劉安然 廖梅杰 李 彬 王印庚 榮小軍 張 正 范瑞用 陳貴平

(1.上海海洋大學(xué) 上海 201306；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071；3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室 青島 266071；4.青島瑞滋海珍品發(fā)展有限公司 青島 266400)

刺參(Apostichopus japonicus)是我國北方重要的海珍品之一(廖玉林, 1997)。近年來，我國刺參養(yǎng)殖規(guī)模拓展迅猛，2016年海參養(yǎng)殖面積為218138 hm2，產(chǎn)量為204359 t，直接經(jīng)濟(jì)產(chǎn)值約300億元(中國漁業(yè)年鑒, 2017)，成為沿海漁業(yè)經(jīng)濟(jì)結(jié)構(gòu)調(diào)整和漁民就業(yè)及增產(chǎn)增收的重要途徑。但隨著刺參產(chǎn)業(yè)規(guī)模的不斷拓展，種質(zhì)退化、生長緩慢、養(yǎng)殖周期長、抵御環(huán)境變化能力差、病害頻發(fā)等一系列制約或潛在制約產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸問題也日益凸顯(王印庚等, 2014)。良種選育是解決上述問題的有效手段。在良種選育過程中，分子標(biāo)記輔助選擇育種(Marker-assisted selection, MAS)在選擇效率和選擇準(zhǔn)確性上表現(xiàn)出良好的應(yīng)用潛力(Würschumet al, 2014)。

在水產(chǎn)動物分子標(biāo)記輔助育種方面，隨著分子技術(shù)的發(fā)展，構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，挖掘數(shù)量性狀基因座(Quantitative trait locus, QTL)，利用與目標(biāo)性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記促進(jìn)對性狀的遺傳改良是當(dāng)今水產(chǎn)動物遺傳育種的研究熱點(Collardet al, 2005)。目前，已經(jīng)構(gòu)建遺傳連鎖圖譜并發(fā)掘了候選 QTL標(biāo)記的水產(chǎn)物種有鯉魚(Cyprinus carpio)(Zhaoet al, 2013)、半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)(Chuet al, 2014)、中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)(Qiuet al, 2016)、貽貝(Hyriopsis cumingii)(Baiet al, 2015)、九孔鮑魚(Haliotis diversicolor)(Renet al, 2016)、大西洋鮭魚(Salmo salar)(Gonenet al, 2015)等。隨著刺參分子標(biāo)記的開發(fā)，Tian等(2015)構(gòu)建了高密度刺參遺傳連鎖圖譜，并篩選出一個與生長關(guān)聯(lián)的QTL；和飛(2016)發(fā)掘了刺參的 9個與生長和對燦爛弧菌(Vibrio splendidus)的抗病力相關(guān)的QTL。這些分子標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)為刺參的良種選育提供了寶貴資料。QTL的驗證和鑒定是實施MAS的前提(Houet al, 2011)，本研究在前期構(gòu)建的刺參遺傳連鎖圖譜和QTL分析的基礎(chǔ)上，篩選與體重、體長、體寬、棘刺總數(shù)、抗病力5個性狀相關(guān)的SNP位點，并在擴(kuò)大繁育群體中進(jìn)行驗證，評估不同基因型與相關(guān)性狀的相關(guān)性，以期獲得真實可靠的 QTL結(jié)果，為刺參的分子標(biāo)記輔助選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用刺參苗種采集自青島瑞滋海珍產(chǎn)品發(fā)展有限公司，為同一批次大規(guī)模育苗并同一養(yǎng)殖條件下培育的 8月齡苗種，該批苗種繁育用親本數(shù)量為800頭，苗種繁育與培育參照該公司《苗種繁育技術(shù)規(guī)范》進(jìn)行。苗種采集后暫養(yǎng)于實驗室玻璃鋼桶(D=80 cm，h=60 cm)內(nèi)，充氣，水溫(18.0±0.5)℃，每天換水1/2，每天投喂1次。暫養(yǎng)穩(wěn)定后用于后續(xù)實驗。

1.2 實驗方法

1.2.1 刺參生長性狀的測量 隨機(jī)選擇 200頭刺參苗種進(jìn)行體長、體寬、體重和棘刺總數(shù)的測定。體長、體重測量方法：用0.6 mol/L的MgSO4溶液浸泡參苗，待參苗麻醉后，用圓規(guī)標(biāo)定參苗長度后，再用游標(biāo)卡尺測量其體長、體寬，精確到0.01 cm；用電子天平測量其體重，精確到0.01 g，并記錄每個刺參的棘刺總數(shù)(魏杰等, 2007； 廖梅杰等, 2010)。分別解剖分離其縱肌組織，于95%乙醇中，-20℃保存。

