寸靜宇，劉秋月，王翔宇，狄 冉，胡文萍，張效生，張金龍，趙永聚，儲(chǔ)明星*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；

2.西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，重慶 400715；3.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381）

產(chǎn)羔性狀是綿羊的重要經(jīng)濟(jì)性狀之一。對(duì)于綿羊而言，提高每胎的產(chǎn)羔數(shù)是提升生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)效益的重要措施[1]。許多研究表明，雌性動(dòng)物繁殖性能主要受下丘腦-垂體-卵巢軸（Hypothalamic-Pituitary-Ovarian Axis，HPOA）的調(diào)控，HPOA的相關(guān)基因是研究動(dòng)物繁殖性狀的重要候選基因。

促卵泡激素（FSH）和促黃體素（LH）都是糖蛋白類(lèi)促性腺激素，是控制哺乳動(dòng)物生殖的核心激素，由垂體前葉嗜堿性細(xì)胞合成和分泌[2]，它們由α和β2個(gè)亞基組成。FSH主要刺激卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育，且在LH的協(xié)同作用下，激發(fā)卵泡成熟，誘發(fā)排卵[3]，同時(shí)在下丘腦-垂體-性腺軸中起重要作用。LH可與FSH協(xié)同促使卵泡排卵，排卵后在LH作用下顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)辄S體細(xì)胞，促進(jìn)類(lèi)固醇激素合成和分泌[4]。劉建斌等[5]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHβ基因可能是影響小尾寒羊高繁殖性能的一個(gè)主效基因。Zi等[6]報(bào)道，發(fā)情期高繁殖力樂(lè)至黑山羊腦垂體中FSHβ基因的mRNA表達(dá)量顯著高于低繁殖力藏山羊。Kumar[7]通過(guò)建立LHβ基因敲除小鼠模型證明了該基因?qū)Σ溉閯?dòng)物繁殖性能有一定的影響。Nivet等[8]實(shí)驗(yàn)表明，LHβ缺乏可能引發(fā)牛卵泡的早期閉鎖、腫瘤蛋白P53和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子b1這類(lèi)閉鎖劑的上調(diào)和生長(zhǎng)支持的抑制。

鑒于此，本實(shí)驗(yàn)使用Taqman探針?lè)▽?duì)小尾寒羊群體FecB基因進(jìn)行分型，經(jīng)過(guò)連續(xù)觀察并記錄產(chǎn)羔數(shù)和黃體數(shù)（產(chǎn)羔數(shù)和黃體數(shù)均≥2，則定義為多羔），確定了小尾寒羊FecB基因突變++型中產(chǎn)單羔和產(chǎn)多羔的個(gè)體，并以此為研究對(duì)象，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)FSHβ和LHβ基因在生殖軸相關(guān)組織中的表達(dá)情況，試圖在排除FecB主效基因的影響后找出FSHβ和LHβ基因和小尾寒羊產(chǎn)羔性能的關(guān)系，為小尾寒羊多羔性狀的機(jī)理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品及主要試劑 隨機(jī)選取2～3周歲健康狀況良好的小尾寒羊母羊6只（FecB ++型單羔和多羔各3只），飼養(yǎng)于天津市畜牧獸醫(yī)研究所試驗(yàn)羊場(chǎng)。用孕酮陰道栓（CIDR）對(duì)6只小尾寒羊進(jìn)行處理，12 d后撤栓，在撤栓后45 h左右屠宰并立即采集大腦、小腦、下丘腦、卵巢、子宮、輸卵管、垂體7種組織，液氮中保存，轉(zhuǎn)移到-80 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

RNA提取試劑盒購(gòu)于天根生化科技有限公司（北京），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTMRT Reagent Kit）和熒光定量染料（SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ）均購(gòu)于TaKaRa公司（大連）。

1.2 RNA提取 用Trizol 和RNAprep pure動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒（天根生化科技北京有限公司）提取上述組織總RNA。利用Nanodrop 2000檢測(cè)所提取的總RNA濃度和OD值，并用1.5%的瓊脂糖凝膠對(duì)RNA進(jìn)行電泳檢測(cè)，置于-80 冷凍備用。

