宋旭婷，翟羽飛，張嘉楠，亓美玉，王志鵬，付 晶，姚玉昌*

（1.黑龍江普通高等學(xué)校動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，黑龍江哈爾濱 150086）

胰島素樣生長因子-1（Insulin Like Growth Factor I，IGF-I）是一種物種間高度保守的多功能肽，在哺乳動物中由70個氨基酸殘基和3個分子內(nèi)二硫鍵組成，主要由肝臟分泌產(chǎn)生，對生長、生殖、代謝、免疫和多種疾病具有調(diào)節(jié)功能[1-2]。IGF-I基因在培育動物新品種中發(fā)揮重要作用。有研究表明，14月齡時轉(zhuǎn)IGF-I基因綿羊后代公羊和母羊的產(chǎn)毛量分別提高了9.2%和3.4%[3]；轉(zhuǎn)IGF-I基因豬的瘦肉率提高10%，脂肪減少20%[4]。

RNA的可變剪接（Alternative Splicing）是真核生物基因表達調(diào)控的重要形式，可變剪接在生物界普遍存在，其中95%的人類基因和40%以上的植物基因存在著可變剪接現(xiàn)象[5-6]。IGF-I基因在表達時存在外顯子互斥現(xiàn)象，進而調(diào)節(jié)著基因表達的差異性和蛋白質(zhì)功能的多樣性[7]。目前，在人類中已發(fā)現(xiàn)包括IGF-IEa、IGF-IEb和IGF-IEc至少3種類型[8]，在鼠中也已發(fā)現(xiàn)包括IGF-IEa和IGF-IEb（該型與人中的IGF-IEc型的剪接方式一致）在內(nèi)的2種類型[9]，在豬、牛和鹿等物種也有相關(guān)研究報道[10-12]。但目前關(guān)于綿羊IGF-I基因的可變剪接方式還未明晰，產(chǎn)生的變異剪接體類型有待進一步揭示。

IGF-I基因在不同物種間高度保守，本研究基于已發(fā)表的綿羊IGF-I基因I類變異剪接體類型[13]，以東北細毛羊為實驗材料，探討IGF-I基因II類變異剪接體的生物學(xué)特性及組織表達規(guī)律，為揭示IGF- I基因不同變異剪接體的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗動物選擇來自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)綿羊新品種繁育基地的30日齡和36月齡東北細毛羊公羊各3只，屠宰后立即取心臟、肝臟、肌肉、脾臟、肺臟、腎臟、腸、胃、皮膚、脂肪、膀胱和睪丸組織樣，于液氮中速凍后，-80 冰箱保存。

1.2 引物信息 比較分析牛、豬、鹿等物種IGF-I基因的可變剪切模式及序列同源性，明確目標序列高度保守區(qū)域，設(shè)計2對克隆和半定量引物，特異性引物1（F:5'-ACCCACCCTGACCTGCTGT-3'；R:5'-CATTCT TCGCTCTTTAGGAAGGG-3'）、特異性引物2（F:5'-ACCCACCCTGACCTGCTGT-3'；R:5'-TTCAGTTTCTA GCTCCAGTCTCTC T-3'）、半定量引物R1（F:5'-CAA ACAAAAATGGTTACACCTACAC-3'；R:5'-AAATGT

ACT TCCTTCTGAGCCTTGG-3'）、半定量引物R2（F:5'-CAAACAAAAATGGTTACACCTACA C-3′；R:5′-CCCTCCTGGATGTTTCTTTGG-3'） 和β-actin 基 因 引 物（F:5'-AGATGTGGATC AGCAAGCAG-3'；R:5'-CCAATC TCATCTCGTTTTCTG-3'）。

1.3 總RNA提取及cDNA合成 采用液氮研磨結(jié)合RNAiso Plus裂解法（9109，TaKaRa）提取12個組織總RNA，利用紫外分光光度計和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA純度和濃度。反轉(zhuǎn)錄cDNA按照試劑盒說明書（RR047A，TaKaRa）的具體操作步驟完成。

