王輝 馬明亮 張德剛 張鍇 賈龍 劉棟 杜剛強(qiáng) 李朋 吳虹

骨肉瘤 ( osteosarcoma，OS ) 是青少年中最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。隨著治療手段的不斷更新，治療技術(shù)的不斷進(jìn)步，骨肉瘤 5 年生存率有提高，但是仍僅有 50% 左右[1-2]。由于骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制尚未完全闡明，缺乏有效的分子治療靶點(diǎn)，導(dǎo)致缺少有效的治療藥物。因此，繼續(xù)尋找骨肉瘤中發(fā)揮重要作用的分子，尋找針對(duì)這些重要分子的藥物，對(duì)提高骨肉瘤患者預(yù)后有著重要作用。

長(zhǎng)鏈非編碼 RNA 是一種長(zhǎng)度超過(guò) 200bp 的不能編碼蛋白的 RNA。近年來(lái)研究證明長(zhǎng)鏈非編碼 RNA( long non-coding RNA，lncRNA ) 在腫瘤中發(fā)揮重要作用，例如：SNHG6-003 ( small nucleolar RNA host gene 6 )、lincRNA-UFC1 ( long intergenic noncoding RNA UFC1 ) 在肝癌增殖中發(fā)揮重要作用[3-4]。而且，研究也表明，lncRNA 在骨肉瘤中也發(fā)揮舉足輕重的作用，例如：lncRNA-ANCR 可通過(guò)下調(diào) EZH2的表達(dá)抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。而筆者也發(fā)現(xiàn) SNHG11 ( small nucleolar RNA host gene 11 ) 在骨肉瘤中高表達(dá)，通過(guò)本研究筆者繼續(xù)探討SNHG11 在骨肉瘤中的生物學(xué)作用及機(jī)制。

材料與方法

一、納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1. 納入標(biāo)準(zhǔn)：( 1 ) 2015 年 1 月至 2016 年 12 月期間接受手術(shù)治療的骨肉瘤者；( 2 ) 術(shù)前未經(jīng)任何治療者；( 3 ) 術(shù)后病理提示骨肉瘤者。

2. 排除標(biāo)準(zhǔn)：( 1 ) 術(shù)前經(jīng)受過(guò)放化療等手術(shù)外其它治療方式者；( 2 ) 術(shù)后病理提示非骨肉瘤者。

本研究共納入 10 例。男 7 例，女 3 例，年齡( 20～45 ) 歲，平均 ( 25.42±6.35 ) 歲。腫瘤組織及癌旁組織離體后保存于液氮中，本研究所有受試者均簽署知情同意書，并且本研究已通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. 細(xì)胞及材料：細(xì)胞培養(yǎng)：U-2 OS 購(gòu)買于上海細(xì)胞庫(kù)，10% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)液，于 37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。試劑：Wnt 信號(hào)通路抑制劑 XAV-939 購(gòu)買于凱基公司，CCK-8 試劑盒購(gòu)買于上海翊圣生物科技有限公司。

2. siRNA 的合成及轉(zhuǎn)染：siRNA 由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)并合成。SNHG11 siRNA-1 sense：5'-GCTGGTTCCGCACCAGCCATT-3' siRNA-2sense：5'-ATGTTGGGAACATGCTAGATT-3' 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好細(xì)胞，將 2×105細(xì)胞接種于 6 孔板中，細(xì)胞密度達(dá)到 70% 左右用于轉(zhuǎn)染。根據(jù) Invitrogen 公司 LipofectamineTM2000 說(shuō)明書操作。將 200pmol 待轉(zhuǎn)染 siRNA 加入 250 μl OPTI-MEM 中，輕柔混勻待用。將 10 μl 脂質(zhì)體加入 250 μl OPTI-MEM 中，輕柔混勻。將前兩步所得試劑輕柔混勻，室溫靜置孵育20 min。將混合后的轉(zhuǎn)染試劑直接加入細(xì)胞培養(yǎng)孔混勻，8 h 后更換培養(yǎng)基。

3. qRT-PCR 檢測(cè) mRNA 表達(dá)水平：根據(jù) TAKARA 試劑盒說(shuō)明書操作。引物采用 Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)。