1.3 cDNA合成 利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系總體積為20 μL：PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0 μL，Oligo dT Primer 1.0 μL，Random 6 mers 1.0 μL，5×PrimeScript Buffer（for Real Time）4.0 μL，RNA 1.0 μg，RNase-Free ddH2O 補(bǔ)足至總體積為 20 μL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37 15 min，85 5 s，獲得cDNA第一鏈。全程在冰上操作。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行5倍稀釋?zhuān)贸旨一颚?actin進(jìn)行PCR檢測(cè)，可成功擴(kuò)增。將符合標(biāo)準(zhǔn)的cDNA置于-20 保存，以用于檢測(cè)目的基因的表達(dá)。

1.4 定量引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank提供的綿羊FSHβ和LHβ基因mRNA序列（登錄號(hào)分別為NM_001009798.1、NM_001009380.1），利用Primer Premier 6.0軟件進(jìn)行跨外顯子引物設(shè)計(jì)，以β-actin（NM_001009784.2）作為內(nèi)參基因。引物由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。引物名稱(chēng)和序列以及擴(kuò)增片段大小見(jiàn)表1。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 熒光定量檢測(cè)利用Roche Light Cycler?480Ⅱ 型熒光定量 PCR 儀進(jìn)行，以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次。反應(yīng)體系總 體 積 為 20 μL：SYBR Premix Ex TaqⅡ 10 μL， 上、下游引物各 0.8 μL，cDNA 模板 2.0 μL，RNase-Free ddH2O 6.4 μL。PCR 程序：95 預(yù)變性5 s，95 變性10 s，60 30 s，40個(gè)循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后對(duì)熔解曲線進(jìn)行分析。

表1 熒光定量引物信息

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 采用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量，數(shù)據(jù)差異顯著性用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較用單因素方差分析（One-Way ANOVA），用最小顯著差異法（LSD）進(jìn)行多重比較，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA提取與cDNA合成 使用動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒提取小尾寒羊各組織的RNA，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果表明，電泳條帶明亮清晰、整齊、無(wú)拖尾（圖1），說(shuō)明所提取的小尾寒羊各組織的RNA完整度好，且無(wú)降解和污染；以反轉(zhuǎn)錄之后的cDNA為模板對(duì)β-actin進(jìn)行sqRT-PCR擴(kuò)增，設(shè)計(jì)的β-actin引物擴(kuò)增效果良好（圖2），目的片段與預(yù)期的97 bp一致，且條帶單一，反轉(zhuǎn)錄之后的cDNA可以用于后續(xù)的熒光定量實(shí)驗(yàn)。

圖 1 RNA電泳檢測(cè)

2.2 綿羊FSHβ基因在小尾寒羊（多羔和單羔）繁殖相關(guān)組織中的表達(dá) 如圖3所示，F(xiàn)SHβ基因主要集中在小尾寒羊下丘腦、卵巢、輸卵管、子宮等組織中表達(dá)。在小尾寒羊多羔群體中，F(xiàn)SHβ基因在下丘腦、卵巢、輸卵管、子宮、垂體、小腦、大腦組織表達(dá)量均高于單羔群體，其中下丘腦、卵巢、輸卵管、子宮、垂體差異極顯著（P＜0.01）。

圖2 cDNA檢測(cè)

圖 3 FSHβ基因在小尾寒羊的組織表達(dá)

2.3 綿羊LHβ基因在小尾寒羊（多羔和單羔）繁殖相關(guān)組織中的表達(dá) 如圖4所示，LHβ基因在小尾寒羊垂體、下丘腦、輸卵管組織高表達(dá)，在子宮、卵巢、小腦、大腦組織低表達(dá)。在小尾寒羊多羔群體中，LHβ基因在垂體、下丘腦、輸卵管、子宮、卵巢組織表達(dá)量均極顯著高于單羔群體（P＜0.01）。

圖 4 LHβ基因在小尾寒羊的組織表達(dá)