1.4 全長編碼區(qū)克隆鑒定 以東北細毛羊肝臟池為模板，利用1.2中列出的特異性引物1和2分別擴增目的序列。PCR擴增條件及克隆方法參照之前的報道[13]。純化后帶有目標序列的pMD 18-T克隆質(zhì)粒測序，將拼接比對后的完整序列進行后續(xù)生物信息學(xué)預(yù)測。DNAMAN和NCBI BLAST在線比對獲得序列物種同源性等信息。

1.5 預(yù)測網(wǎng)站 將已克隆獲得片段進行開放閱讀框區(qū)域預(yù)測。GenBank數(shù)據(jù)庫查找并下載Class 2-Ea和Class 2-Eb氨基酸序列，用于構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，其他相關(guān)生物學(xué)預(yù)測方法詳見參考文獻[13]。

1.6 組織表達分析 考慮到IGF-I基因的剪接方式以及引物的特殊性，本研究選擇半定量PCR檢測IGF-I基因不同變異剪接體在12種組織樣品中的表達情況。具體方案參照Zhang等[12]研究方法。

1.7 統(tǒng)計分析 使用Image J軟件獲取目的條帶灰度值，采用SPSS 18.0軟件單因素方差分析法對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 綿羊IGF-I基因克隆 以東北細毛羊肝臟池cDNA為模板，RT-PCR擴增結(jié)果顯示均出現(xiàn)特異性擴增條帶，測序后證明獲得了2種變異剪接體（圖1和圖2）。綜合比對嚙齒類、類人猿等哺乳動物IGF-I基因的可變剪接特征，并與課題組之前在綿羊肝臟池中獲得的2條綿羊IGF-I基因I類（NM_001009774.3，MG572781）序列對比后發(fā)現(xiàn)，本研究新獲得的片段是綿羊IGF-I基因II類變異剪接體，即為綿羊IGF-I基因II類Ea型 （IGF-Iclass 2-Ea, GenBank登錄號：MG572782）和IGF-I基因 II類 Eb型（IGF-Iclass 2-Eb，GenBank登 錄 號：MG572783）。

圖1 綿羊IGF-I基因4種變異剪接體PCR擴增結(jié)果

圖2 綿羊IGF-I基因II類變異剪接體結(jié)構(gòu)模式圖

2.2 2種變異剪接體生物信息學(xué)預(yù)測分析結(jié)果

2.2.1 組成分析 本研究獲得的綿羊IGF-I基因II類變異剪接體組成分析與其他物種結(jié)果相一致（表1）。IGF-I基因II類Ea型（序列長度為485 bp）ORF位于42～459 bp核苷酸，預(yù)測編碼蛋白質(zhì)長度是138 aa；IGF-I基因II類Eb型（序列長度為561 bp）ORF位于42～560 bp核苷酸，預(yù)測編碼蛋白質(zhì)長度是172 aa（圖3）。信號肽在線預(yù)測結(jié)果表明，2種變異剪接體1～33個氨基酸為信號肽區(qū)域，剪切點位于33～34氨基酸處（圖4）。

2.2.2 系統(tǒng)進化樹分析 由圖5可見，綿羊IGF-I基因II類Ea型與山羊（Capra hircus）在一個小分支上，遺傳距離相對較近；與嚙齒類（Rodents）和靈長類（Primates）遺傳距離相對較遠。綿羊的IGF-I基因II類Eb型與牛（Bos taurus）在一個小分支上，遺傳距離較近；與小鼠（Mus musculus）遺傳距離較遠，這2種剪接變異體的系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果符合物種進化規(guī)律。

表1 綿羊IGF-I 基因序列組成分析

圖3 綿羊IGF-I基因II類變異剪接體的氨基酸序列比對

圖4 綿羊IGF-I基因II類變異剪接體信號肽序列預(yù)測結(jié)果

圖5 綿羊IGF-I基因II類變異剪接體系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果

2.2.3 蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)預(yù)測 在線預(yù)測蛋白質(zhì)理化性質(zhì)結(jié)果表明IGF-I基因II類Ea型預(yù)測編碼138 aa，相對分子質(zhì)量為15 149.42，理論等電點（PI）為9.44，由19個氨基酸組成，其中絲氨酸達到10.1%，異亮氨酸僅為0.7%。分子式為C654H1048N194O196S12；氨基酸的最大疏水性為2.756，最小值為-1.978（圖6-a）。IGF-I基因II類Eb型預(yù)測編碼172 aa，相對分子質(zhì)量為19 070.93， PI為9.93，由19個氨基酸組成，其中賴氨酸達到9.3%，異亮氨酸僅為0.6%。分子式為C816H1331N253O246S14；氨基酸最大疏水性為2.756，最小值為-3.067（圖6-b）。

