朱道宇 楊前昊 高悠水 張長青

股骨頭壞死 ( osteonecrosis of the femoral head，ONFH )病因多樣，常導(dǎo)致股骨頭血液供應(yīng)破壞而引起軟骨下骨變性、壞死，繼而造成股骨頭塌陷，最終發(fā)展為嚴(yán)重的骨性關(guān)節(jié)炎，是青壯年髖關(guān)節(jié)置換最常見的原因[1]。其中大量使用糖皮質(zhì)激素最為多見，占 ONFH 的 45.6%[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，ONFH 與激素使用的最大劑量和累計(jì)劑量都有密切關(guān)系[3]。目前針對激素性 ONFH 的發(fā)病機(jī)制有多種假說，包括脂肪代謝紊亂、骨內(nèi)高壓、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞( mesenchymal stem cells，MSCs ) 分化障礙、血液內(nèi)凝血、二次碰撞等[4-5]，但均未能完全闡明。其中炎癥是激素性O(shè)NFH 發(fā)生發(fā)展的重要促進(jìn)因素之一。激素可以激活經(jīng)典的 TLR4 炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促使核因子 κB ( nuclear factor κB，NF-κB ) 入核，釋放大量炎癥因子，如 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 等[6-8]，并抑制 MSCs 成骨分化及鈣鹽沉積，促進(jìn)破骨細(xì)胞成熟，破壞血管穩(wěn)態(tài)，最終導(dǎo)致 ONFH[9]。

一、TLR4 / NF-κB 通路生物學(xué)概況

研究證實(shí)，炎癥及炎癥因子在腫瘤、自身免疫性疾病和退行性疾病等重大疾病中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，與疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[10]。在骨形成和血管形成體系中，Toll 樣受體 ( toll-like receptors，TLRs ) 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)發(fā)揮了核心作用。TLRs 是一類模式識別受體，能夠特異性識別病原微生物進(jìn)化中保守的抗原分子——病原相關(guān)分子模式 ( pathogen associated molecular patterns，PAMPs )[11]。它所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是人體應(yīng)對病原微生物和危險(xiǎn)信號產(chǎn)生免疫應(yīng)答的主要方式[12]。TLRs 的激活是一把雙刃劍，它可以通過刺激先天性免疫應(yīng)答和加強(qiáng)獲得性免疫反應(yīng)來保護(hù)機(jī)體，但是它所引起的持續(xù)性炎癥反應(yīng)也會(huì)對機(jī)體產(chǎn)生損傷。目前發(fā)現(xiàn)的 TLRs 家族至少包括12 個(gè)成員，不同的 TLRs 的配體也有所不同。其中 TLR4是介導(dǎo)內(nèi)毒素 / 脂多糖 ( lipopolysaccharide，LPS ) 應(yīng)答的最主要受體[13]。

TLR4 是 TLRs 家族的重要成員，也是人類發(fā)現(xiàn)的第一個(gè) TLRs 相關(guān)蛋白。TLR4 的結(jié)構(gòu)分為胞外域、跨膜域和胞內(nèi)域。胞外域?yàn)橐欢沃貜?fù)的亮氨酸序列，可介導(dǎo) PAMPs的識別。胞內(nèi)域是一段高度保守的序列，又稱為 TIR 區(qū)域。當(dāng) TLR4 與相應(yīng)配體結(jié)合后，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到 TIR 區(qū)域，TIR 原有二聚結(jié)構(gòu)改變，這種簡單的結(jié)構(gòu)重排將為激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路提供平臺[9,13]。根據(jù)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中銜接蛋白的不同，TLR4 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可分為 MyD88 依賴性或MyD88 非依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，繼而使 NF-κB 復(fù)合物中的抑制成分 IκB 磷酸化而脫顆粒，引起 NF-κB 的持續(xù)活化。活化的 NF-κB 遷移至核內(nèi)，與基因上的 κB 位點(diǎn)發(fā)生特異性結(jié)合，從而促進(jìn)各種炎癥因子的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生級聯(lián)炎癥反應(yīng)[14]。NF-κB 是炎癥反應(yīng)中主要的轉(zhuǎn)錄因子，可以同時(shí)調(diào)控成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，在維持骨穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要的作用。

