水洗1～2 s，藍(lán)色促進(jìn)液(即氫氧化銨溶液)返回藍(lán)色5～10 s，流動(dòng)水沖洗15～30 s，伊紅染色30～60 s，顯微鏡下觀察顏色變化，用蒸餾水洗滌1～2 s，用梯度乙醇脫水，用二甲苯透明干燥，用中性膠密封。

3.6 免疫組化染色：冰凍切片展開貼于多聚賴氨酸處理過的載玻片上,干燥，和抗體孵育，一抗NF-κB(p65)、一抗IκBа抗體，4 ℃過夜或37 ℃ 60 min，最后DAB顯色，封片。

結(jié)果

1 腦靈湯對(duì)Alzheimer’s disease模型大鼠行為學(xué)的影響 為了證實(shí)腦靈湯對(duì)Alzheimer’s disease模型大鼠的保護(hù)作用，首先我們運(yùn)用Y迷宮實(shí)驗(yàn)和Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腦靈湯對(duì)Alzheimer’s disease模型大鼠行為學(xué)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：Y迷宮實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠所需要的電刺激次數(shù)較正常和假手術(shù)組明顯增加(P<0.05)，與模型組比較，腦靈湯組所需要的電刺激次數(shù)更少(P<0.05),見表1；在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，模型組進(jìn)行隱匿平臺(tái)搜索實(shí)驗(yàn)所需的時(shí)間顯著長于正常組和假手術(shù)組(P<0.05)，而在探索實(shí)驗(yàn)中，穿越平臺(tái)的大鼠數(shù)量顯著多于正常組和假手術(shù)組(P<0.05)。模型組高于正常組和假手術(shù)組(P<0.05)。腦靈湯組隱匿平臺(tái)搜索時(shí)間明顯短于模型組(P<0.05)，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯多于模型組(P<0.05),見表2。可見平臺(tái)實(shí)驗(yàn)各組數(shù)據(jù)無明顯差異(數(shù)據(jù)未列出)。通過行為學(xué)實(shí)驗(yàn)說明與模型組相比，腦靈湯組的記憶和學(xué)習(xí)能力改善。

表1 各組大鼠Y迷宮實(shí)驗(yàn)的學(xué)習(xí)記憶成績比較(次)

注：與正常組比較，★P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05

表2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注：與正常組相比，★P<0.05；與模型組相比，▲P<0.05

2 腦靈湯對(duì)Alzheimer’s disease模型大鼠老年斑的影響 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)驗(yàn)證腦靈湯對(duì)Alzheimer’s disease模型大鼠有保護(hù)作用，接下來應(yīng)用剛果紅染色觀察老年斑沉積情況(圖1)，結(jié)果顯示模型組大鼠海馬CA3區(qū)可見橘紅色Aβ沉積，證明本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ统晒φT導(dǎo)了AD大鼠病理模型，而經(jīng)過腦靈湯干預(yù)后，腦靈湯組大鼠海馬CA3區(qū)未見Aβ沉積，海馬齒狀回背側(cè)細(xì)胞排列整齊,無明顯的神經(jīng)元缺失。

3 腦靈湯對(duì)Alzheimer’s disease模型大鼠組織細(xì)胞形態(tài)的影響 繼續(xù)通過HE染色觀察腦靈湯對(duì)Alzheimer’s disease模型大鼠組織細(xì)胞形態(tài)的影響(圖2)。HE染色結(jié)果顯示正常組海馬細(xì)胞層清晰，形態(tài)規(guī)則有序，排列整齊致密，核清晰可見，染色均勻，呈淡藍(lán)色或藍(lán)色。模型組海馬CA3區(qū)細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞間隙變寬，細(xì)胞層不完整，胞體結(jié)果不完整。胞體變小、胞漿色淡、胞核變小，染色很淡甚至消失；腦靈湯組大鼠海馬CA3區(qū)細(xì)胞形態(tài)、層次結(jié)果均較模型組好轉(zhuǎn)。

圖1 各組大鼠海馬CA3區(qū)老年斑沉積情況 (剛果紅染色，×200)

圖2 各組大鼠海馬CA3區(qū)細(xì)胞形態(tài)改變的情況(HE染色，×400)