3 討 論

3.1FSHβ基因表達(dá)與動(dòng)物繁殖 已知FSHβ主要調(diào)節(jié)卵泡的增殖和分化[9]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHβ可促進(jìn)老鼠[10]和綿羊[11]的卵巢發(fā)育、卵泡形成以及增強(qiáng)FSHR mRNA和蛋白在卵巢中的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)SHβ在垂體、子宮、輸卵管、卵巢和下丘腦中表達(dá)量較高，其次在大腦和小腦中表達(dá)，與FSHβ在二花臉和杜洛克豬[12]、家兔[13]、梅山豬[14]的表達(dá)結(jié)果相一致。本研究也發(fā)現(xiàn)，在小尾寒羊多羔群體中FSHβ基因在下丘腦、卵巢、子宮、輸卵管、垂體組織中的表達(dá)量均極顯著高于單羔群體。國(guó)內(nèi)外研究者發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHβ的表達(dá)在高產(chǎn)的興國(guó)灰鵝的輸卵管[15]和山羊的垂體和卵巢組織中[5-6]高于低產(chǎn)動(dòng)物，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)SHβ在下丘腦組織高表達(dá)，與Wei 等[10]研究結(jié)果相一致，推測(cè)FSHβ可能在腦組織中參與和調(diào)控性激素的合成和代謝過(guò)程，同時(shí)也可能對(duì)腦組織的某些功能起調(diào)節(jié)作用。還有研究表明，F(xiàn)SHβ不僅只在雌性動(dòng)物中表達(dá)，它也在雄性動(dòng)物的繁殖相關(guān)組織中表達(dá)。產(chǎn)舒恒等[16]研究顯示，F(xiàn)SHβ在梅山公豬的HPT軸的組織中也有表達(dá)，說(shuō)明FSHβ基因不僅對(duì)雌性動(dòng)物的繁殖性能有作用，也對(duì)雄性動(dòng)物精子的發(fā)育與成熟有一定作用。FSHβ基因在小尾寒羊單、多羔群體大腦、小腦、垂體、子宮、輸卵管、卵巢和下丘腦的組織均有表達(dá)，提示FSHβ可能在小尾寒羊發(fā)情或者排卵的過(guò)程中起著重要作用，但具體機(jī)制有待繼續(xù)研究。

3.2LHβ基因表達(dá)與動(dòng)物繁殖LHβ在繁殖過(guò)程中扮演一個(gè)關(guān)鍵的角色，它調(diào)控卵母細(xì)胞的發(fā)育成熟、排卵、受精和黃體的發(fā)育。Nivet等[8]的研究表明，LH缺乏可能引發(fā)牛卵泡的早期閉鎖，說(shuō)明了LHβ在卵巢發(fā)育中的重要作用。LHβ的作用必須與細(xì)胞膜上的特異性受體LHR結(jié)合，通過(guò)受體介導(dǎo)把生物信息傳遞到靶細(xì)胞內(nèi)，才能發(fā)揮正常的生物學(xué)功能。因此，國(guó)內(nèi)外對(duì)LHβ基因的研究相對(duì)較少。本研究發(fā)現(xiàn)，LHβ基因在小尾寒羊垂體、下丘腦、輸卵管、大腦、小腦、卵巢、子宮7種組織中均有表達(dá)，其中在垂體、下丘腦、輸卵管組織中表達(dá)量較高，在大腦、小腦、卵巢、子宮組織低表達(dá)。吳國(guó)平[17]和史紅軍等[18]檢測(cè)到LHβ分別在浙東白鵝[17]和藏羊[18]的垂體組織中都有表達(dá)，這與本研究發(fā)現(xiàn)的LHβ在小尾寒羊的垂體組織中高表達(dá)相一致。另外，LH是由垂體合成分泌后經(jīng)血液運(yùn)輸作用在 LHR，推測(cè)其與小尾寒羊多羔性能有一定關(guān)聯(lián)。本研究也發(fā)現(xiàn)，在小尾寒羊多羔群體中LH基因在下丘腦、卵巢、子宮、輸卵管、垂體、小腦、大腦組織表達(dá)量均極顯著高于單羔群體。推測(cè)小尾寒羊的產(chǎn)羔性能受到LHβ的調(diào)控。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)FSHβ和LHβ基因在小尾寒羊下丘腦-垂體-卵巢軸組織均有表達(dá)。FSHβ在小尾寒羊下丘腦高表達(dá)，LHβ在小尾寒羊垂體高表達(dá)。FSHβ和LHβ基因在小尾寒羊多羔群體的繁殖相關(guān)組織表達(dá)量均極顯著高于單羔群體，推測(cè)FSHβ和LHβ在小尾寒羊多羔繁殖性狀的調(diào)節(jié)過(guò)程中可能起到一定作用。