二、TLR4 / NF-κB 通路是激素導(dǎo)致 ONFH 的重要途徑

糖皮質(zhì)激素是臨床常用的免疫調(diào)節(jié)類藥物，具有強(qiáng)烈的免疫抑制作用。然而近年研究發(fā)現(xiàn)，激素也可以發(fā)揮促炎作用。對激素作用后的免疫細(xì)胞進(jìn)行基因譜分析證實(shí)，激素不僅可以抑制免疫應(yīng)答相關(guān)基因的表達(dá)，同時(shí)也可以發(fā)揮免疫允許及免疫增強(qiáng)作用；對于同一種基因，在不同激活狀態(tài)的細(xì)胞中，激素也可以發(fā)揮截然相反的作用[15]。Barber 等[16]給受試者靜脈注射皮質(zhì)醇，隨后注射 LPS，與僅使用 LPS 對照的人群相比，血液中 TNF-α、IL-6 和IL-12 的水平顯著升高。糖皮質(zhì)激素對 TLR4 通路同樣呈雙向調(diào)節(jié)作用。激素可通過與特異性受體的結(jié)合，經(jīng)直接和間接的基因調(diào)控途徑抑制 NF-κB[17]；而激素對 TLR4 通路的激活作用可能源于激素作用過程中產(chǎn)生的熱休克蛋白90，熱休克蛋白 90 是 TLR4 的配體之一，對 TLR4 有較強(qiáng)的激活作用[13]。此外有研究表明，低濃度的激素可以通過抑制 PI3K-Akt 通路，從而增加骨髓來源的單核細(xì)胞對LPS 的敏感性，促進(jìn) TLR4 / NF-κB 通路的激活[18]。

激素可以通過激活 Myd88 依賴性的 TLR4 / NF-κB 通路破壞骨穩(wěn)態(tài)，抑制血管生成，引起 ONFH。壞死的骨組織可分泌肌腱蛋白和二聚糖，直接被 TLR4 識別，并進(jìn)一步激活 Myd88 依賴性的 TLR4 / NF-κB 通路，而 Myd88非依賴性的 TLR4 / NF-κB 通路不被激活[19-21]。在敲除了 Myd88 的小鼠中壞死骨組織對 TLR4 無激活作用[22]。Adapala 等[21]證實(shí)在激素性 ONFH 模型中，TLR4 基因表達(dá)明顯增多，而 TLR2 及 TLR9 沒有明顯改變。Tian 等[6]同樣在激素性 ONFH 模型中發(fā)現(xiàn) Myd88 依賴性的 NF-κB通路被激活，導(dǎo)致破骨細(xì)胞數(shù)量明顯增多；而注射 TLR4的特異性拮抗劑 TAK242 后，ONFH 發(fā)生率顯著降低。Okazaki 等采用肌注 LPS 和潑尼松的方法建立 Wistar 大鼠ONFH 模型，發(fā)現(xiàn)血清中的 IL-1β，IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，GM-CSF，IFN-γ 和 TNF-α 于第 1 周顯著上升。這些炎癥因子都是 TLR4 信號通路激活后的下游產(chǎn)物。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn) ONFH 只在 LPS＋潑尼松組中出現(xiàn)，單用潑尼松并不會(huì)在大鼠中誘發(fā) ONFH。研究者認(rèn)為，LPS 和潑尼松誘導(dǎo)骨壞死與自身免疫系統(tǒng)失衡、脂質(zhì)合成紊亂有關(guān)[23]。Pei 等[24]在激素性 ONFH 模型中發(fā)現(xiàn)，TLR4 可以通過抑制經(jīng)典的 Wnt / β-catenin 通路從而抑制成骨，而加入 NF-κB 的抑制劑 PDTC 后，Wnt / β-catenin 通路上調(diào)，ONFH 的發(fā)生率明顯下降。這些研究表明，經(jīng)典的炎癥通路 TLR4 / NF-κB 及相關(guān)炎癥因子在激素性 ONFH 中扮演著重要角色[25]。