圖6 綿羊IGF-I基因II類變異剪接體蛋白親疏水性預(yù)測結(jié)果

2.2.4 功能域預(yù)測 在線預(yù)測亞細胞定位結(jié)果（表2）表明，2種變異剪接體均是分泌蛋白，與IGF-I的功能相一致，主要定位于分泌途徑，并且該方法與信號肽在線預(yù)測軟件（SignalP 4.0）結(jié)果一致，表明存在信號肽區(qū)域。

表2 綿羊IGF-I基因序列TargetP亞細胞定位預(yù)測

2.2.5 共價修飾預(yù)測 利用在線網(wǎng)站預(yù)測2種變異剪接體共價修飾位點的存在數(shù)量。磷酸化修飾位點在線預(yù)測結(jié)果（圖7）顯示，IGF-I基因II類Ea型有17處可能的磷酸化修飾位點，分別位于絲氨酸（n=10）、蘇氨酸（n=5）和酪氨酸（n=2），IGF-I基因II類Eb型有20處可能的磷酸化修飾位點，分別位于絲氨酸（n=12）、蘇氨酸（n=6）和酪氨酸（n=2）。糖基化修飾位點在線預(yù)測結(jié)果顯示，IGF-I基因II類Ea型與Eb型分別有9個和11個潛在的糖基化位點。

2.2.6 結(jié)構(gòu)域預(yù)測 二級結(jié)構(gòu)在線預(yù)測結(jié)果（圖8-a和8-b）表明，IGF-I基因II類Ea型編碼的138個氨基酸中，α-螺旋數(shù)量為47個（34.06%），β-折疊數(shù)量為9個（99%），無規(guī)則卷曲數(shù)量為82（59.42%）；IGF-I基因II類Eb型編碼的172個氨基酸中，α-螺旋數(shù)量為68個（39.53%），β-折疊數(shù)量為14個（8.14%），無規(guī)則卷曲數(shù)量為90個（52.33%），2種變異剪接體均不存在β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。三級結(jié)構(gòu)在線預(yù)測結(jié)果（圖8-c和8-d）顯示2種變異剪接體均為彎曲螺旋狀。

圖7 綿羊IGF-I基因II類變異剪接體磷酸化位點預(yù)測結(jié)果

圖8 綿羊IGF-I基因II類變異剪接體蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果

2.6 組織表達檢測 如圖9所示，肝組織中變異剪接體的表達水平最高，其次為脂肪、胃、睪丸、肌肉和皮膚，心、脾、肺、腎、腸、膀胱組織的表達水平較低。在胃中，2種剪接變異體在羔羊期的表達水平均極顯著高于成羊期（P＜0.01）；在睪丸中，IGF-I基因II類Ea型在羔羊期的表達水平顯著高于成羊期（P＜0.05）；在其余檢測的組織中，2種變異剪接體的表達水平在羔羊期和成羊期沒有顯著差異（P＞0.05）。綜合比較分析2個變異剪接體多組織間的表達水平，發(fā)現(xiàn)II類Ea型的表達水平高于Eb型，為主要的轉(zhuǎn)錄本類型。