4 腦靈湯對(duì)Alzheimer’s disease模型大鼠NF-κB和IκB的影響 見表3～4。以上證實(shí)腦靈湯對(duì)Alzheimer’s disease模型大鼠行為學(xué)和形態(tài)學(xué)均有保護(hù)作用，而其具體作用機(jī)制并不十分清楚，通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷、紅景天苷均能抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生[2-3]，因此我們推測(cè)腦靈湯可能通過影響炎癥反應(yīng)而達(dá)到對(duì)Alzheimer’s disease模型大鼠得多保護(hù)作用，采用免疫組化染色觀察NF-κB和IκB蛋白的表達(dá)情況。免疫組化染色結(jié)果(圖3、4)顯示模型組海馬CA3區(qū)NF-κB陽性細(xì)胞數(shù)顯著高于正常組和假手術(shù)組(P<0.05)，而IκB陽性細(xì)胞數(shù)顯著低于正常組和假手術(shù)組(P<0.05)。腦靈湯組海馬CA3區(qū)NF-κB陽性細(xì)胞數(shù)明顯低于模型組(P<0.05)。IκB陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于模型組(P<0.05)。

表3 各實(shí)驗(yàn)組大鼠海馬CA3區(qū)NF-κB免疫反應(yīng)比較

注：與正常組相比，★P<0.05；與模型組相比，▲P<0.05

表4 各實(shí)驗(yàn)組大鼠海馬CA3區(qū)IκB免疫反應(yīng)比較

注：與正常組相比，★P<0.05；與模型組相比，▲P<0.05

圖3 各組大鼠NF-κB表達(dá)結(jié)果 (免疫組化染色，×200)

圖4 各組大鼠IκB表達(dá)結(jié)果(免疫組化染色，×400)

討 論

目前所知，AD作為神經(jīng)退行性疾病之代表，其最顯著的影像學(xué)標(biāo)記是大腦的漸進(jìn)性萎縮。更深層次的病理改變，則是腦組織內(nèi)的β淀粉樣蛋白增多形成的血管壁淀粉樣變性，繼而引起的老年斑和神經(jīng)元纖維纏結(jié)(細(xì)胞外)。因此，一直以來，β淀粉樣蛋白成為解釋各種AD發(fā)病學(xué)說與藥理作用原理的公認(rèn)途徑之一。隨著炎癥發(fā)病學(xué)說的興起，越來越多的證據(jù)表明AD的神經(jīng)炎癥和神經(jīng)元功能障礙之間存在聯(lián)系，這種聯(lián)系是由小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的逐漸激活以及由此產(chǎn)生的促炎癥反應(yīng)的分子過度生成所協(xié)調(diào)的，同時(shí)釋放抗炎介質(zhì)對(duì)抗炎癥過程，導(dǎo)致AD病理的發(fā)生[5]。AD患者反應(yīng)性小膠質(zhì)細(xì)胞增生與神經(jīng)炎癥被認(rèn)為是斑塊沉積的后果[6]。于是，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)于未活化的小膠質(zhì)細(xì)胞與AD炎癥病變的關(guān)系產(chǎn)生了許多新的認(rèn)識(shí)，最終得出早期炎癥反應(yīng)指標(biāo)是AD以后發(fā)展的危險(xiǎn)因素[7]。

對(duì)于AD的治療，受限于病因，既往通過促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的再生、延緩腦細(xì)胞的老化、基因改進(jìn)等方法做對(duì)因治療，均處于理論上的探討或?qū)嶒?yàn)階段，至今沒有突破性發(fā)現(xiàn)。有研究顯示[8]，通過對(duì)200多例AD患者的隨訪，采用MMSE隨訪評(píng)測(cè)，隨訪時(shí)間2～3年以上，結(jié)果顯示，給予AD患者多靶點(diǎn)全面治療可以讓病情基本穩(wěn)定。目前所見，AD多靶點(diǎn)治療方案有：膽堿酶抑制劑AchEI 及NMDA受體拮抗劑；針對(duì)抑郁、淡漠、焦慮等精神癥狀，應(yīng)用SSRI類藥物治療等。因此在療效欠佳且費(fèi)用昂貴的同時(shí)，我們發(fā)揮中藥復(fù)方多靶點(diǎn)治療的作用，探討中藥復(fù)方對(duì)AD的防治作用及機(jī)制更有積極意義與經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