SNHG11 上下游引物序列：上游引物：5'-GGTGCTGTGTACCTCCTCC-3'；下游引物：5'-CAGATCAGGGTGCTGCAGG-3'；β-actin：上游引物：5'-GCAGAAGGAGATCA-CAGCCCT-3'；下游引物：5'-GCTGATCCACATCTGCTGGAA-3'，均由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。所有樣本均重復(fù)檢測(cè) 3 次，計(jì)算出 Ct 值，表達(dá)量采用 2-△△Ct法進(jìn)行計(jì)算分析。

△Ct＝目的基因平均 Ct 值-內(nèi)參基因平均Ct 值；

△△Ct＝實(shí)驗(yàn)組 △Ct-對(duì)照組 △Ct。

4. CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞增殖能力：將細(xì)胞接種至96 孔板，培養(yǎng) 24 h 后，向每孔中加入 10 微升 CCK溶液，孵育 4 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定在 450 納米處的吸光度。

5. 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期：采用凱基公司試劑盒，按其操作說(shuō)明書操作，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，完成相關(guān)處理后，培養(yǎng) 48 h 后，收集細(xì)胞，PBS 洗滌 2 次，用 75% 的乙醇固定細(xì)胞，24 h 后，去除乙醇，PBS 洗滌后，加入 PI 避光孵育，30 min后用流式細(xì)胞儀分析。

6. Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)水平：將貼壁細(xì)胞用 PBS 洗滌 2 次，采用 RIPA 試劑盒提取細(xì)胞總蛋白。BCA 法測(cè)定蛋白濃度。10% SDS-PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后 BSA 封閉，然后用蛋白一抗稀釋液孵育，4 ℃ 過(guò)夜。PBS 洗滌 2 次，二抗稀釋液室溫孵育 1 h。ECL 發(fā)光液發(fā)光，X 線底片曝光。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用 SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，qRT-PCR 結(jié)果應(yīng)用配對(duì)t檢驗(yàn)，CCK-8 實(shí)驗(yàn)應(yīng)用重復(fù)測(cè)量方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、SNHG11 在骨肉瘤中高表達(dá)

筆者利用 qRT-PCR 的方法檢測(cè)了 10 對(duì)骨肉瘤及其癌旁組織中 SNHG11 的表達(dá)，結(jié)果提示：SNHG11 在肉瘤組織中高表達(dá) ( 圖 1 )。

二、SNHG11 通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期進(jìn)展促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖

首先，筆者將 SNHG11 的 siRNA 轉(zhuǎn)染至 U-2 OS 細(xì)胞，CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn) U-2 OS 細(xì)胞增殖能力下降 ( 圖 2，表 1 )，而將 SNHG11 慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至 U-2 OS 細(xì)胞，細(xì)胞增殖能力上升，提示 SNHG11 促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖 ( 圖 2，表 2 )。然后，筆者利用將 U-2 OS 細(xì)胞中的 SNHG11 沉默或過(guò)表達(dá)，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期變化，發(fā)現(xiàn)沉默 U-2 OS 細(xì)胞中 SNHG11 的表達(dá)，細(xì)胞 G1 期比例增加，S 期比例下降，而過(guò)表達(dá)U-2 OS 細(xì)胞中 SNHG11，結(jié)果相反 ( 圖 3 )。以上結(jié)果提示：SNHG11 通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期進(jìn)展促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖。

圖 1 qRT-PCR 檢測(cè) SNHG11 在骨肉瘤組織及其癌旁組織中的表達(dá)水平Fig.1 SNHG11 expression level in OS tissues by qRT-PCR

三、SNHG11 激活骨肉瘤細(xì)胞中 Wnt 信號(hào)通路

將 U-2 OS 細(xì)胞中的 SNHG11 沉默表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Wnt 信號(hào)通路中 AXIN1 蛋白表達(dá)上調(diào)，而 β-catenin及其下游蛋白 c-myc、cyclinD1 表達(dá)下調(diào)，而在 U-2 OS 細(xì)胞過(guò)表達(dá) SNHG11，結(jié)果相反 ( 圖 4a )。之后筆者在 U-2 OS 細(xì)胞中過(guò)表達(dá) SNHG11，細(xì)胞增殖能力增加，而在細(xì)胞中過(guò)表達(dá) SNHG11 然后在用 Wnt信號(hào)通路抑制劑 XAV-939 處理細(xì)胞，SNHG11 促進(jìn)U-2 OS 細(xì)胞增殖能力不明顯 ( 圖 4b )，提示 SNHG11通過(guò)激活 Wnt 細(xì)胞通路促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖。