1. TLR4 / NF-κB 與骨形成：激素性 ONFH 的病理表現(xiàn)為骨小梁上彌漫性空泡狀細(xì)胞，壞死骨組織被修復(fù)反應(yīng)區(qū)所包繞，由此可見股骨頭的自身修復(fù)反應(yīng)伴隨著骨壞死的發(fā)生即已出現(xiàn)。Qi 等[26]發(fā)現(xiàn)在干細(xì)胞的成骨分化中，TLR3，TLR4 的激活均可增加 I 型膠原和骨鈣素的表達(dá)，TLR4 的激活效果更顯著。Raicevic 等[27]研究發(fā)現(xiàn)激活TLR4 信號通路可促進(jìn) MSCs 向成骨方向分化，促進(jìn)鈣鹽沉積，增強(qiáng) ALP 活性，并且對骨髓來源的 MSCs 效果更為明顯。有研究者在小鼠中將 TLR4 基因全敲后構(gòu)建顱骨缺損模型，發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠相比，缺少 TLR4 基因的小鼠骨愈合明顯減慢[28]。然而，另有許多研究表明 TLR4 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對成骨可能有一定的抑制作用。Muthukuru 等[29]在比較 TLR2 和 TLR4 在成骨中的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，激活 TLR2可以顯著促進(jìn)成骨，而激活 TLR4 則明顯促進(jìn)炎癥因子IL-1β 的分泌，對成骨無明顯的促進(jìn)作用；但加入 TLR4的拮抗劑 Pg1449 后則可明顯促進(jìn)成骨分化。骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 ( bone morphogenetic protein-2，BMP-2 ) 是已知的具有較強(qiáng)促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和骨生成能力的刺激因子，但研究發(fā)現(xiàn)，即使在 BMP-2 刺激后，TLR4 被激活仍可顯著抑制成骨細(xì)胞分化，提示 TLR4 對成骨分化有極強(qiáng)的抑制作用[30]。這些相互矛盾的結(jié)果說明 TLR4 對成骨作用的復(fù)雜性。

2. TLR4 / NF-κB 與血管生成：激素性 ONFH 主要是由于血供中斷，局部缺血所引起的。血管能供給骨組織營養(yǎng)物質(zhì)，因此血管生成是骨組織修復(fù)所必須的。TLR4 在血管形成和維持體系中也發(fā)揮了重要作用。Echavarria 等發(fā)現(xiàn) LPS 可以激活內(nèi)皮細(xì)胞的 TLR4 信號通路，將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 ( human umbilical vein endothelial cells，HUVEC )暴露于 LPS 4～6 h，可誘導(dǎo)顯著的炎癥反應(yīng)，白細(xì)胞黏附分子 ( VCAM1，ICAM1，E-SELECTIN ) 表達(dá)上調(diào)、細(xì)胞因子表達(dá)增加 ( TNF-α，IL-1β，IL6，IL8 )、NF-κB 活性增強(qiáng)[31]。TLR4 是炎癥和血管再生的重要受體。對于炎癥而言，以 LPS 為代表的配體與 TLR4 結(jié)合，可激活巨細(xì)胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的炎癥因子，包括 ILs，TGF-β，IGF-1 等，這些炎癥因子可以加強(qiáng) VEGF 的功能。然而，很多誘導(dǎo)血管再生的因子也是炎癥因子，缺血組織再灌注時(shí)，發(fā)生的微血管功能異常和炎癥與這些炎癥因子密切相關(guān)。因此，TLR4 既參與炎癥，也參與血管化，它構(gòu)成了一種內(nèi)在的平衡。正常情況下不會(huì)造成組織損傷；異常情況時(shí)，若炎癥細(xì)胞因子占優(yōu)勢，則組織損傷顯著，若其占劣勢，則血管化不足，缺血不能有效改善。

3. TLR4 / NF-κB 與骨吸收：在 ONFH 的病理過程中，破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)，導(dǎo)致骨小梁吸收增多，也是股骨頭發(fā)生塌陷的主要原因之一。田雷等[7]在激素性 ONFH 模型中發(fā)現(xiàn) TLR4 通路被過度激活，可以引起免疫級聯(lián)效應(yīng)，使破骨細(xì)胞大量活化增殖，引起骨質(zhì)疏松，導(dǎo)致股骨頭抗壓能力減弱。TLR4 通路被激活后，可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中各種細(xì)胞因子和介質(zhì)的產(chǎn)生，在破骨細(xì)胞祖細(xì)胞的發(fā)育成熟中發(fā)揮著重要作用。此外，TLR4 還可促進(jìn)破骨細(xì)胞的融合和存活[32]。NF-κB 也可直接激活 MCP-1，誘導(dǎo)單核細(xì)胞 /巨噬細(xì)胞系分化，產(chǎn)生大量的破骨細(xì)胞。有研究表明大劑量激素可抑制破骨細(xì)胞的凋亡，延長其生存周期，促進(jìn)骨吸收[33]。因此 TLR4 / NF-κB 成為許多新型藥物的靶點(diǎn)。青藤堿可以通過抑制 TLR4 / TRAF6 的表達(dá)，抑制破骨細(xì)胞的分化與成熟，從而改善骨質(zhì)疏松[34]；另一種新型的金剛烷類維甲酸 ST1926，可以抑制 NF-κB，進(jìn)而抑制破骨細(xì)胞分化，改善被激素抑制的成骨基因表達(dá)及骨質(zhì)疏松[35]。

三、炎癥因子在 TLR4 影響 ONFH 中發(fā)揮著關(guān)鍵作用

TLR4 / NF-κB 通路被激活后可產(chǎn)生大量的炎癥因子，如細(xì)胞因子 ( TNF-α、IL-1β 和 IL-6 等 )、趨化因子、黏附分子、免疫識別受體及一些與炎癥級聯(lián)反應(yīng)相關(guān)的酶，在骨吸收與骨再生中發(fā)揮著重要作用。一般來說，促炎因子可以通過上調(diào) NF-κB 表達(dá)而抑制 MSCs 的成骨分化能力，而抗炎因子如 IL-10 和 IL-13 則起著相反的作用[36]。這些炎癥因子與激素性 ONFH 的發(fā)生發(fā)展也有著密切聯(lián)系[21,37-40]。其中，研究較多的炎癥因子包括 TNF-α、IL-1β 和 IL-6。

TNF-α 在不同濃度時(shí)對成骨分化可以起到截然相反的作用。在低濃度時(shí) TNF-α 可以劑量依賴性的促進(jìn) MSCs 成骨分化和基質(zhì)礦化，對膜內(nèi)成骨及軟骨內(nèi)成骨均有著重要的作用[41]。但在高濃度時(shí) TNF-α 可以下調(diào) Runx2 和骨鈣蛋白的表達(dá)，抑制成骨細(xì)胞分化和骨形成，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的凋亡[42]。此外，TNF-α 對破骨細(xì)胞也有較強(qiáng)的激活作用。TNF-α 可促進(jìn)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo) NF-κB活化以激活破骨細(xì)胞核心因子 NFATc1，并能增加 OSCAR的表達(dá)以促進(jìn)破骨細(xì)胞分化[43]。TNF-α 還可通過調(diào)控 Wnt信號通路影響破骨細(xì)胞的生成[35]。有研究顯示在激素性O(shè)NFH 的早期 TNF-α 活性增強(qiáng)，可引起 M1 極化的巨噬細(xì)胞聚集，造成股骨頭結(jié)構(gòu)的破壞，而在 ONFH 晚期 TNF-α活性降低，引起 M2 極化的巨噬細(xì)胞聚集，可以起到修復(fù)損傷的作用[44]。激素性 ONFH 患者行人工全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)前及術(shù)后血清中的 TNF-α 均顯著高于正常人[45]；羅南萍等同樣發(fā)現(xiàn) SONFH 患者血清中的 TNF-α 顯著高于正常人[46]；袁普衛(wèi)等建立兔的激素性 ONFH 模型后，發(fā)現(xiàn)壞死組中兔血清的 TNF-α 濃度明顯高于正常組，提示 TNF-α的水平升高與 ONFH 發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[47]。

IL-1β 對成骨的作用也較復(fù)雜。一方面 IL-1β 可以激活非經(jīng)典的 Wnt-5a / Ror2 通路從而有效的促進(jìn) MSCs 成骨分化[48]，另一方面 IL-1β 又可以上調(diào) Wnt 信號通路的拮抗劑 DKK1，從而抑制成骨基因的表達(dá)[49]。IL-1β 對破骨細(xì)胞也有較強(qiáng)的刺激作用，可以上調(diào) RANKL 的表達(dá)。Adapala 等[21]構(gòu)建了 Perthes 模型，發(fā)現(xiàn)修復(fù)區(qū) CD14＋巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯增多，TNF-α、IL-1β 和 IL-6 表達(dá)均升高2～3 倍，伴隨著 TLR4 通路的顯著激活。值得注意的是，TLR4 通路在刺激 TNF-α 和 IL-1β 表達(dá)的同時(shí)，也可通過這些細(xì)胞因子進(jìn)一步活化 NF-κB 造成持續(xù)的炎癥反應(yīng)。

IL-6 是成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞偶聯(lián)的關(guān)鍵因子，在關(guān)節(jié)炎癥與破壞中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。間充質(zhì)成骨系細(xì)胞分泌IL-6，通過接觸依賴性方式促進(jìn)破骨細(xì)胞生成，同時(shí)破骨細(xì)胞分泌 IL-6 以提高成骨細(xì)胞活性和促進(jìn)新生骨形成。在青春期前期過度表達(dá) IL-6 的小鼠表現(xiàn)出生長遲緩，胰島素樣生長因子 I 系統(tǒng)異常，生長板缺陷，骨化中心發(fā)育遲緩，成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞活性失調(diào)以及骨化不良[50]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，髖部骨折后下肢功能的恢復(fù)與血清 IL-6 水平呈負(fù)相關(guān)[51]。對 Perthes 病患者進(jìn)行基因檢測，發(fā)現(xiàn)在Perthes 患者中 IL-6 G-174C / G597A 基因多態(tài)性的雜合子受試者要明顯低于對照組[52]，進(jìn)一步研究表明 Perthes 患者中關(guān)節(jié)滑液里 IL-6 蛋白的表達(dá)顯著增高，提示 IL-6 基因在 Perthes 病的發(fā)生發(fā)展中起著一定作用[53]。

其它的炎癥因子研究較少，但對 ONFH 的產(chǎn)生也有一定作用。Tateda 等[54]研究發(fā)現(xiàn)激素可以抑制 NF-κB 的活性，但可通過激活 IRF7 的表達(dá)增加 IFN-α 的釋放，進(jìn)而引起 ONFH。另一種常見的炎癥因子，IL-36 在骨壞死中的表達(dá)增高，并可通過激活 ERK 通路，抑制 TGF-β 介導(dǎo)的 COL1 的表達(dá)[55]。Zheng 等[56]收集了 125 例 ONFH 患者的血清，并與正常人進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn) IL-33 明顯升高，同時(shí) III / IV 期患者 IL-33 的濃度顯著高于 I 收集期患者，提示 IL-33 可能對 ONFH 具有診斷意義，且與疾病的進(jìn)展相關(guān) ( 圖 1 )。

四、展望

激素型 ONFH 是受多種因素共同調(diào)節(jié)介導(dǎo)的疾病，炎癥反應(yīng)在 ONFH 的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。對TLR4 信號通路與 ONFH 相關(guān)性進(jìn)行深入研究，有助于解釋 ONFH 發(fā)病機(jī)制及病理過程，并為 ONFH 的治療提供新靶點(diǎn)和策略。目前，關(guān)于 TLR4 / NF-κB 通路參與 ONFH的具體機(jī)制仍不明確，研究多來源于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或體外試驗(yàn)，有效性并不十分明確，針對通路中潛在治療靶點(diǎn)的研究尚處于起步階段，均有待更加深入的研究。

圖 1 TLR4 信號通路作用機(jī)制Fig.1 The mechanism of TLR4 signaling pathway