AD屬于中醫(yī)學(xué)“呆癥”、“郁癥”范疇，其發(fā)病的核心機(jī)理也不外虛實(shí)夾雜、本虛標(biāo)實(shí)。限于古人的解剖水平與科技能力，古籍文獻(xiàn)所見關(guān)于“呆癥”、“郁癥”致病原因論述繁多，病理機(jī)制頗為復(fù)雜。古代與現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)家對(duì)于“呆癥”、“郁癥”的治療手段豐富，但總體圍繞先天(腎)后天(脾)，或水(腎)火(心)既濟(jì)模型開展，通過滌痰開竅、活血通絡(luò)等方法影響人體氣血津精液的生化功能為主體。具體方法，除了中藥復(fù)方外，還見有配合針灸、推拿、按摩、藥膳等輔助治療。就AD證型而言，主要是對(duì)機(jī)體內(nèi)氣、血、痰、瘀、毒等物質(zhì)對(duì)臟腑氣化功能的影響程度，分別對(duì)應(yīng)氣虛、血虛、血瘀、痰濁和火毒等[9]；發(fā)病部位主要涉及五臟兼六腑；但是AD患者往往不是單一器官受損，而是同時(shí)多個(gè)器官受損。同樣有研究[10]顯示，應(yīng)用益智治呆方對(duì)脾腎兩虛型老年性癡呆患者有保護(hù)作用，益智治呆方能有效的提高患者的認(rèn)知功能和活動(dòng)能力。張利平等研究表明[11]清心益智湯能夠有效提高AD患者的認(rèn)知水平和生活質(zhì)量，對(duì)AD患者血清中SOD、MDA、T-AOC、ox-LDL的表達(dá)水平有明確的改善作用。本研究所用組方，包括淫羊藿、紅景天、何首烏、白參等中藥，其功能為補(bǔ)腎益氣填髓、活血開竅祛痰。其中，淫羊藿為臨床較常用中藥，因能改善生殖功能故名?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》明確記載淫羊藿具有補(bǔ)腎健腦之效。大量的實(shí)驗(yàn)研究表明，淫羊藿提取物淫羊藿苷能夠進(jìn)入大腦組織，具有減輕炎癥、抗氧化應(yīng)激、減少淀粉樣蛋白(Aβ)生成及改善AD患者的認(rèn)知障礙功能等作用[12]，其靶點(diǎn)可能是通過SIRT 6蛋白和NF-κB蛋白表達(dá)的抑制和從而使炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生減少[13]。紅景天中紅景天苷可通過下調(diào)巨噬細(xì)胞內(nèi)NF-κB和轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑表達(dá)抑制炎性細(xì)胞因子的釋放，同時(shí)抑制高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖[14]。此外，紅景天苷抑制了紅景天苷對(duì)NF-κB/TGF-β1信號(hào)通路從而抑制哮喘小鼠氣道重塑[15]。另外，何首烏中生物活性提取物首烏二苯乙烯苷(TSG)具有升高海馬和皮層膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)活性，可能的原因包括，通過降低皮層AchE活性[16]，改善主動(dòng)學(xué)習(xí)能力和被動(dòng)回避記憶能力。

本研究觀察了腦靈湯對(duì)Aβ1 - 42誘導(dǎo)的AD模型大鼠的保護(hù)作用，并通過觀察炎癥反應(yīng)的重要起始蛋白NF -κB/IκB來探討其機(jī)制。我們首先通過行為學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠在Y-迷宮實(shí)驗(yàn)中所需要的電刺激次數(shù)較正常和假手術(shù)組明顯增加，腦靈湯組在電刺激Y-迷宮實(shí)驗(yàn)成績考察較模型組優(yōu)異；腦靈湯組大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)過程中搜索所需時(shí)間較模型組少。以剛果紅染色作為形態(tài)學(xué)觀察指標(biāo)，腦靈湯組海馬CA3區(qū)未見特征性顯示；以HE染色作為形態(tài)學(xué)觀察指標(biāo)，模型組大鼠海馬CA3區(qū)染色所見，除了細(xì)胞排列混亂外，胞體變小、胞漿色淡、胞核變小，染色很淡甚至消失；腦靈湯組大鼠海馬CA3區(qū)細(xì)胞形態(tài)、層次結(jié)果均較模型組好轉(zhuǎn)。總之，行為學(xué)和形態(tài)學(xué)的實(shí)驗(yàn)證明腦靈湯對(duì)AD模型大鼠具有保護(hù)作用。至于NF-κB和IκB的表達(dá)情況，腦靈湯組海馬CA3區(qū)NF-κB陽性細(xì)胞數(shù)較模型組明顯減少，而IκB陽性細(xì)胞數(shù)較模型組明顯增加。顯然，NF-κB表達(dá)的下降和IκB表達(dá)的升高與AD的發(fā)病進(jìn)展密切相關(guān)。至于機(jī)理，我們初步推測(cè)腦靈湯可能夠通過抑制NF-κB的活性增強(qiáng)AD大鼠對(duì)炎性因子敏感性，IκB陽性細(xì)胞數(shù)增加抑制了NF-κB的表達(dá)，進(jìn)一步抑制炎癥的發(fā)生和發(fā)展。

總而言之，腦靈湯基于補(bǔ)腎添髓、活血通絡(luò)、祛痰開竅法而制，通過抑制炎癥反應(yīng)而減少Aβ淀粉樣蛋白的沉積從而保護(hù)AD模型大鼠，但本研究僅從蛋白水平證明，缺乏更進(jìn)一步研究，接下來將尋求更精準(zhǔn)靶點(diǎn)，為防治AD提供思路。