圖 2 SNHG11 促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖 a：qRT-PCR 驗(yàn)證 SNHG11 的干擾及過(guò)表達(dá)效率；b：沉默或過(guò)表達(dá) SNHG11，CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞增殖能力 ( **表示 P ＜ 0.01 )Fig.2 SNHG11 promoted OS cell proliferation a: SNHG11 expressions were detected by qRT-PCR; b: CCK-8 was used to evaluate proliferation ability of OS cells after SNHG11 down- or over-expression ( ** P ＜ 0.01 )

圖 3 SNHG11 誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞周期進(jìn)展 a：在骨肉瘤細(xì)胞中沉默 SNHG11 的表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期變化；b：在骨肉瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá) SNHG11，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期變化；c：對(duì)圖 a、b 統(tǒng)計(jì)分析 ( *表示 P ＜ 0.05 )Fig.3 SNHG11 induced cell cycle progression a: Flow Cytometry analyzed OS cell cycle changes after SNHG11 downexpression; b: Flow Cytometry analyzed OS cell cycle changes after SNHG11 overexpression; c: Statistics for a and b ( * P ＜ 0.05 )

表 1 SNHG11 沉默表達(dá)后 U-2 OS 細(xì)胞增殖能力的變化Tab.1 Proliferation of U-2 OS cells after SNHG11 siRNAs transfected

表 2 SNHG11 過(guò)沉默表達(dá)后 U-2 OS 細(xì)胞增殖能力的變化Tab.2 Proliferation of U-2 OS cells after SNHG11 overexpression

圖 4 SNHG11 激活 Wnt 信號(hào)通路 a：沉默或過(guò)表達(dá) SNHG11，western blot 檢測(cè) Wnt 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)；b：過(guò)表達(dá) SNHG11 或用 Wnt抑制劑處理細(xì)胞，CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞增殖能力變化Fig.4 SNHG11 activated wnt pathway a: Western bot analyzed key protein expression level in wnt pathway after SNHG11 down- or over-expression;b: CCK-8 evaluated OS cell proliferation after XAV-939 was applied to manage SNHG11 overexpression

討 論

近年來(lái)，lncRNA 在腫瘤中的作用逐漸被發(fā)現(xiàn)，越來(lái)越多的研究證明 lncRNA 可以調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移、腫瘤細(xì)胞代謝等[5-7]。例如：lncRNA ANRIL 可以通過(guò)激活骨肉瘤細(xì)胞中 PI3K / AKT 信號(hào)通路促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖[8]，因此 lncRNA 在骨肉瘤進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮非常重要的作用。

本研究，筆者證明 lncRNA SNHG11 在骨肉瘤組織中高表達(dá)，而且其可以促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖，提示其具有促進(jìn)骨肉瘤進(jìn)展的作用。目前尚無(wú)關(guān)于SNHG11 在腫瘤中相關(guān)作用的報(bào)道，本研究首次證明了 SNHG11 在骨肉瘤進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮舉足輕重的作用。

Wnt 信號(hào)通路的激活已經(jīng)被證明可以促進(jìn)多種腫瘤中包括骨肉瘤的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移，因此有學(xué)者提出抑制 Wnt 信號(hào)通路的活性可能能夠達(dá)到控制腫瘤的目的[9-10]。筆者的研究證明 SNHG11 可以通過(guò)激活 Wnt 信號(hào)通路促進(jìn)骨肉瘤的進(jìn)展。這為 Wnt 信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制提供了新的內(nèi)容。

總之，通過(guò)本研究筆者證明了 SNHG11 在骨肉瘤中發(fā)揮癌基因的作用，下調(diào) SNHG11 的表達(dá)可以抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖，并且 SNHG11 可以通過(guò)激活 Wnt 信號(hào)通路促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖。