楊彩玲，孟慶峰，王夢(mèng)嬌，袁菁菁，石志宇，張 遙，付少彬

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院，貴州 遵義 563099)

粉紅粘帚霉(GliocladiumroseumBainier.)屬半知菌門，絲孢綱，叢梗孢目，叢梗孢科，粘帚霉屬，是一種分布廣泛的土壤習(xí)居菌和重寄生菌，具有生長(zhǎng)速度快、產(chǎn)孢量大、寄主范圍廣、寄生能力強(qiáng)、拮抗機(jī)制多樣等優(yōu)點(diǎn)[1]。粉紅粘帚霉是農(nóng)業(yè)生物防治上極具潛力的生防因子之一。它能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶、纖維素酶、蛋白酶等細(xì)胞壁降解酶[2]，從而侵染核盤菌、禾谷鐮刀菌、立枯絲核菌、灰葡萄孢等多種對(duì)瓜果蔬菜、觀賞性植物、水稻具有危害性的病原真菌細(xì)胞壁[3]，達(dá)到生物防治的作用，避免化學(xué)防治所帶來(lái)的環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留以及病菌抗藥性等問(wèn)題。它在重金屬生物修復(fù)中也具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。Socrates等[4]研究發(fā)現(xiàn)G.roseum能使不溶性碳酸鉛轉(zhuǎn)化成可溶性草酸鉛，可修復(fù)采礦場(chǎng)周圍重金屬的污染。粉紅粘帚霉次生代謝物具有顯著的殺線蟲能力。Dong等[5]從菌株編號(hào)為YMF1.00133的粉紅粘帚霉屬小麥固體發(fā)酵物中分離出一系列具有殺線蟲作用的化合物gliocladine A-E，verticillin A，11'-deoxyverticillin A，sch52900和sch52901。Song等[6]繼續(xù)Dong等[5]的研究從G.roseumYMF1.00133小麥固體發(fā)酵物中分離得到2個(gè)具有殺線蟲活性化合物gliocladin C和5-n-heneicosylresorcinol。粉紅粘帚霉真菌在微生物轉(zhuǎn)化方面也有很好的應(yīng)用前景。G.roseum可通過(guò)經(jīng)濟(jì)環(huán)保、綠色可持續(xù)的方法進(jìn)行生物合成球形、結(jié)晶、單分散的硒納米粒子[7]。Andrés等[8]使用G.roseumCECT 2733微生物轉(zhuǎn)化方法實(shí)現(xiàn)了化學(xué)方法很難實(shí)現(xiàn)的倍半萜-4-羥基琥珀酸-1,6-二酮C-11位羥基化的轉(zhuǎn)化獲得3個(gè)新化合物。Fu等[9]使用G.roseumCGMCC 3.3657實(shí)現(xiàn)了結(jié)構(gòu)復(fù)雜的天然產(chǎn)物熊果酸飽和碳上的羥基化反應(yīng)，此生物轉(zhuǎn)化新產(chǎn)物較熊果酸具有較好的抗HCV活性。Fu等[10]還發(fā)現(xiàn)G.roseumCGMCC 3.3657對(duì)刺囊酸的微生物轉(zhuǎn)化可作為改造齊墩果酸五環(huán)三萜類化合物A環(huán)的新方法。

粉紅粘帚霉應(yīng)用廣泛，為了進(jìn)一步闡明G.roseumCGMCC 3.3657次生代謝產(chǎn)物種類，挖掘該菌株代謝產(chǎn)物可能存在的應(yīng)用價(jià)值，為新藥的開發(fā)和尋找新穎的化合物奠定基礎(chǔ)，本文對(duì)G.roseumCGMCC 3.3657的液體發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 儀器 Agilent DD2 400-MR NMR型核磁共振儀(美國(guó)，Agilent公司)；Sepacore中壓制備系統(tǒng)(瑞士，BüCHI公司)；RE-2000E型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(中國(guó)上海，上海亞榮生化儀器廠)；BS-2F型恒溫?fù)u床(中國(guó)江蘇，常州華冠儀器制造有限公司)；SW-CJ-1D型生物凈化臺(tái)(中國(guó)蘇州，蘇州凈化儀器有限公司)；BXM-30R型立式壓力蒸汽滅菌器(中國(guó)上海，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)；ZF-7型三相紫外分析儀(中國(guó)上海，上海嘉鵬科技有限公司)。

1.2 材料 反相C18填料(日本，日本富士硅化學(xué)株式會(huì)社)；GF254薄層色譜硅膠和300～400目柱色譜硅膠(中國(guó)青島，青島海洋化工公司)；G.roseumCGMCC 3.3657(中國(guó)微生物菌種保藏中心)，菌種PDA斜面保藏于4 ℃冰箱。

1.3 菌株的液體發(fā)酵培養(yǎng)和次生代謝產(chǎn)物的萃取 將土豆削皮切小塊加入水中煮大約30 min，用8層紗布過(guò)濾土豆湯汁，加入葡萄糖混勻分裝(土豆∶葡萄糖∶蒸餾水=1∶0.1∶5)，121 ℃高溫滅菌20 min。在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)將保存的G.roseumCGMCC 3.3657活化2次后挑取3小塊菌絲體連同培養(yǎng)基接種到盛有40 mL PDA培養(yǎng)液的100 mL錐形瓶?jī)?nèi)，150 r/min 28 ℃搖床培養(yǎng)4 d制作母液。同樣在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)將母液接種到含有400 mL培養(yǎng)液的1 L錐形瓶?jī)?nèi)，一共30 L培養(yǎng)液以同樣條件發(fā)酵培養(yǎng)15 d。發(fā)酵完成后抽濾瓶過(guò)濾菌絲體和發(fā)酵液，乙酸乙酯萃取3次，減壓濃縮得粗提物6.0 g。

1.4 粗提物的分離純化 粗提物6.0 g經(jīng)中壓C18柱色譜(50 mm×460 mm)甲醇-水(10%→100%,v/v)梯度洗脫粗分成6部分(Fr.1～6)。Fr.3用硅膠柱層析(石油醚∶丙酮=2∶1,v/v)等度洗脫得化合物3(17 mg)和化合物4(80 mg)；Fr.4用硅膠柱層析(石油醚∶丙酮=1.5∶1,v/v)等度洗脫，得化合物1(25 mg)和化合物2(749.2 mg)。

2 結(jié)果

對(duì)絲狀真菌G.roseumCGMCC 3.3657進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，通過(guò)中壓色譜和硅膠色譜對(duì)乙酸乙酯提取物進(jìn)行分離純化，得到4個(gè)苯酚類化合物(見圖1)，分別鑒定為：①對(duì)羥基苯甲醛;②對(duì)羥基苯甲酸;③3,4-二羥基苯甲酸;④3,5-二羥基苯甲酸。

A:對(duì)羥基苯甲醛; B:對(duì)羥基苯甲酸; C:3,4-二羥基苯甲酸; D:3,5-二羥基苯甲酸。圖1 化合物1-4的結(jié)構(gòu)

2.1 化合物1黃色結(jié)晶，25 mg。1H NMR(400 MHz，C3D6O)δ: 9.73(1H,s,CHO-1) ,7.75(2H,d,J= 8.6 Hz,H-2,6),6.89(2H,d,J= 8.6 Hz,H-3,5)。13C-NMR(100 MHz,C3D6O)δ: 191.16(CHO),163.88(C-4),132.79(C-2,6),115.76(C-3,5)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道一致，確定化合物1為對(duì)羥基苯甲醛(PHB)。

2.2 化合物2白色粉末，749.2 mg。1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ: 7.86(2H,dd,J= 8.5,1.1 Hz,H-2,6),6.82(2H,td,J= 8.0,4.4 Hz,H-3,5)。13C-NMR(100 MHz,C3D6O)δ: 167.27(C-7),161.82(C-4),131.87(C-2,6),121.57(C-1),115.10(C-3,5)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]基本一致，確定化合物2為對(duì)羥基苯甲酸(PHBA)。

2.3 化合物3白色粉末，17 mg。1H NMR(400 MHz,CD3OD)δ: 7.34(1H,d,J= 2.0 Hz,H-2),7.29 (1H,dd,J= 8.4,2.0 Hz,H-6),6.79(1H,d,J= 8.0 Hz,H-5)。13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ: 168.08(COOH),151.08(C-4),145.90(C-3),123.97(C-6),123.40(C-1),117.80(C-2),116.03(C-5)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道一致，確定化合物3為3,4-二羥基苯甲酸。

2.4 化合物4黃色結(jié)晶，80 mg。1H NMR(400 MHz,CD3OD)δ: 7.86(1H,dd,J= 8.5 Hz),6.82 (2H,td,J= 8.0,4.4 Hz)，13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ: 168.91(COOH),158.05(C-3,5),132.15(C-1),107.91(C-2,6),106.97(C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道一致，確定化合物4為3,5-二羥基苯甲酸。

3 討論

微生物是先導(dǎo)化合物的重要來(lái)源，真菌是微生物的重要類群之一，種類繁多，形態(tài)各異，生活環(huán)境多樣，真菌中分離得到的代謝產(chǎn)物也多種多樣。從產(chǎn)抗生素-青霉素的青霉到產(chǎn)抗腫瘤藥物紫杉醇的內(nèi)生真菌，真菌化學(xué)成分一度成為藥學(xué)家和化學(xué)家的研究熱點(diǎn)之一。本文從真菌G.roseumCGMCC 3.3657次生代謝產(chǎn)物中分離得到4個(gè)苯酚類化合物，其中對(duì)羥基苯甲酸的含量較高，分離得到749.2 mg，占乙酸乙酯提取物的12.5%以上，可把該菌株作為生產(chǎn)對(duì)羥基苯甲酸的很好的選擇方法。

簡(jiǎn)單的羥基苯甲酸類化合物由莽草酸代謝途徑的早期中間產(chǎn)物3-去羥基莽草酸或分支酸合成。簡(jiǎn)單的苯酚類化合物是重要的精細(xì)化工中間體，可作為食品、化妝品、醫(yī)藥、農(nóng)藥等行業(yè)的應(yīng)用原料[15]。曾有研究表明對(duì)羥基苯甲醛(PHB)具有抗血小板聚集[16]、保護(hù)血腦屏障損傷[17]、抗炎[18]的生物活性。3,4-二羥基苯甲酸又稱原兒茶酸，具有神經(jīng)保護(hù)、抗血小板凝集、降低心肌耗氧量、抑菌、鎮(zhèn)痛等多種生物活性與藥理作用[19]。

對(duì)羥基苯甲酸(PHBA)常用于PHBA酯類化合物尼泊金的合成，尼泊金是目前使用最多的防腐劑[20]。PHBA的另外一個(gè)重要用途是其乙酸酯經(jīng)熔融和固相聚縮合后獲得合成具有實(shí)用價(jià)值的液晶高分子材料[21]。國(guó)內(nèi)外對(duì)對(duì)羥基苯甲酸的需求逐年上漲，開發(fā)利用可再生資源的生產(chǎn)工藝是當(dāng)務(wù)之急。學(xué)者朱莉綜述了微生物合成對(duì)羥基苯甲酸的研究，并從生物合成經(jīng)濟(jì)環(huán)保的角度認(rèn)為該方法理論上要優(yōu)于其他合成方法[22]。3,5-二羥基苯甲酸(3,5-DHBA)可特異性激動(dòng)HCA1受體，抑制脂肪細(xì)胞中的脂解作用，但不抑制HCA1缺陷的脂肪細(xì)胞中的脂解作用，是體內(nèi)研究HCA1功能的有用工具[23]。3,5-DHBA和3-(3,5-二羥基苯基)-1-丙酸(3,5-DHPPA)可以與5-(3,5-二羥基苯基)-戊酸(3,5-DHPPTA)和2-(3,5-二羥基苯甲酰胺基)-乙酸(3,5-DHBA glycine)組合使用作為生物標(biāo)記物，可提高統(tǒng)計(jì)學(xué)研究中全麥和黑麥攝入量統(tǒng)計(jì)的準(zhǔn)確性[24]。

本研究從真菌G.roseumCGMCC 3.3657乙酸乙酯提取物中分離得到4個(gè)苯酚類化合物：①對(duì)羥基苯甲醛;②對(duì)羥基苯甲酸;③3,4-二羥基苯甲酸;④3,5-二羥基苯甲酸，均為首次從該屬真菌中分離得到，為G.roseumCGMCC 3.3657的生物活性物、次生代謝產(chǎn)物的應(yīng)用等提供了參考價(jià)值。