圖9 綿羊IGF-I基因II類變異剪接體的組織表達情況

3 討 論

IGF-I是體內(nèi)普遍存在的生長因子，對綿羊生長、肉質(zhì)和羊毛產(chǎn)量具有顯著的促進作用[14-15]。分析多物種IGF-I基因前體RNA的剪接模式時發(fā)現(xiàn)，IGF-Iclass 1-Ea型誘導(dǎo)成肌細胞分化和融合形成肌管，而IGF-Iclass 1-Eb抑制成肌細胞的最終分化，從而積累更多的成肌細胞形成次級肌管[16-17]。本研究成功獲得了綿羊IGF-I基因 II類Ea和Eb型，其中Ea型（GenBank登錄號：MG572782）編碼138個氨基酸，Eb型（GenBank登錄號：MG572783）編碼172個氨基酸。IGF-I基因II類與I類變異剪接體之間相比較，包含了99 bp的差異剪接區(qū)域，該區(qū)域為綿羊中新發(fā)現(xiàn)的剪接區(qū)域，構(gòu)成了IGF-I基因II類變異剪接體的5′UTR和信號肽區(qū)域。這也是IGF-I基因I類和II類變異剪接體的主要差異，導(dǎo)致了氨基酸組成上的不同，進而引發(fā)蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)上（PI和親疏水性等）的差異，但總體上IGF-I基因I類和II類變異剪接體相類似，均為水溶性氨基酸。目前，關(guān)于IGF-I基因II類變異剪接體的研究還不完善，因此進行系統(tǒng)進化樹分析時可用的參考序列較少。本研究表明，綿羊與牛和山羊具有較高的同源性，這也符合物種進化規(guī)律。

含有信號肽結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)可以通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)引導(dǎo)蛋白質(zhì)肽鏈進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)，然后分泌到胞外[13,18]。本實驗對新獲得的IGF-I基因II類變異剪接體在線預(yù)測信號肽后發(fā)現(xiàn)，第33～34位氨基酸為其預(yù)測切割位點，這也是IGF-I基因II類變異剪接體與I類變異剪接體的主要差異。有研究表明，IGF-I基因I類和II類變異剪接體相比較，II類變異剪接體含有更短的信號肽基序，這一特點將引發(fā)更有效的分泌功能[19]。本研究結(jié)果表明，IGF-I基因II類的2種變異剪接體在亞細胞定位、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果方面相類似，沒有發(fā)現(xiàn)明顯區(qū)別，而且它們都包括一定數(shù)量的共價修飾位點。一般情況下，肽鏈容易在包含游離羥基并且不帶電荷的氨基酸殘基（色氨酸、絲氨酸和蘇氨酸）上發(fā)生磷酸化修飾，而此處帶電狀態(tài)的改變，將導(dǎo)致結(jié)構(gòu)及活性發(fā)生變化。同磷酸化修飾相比較，糖基化修飾范圍較廣，其主要發(fā)生場所位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，蛋白質(zhì)經(jīng)過修飾后肽鏈可減弱或消除消化酶的作用，引導(dǎo)蛋白質(zhì)的正確折疊，并賦予多種生物學(xué)活性以及傳導(dǎo)信號的功能。

本研究對IGF-I基因II類變異剪接體的多組織表達分析結(jié)果表明，Ea型和Eb型在檢測的12種組織中均表達，但表達水平存在明顯的差異，其中以肝臟中的表達最高，這與IGF-I的生物學(xué)功能相適應(yīng)。肝臟作為IGF-I的主要合成分泌器官，機體中約75%的循環(huán)水平IGF-I來自肝臟，與IGF-IR相互作用后，行使其生物學(xué)功能。除肝臟外，2種變異剪接體在胃和脂肪中的表達水平也相對較高。檢測胃中IGF-I基因II類變異剪接體的表達規(guī)律時發(fā)現(xiàn)，羔羊期2種變異剪接體的表達量顯著高于成羊期，推測這與羔羊期機體的快速生長、消化機能的逐漸成熟以及較高的日糧營養(yǎng)水平相適應(yīng)[20-21]。此外，針對睪丸組織的研究表明，IGF-I基因II類Ea型在羔羊期的表達水平顯著高于成羊期，這可能與生殖器官的逐步發(fā)育成熟有關(guān)，IGF-I基因?qū)游锊G丸組織液、睪丸間質(zhì)細胞類固醇激素的合成有重要影響，進而調(diào)節(jié)繁殖性能[22]?？傮w上，本研究表明，相對于Eb型，Ea型是主要的表達類型，在大多數(shù)組織均有表達，且表達水平較高，這與Oberbauer等[23]在鼠和牛中的研究結(jié)果相一致，這一現(xiàn)象產(chǎn)生的原因可能是由于二者在E結(jié)構(gòu)域上的差異導(dǎo)致。

綜上所述，本研究克隆得到了綿羊IGF-I基因II類的2種變異剪接體，并分析它們的結(jié)構(gòu)特性及在主要組織器官中的時空表達規(guī)律，為揭示IGF-I基因不同變異剪接體的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。