1.2.2 刺參抗病力性狀的測量 隨機(jī)選擇 200頭刺參苗種進(jìn)行人工攻毒浸染實驗，攻毒所用菌株為實驗室分離保存的刺參腐皮綜合征重要致病原-燦爛弧菌，人工浸染濃度為 1.0×107CFU/ml，攻毒實驗為期30 d。攻毒期間，每3 d換水1次，換水后及時補充病原菌，每天觀察刺參苗種化皮情況，對攻毒期間出現(xiàn)化皮癥狀的苗種及時撈出，記錄其發(fā)病時間(記錄為存活天數(shù))并分離保存其縱肌組織。到攻毒實驗結(jié)束時，仍未出現(xiàn)化皮癥狀的苗種記錄為抗病苗種，其發(fā)病時間統(tǒng)一記錄30 d。實驗結(jié)束后分別解剖分離其縱肌組織置于95%乙醇中，-20℃保存(和飛等, 2017)。同時，設(shè)置未攻毒感染組作為對照組，以排除環(huán)境對刺參發(fā)病的影響。

1.2.3 基因組DNA的提取 使用Omega軟體動物DNA提取試劑盒提取基因組DNA，相關(guān)操作參照試劑盒說明書。用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性；用NanoDrop分光光度計測DNA的濃度，將提取的DNA統(tǒng)一稀釋成50 ng/μl，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 SNP位點的篩選和引物設(shè)計 在前期構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜中篩選到與體長、體寬、體重、棘刺總數(shù)及抗病力5個性狀相關(guān)的9個QTL，這9個QTL包含81條SLAF標(biāo)簽、189個SNP位點。依據(jù)HRM分型的條件，挑選SNP位點兩側(cè)側(cè)翼序列大于200 bp且無不確定堿基，并且 SNP的突變頻率＞1%的測序序列，利用軟件Primer Premier5.0進(jìn)行SNP擴(kuò)增用引物設(shè)計，引物設(shè)計原則為長度在 20 bp左右，GC含量為45%～65%，產(chǎn)物鏈長度不超過120 bp，且利用Oligo7.0分析引物參數(shù)時不能有能值高的錯配、二聚體和發(fā)卡結(jié)構(gòu)。同時，合成HRM基因分型所需的標(biāo)尺高低溫內(nèi)標(biāo)及其反向互補序列(王婷等, 2014)。SNP引物和內(nèi)標(biāo)引物送生工生物工程(上海)技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行引物合成。

1.2.5 PCR擴(kuò)增及基因分型 自生長性狀和抗病性狀測定群體中各選取 96個個體，采用(HRM)法(Reedet al, 2007)進(jìn)行SNP位點的PCR擴(kuò)增和基因分型。10 μl PCR 反應(yīng)體系：DNA 模板 1 μl (50 ng/μl)，4.5 μl 2×ESTaqMaster Mix，上下游引物各 0.5 μl(10 μmol/L)，3.5 μl ddH2O；PCR 反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性 5 min；94℃變性 30 s，退火 30 s(退火溫度見表1)，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)；最后72℃延伸7 min，4℃保存。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。向PCR產(chǎn)物中加入染料LC Green 1.0 μl，高低溫內(nèi)標(biāo)的正負(fù)向引物各0.25 μl，95℃變性5 min后降溫至4℃保存，利用Light Scanner進(jìn)行基因分型，基因分型用程序為以0.1℃/s的速度從56℃快速升溫到97℃，并以1次/s的密度采集熒光信號，得到熔解曲線，采集結(jié)束后用Light Scanner配套軟件對熔解曲線進(jìn)行分析(Tinget al, 2014)。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 統(tǒng)計各 SNP位點的基因分型結(jié)果，利用Popgene32軟件處理統(tǒng)計各位點上的最小等位基因頻率(Minor allele frequency, MAF)、觀測雜合度(Observed heterozygosity,Ho)、期望雜合度(Expected heterozygosity,He)和固定指數(shù)(Fixation index,F)，并進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢測。用Cervus軟件計算各位點多態(tài)信息含量(Polymorphism information content,PIC)等指標(biāo)。

利用SPSS20對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，用一般線性模型(GLM)對各 SNP位點以及二倍型與 5個性狀的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行最小二乘分析，采用Ducan’s多重比較分析 SNP位點各基因型、二倍型在生長及抗病性狀差異的顯著性，顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物設(shè)計結(jié)果

根據(jù)實驗室前期高密度遺傳連鎖圖譜和 QTL分析結(jié)果對所篩選的189個候選SNP位點的序列進(jìn)行分析，篩選到可用于設(shè)計SNP擴(kuò)增的引物序列26條，依據(jù)引物設(shè)計條件，成功設(shè)計SNP擴(kuò)增引物14對，但鑒于SNP107位點引物與高溫內(nèi)標(biāo)重合，最后用于SNP驗證的擴(kuò)增引物共13對，相關(guān)引物具體信息見表 1。其中，與體長性狀相關(guān)的候選 SNP位點 4個(SNP6、SNP9、SNP40和SNP160)，與體寬相關(guān)的候選位點6個(SNP6、SNP9、SNP40、SNP64、SNP140和 SNP160)，與體重相關(guān)的候選位點 4個(SNP6、SP40、SNP64和SNP160)，與棘刺總數(shù)相關(guān)的候選位點 5個(SNP6、SNP40、SNP64、SNP91和 SNP160)，與抗病力相關(guān)的候選SNP位點11個(SNP6、SNP9、SNP64、SNP88、SNP91、SNP109、SNP112、SNP113、SNP126、SNP134和 SNP160)。由此可見，SNP6、SNP9、SNP64和 SNP160這 4個候選位點既與生長性狀相關(guān)，也與抗病力相關(guān)。

2.2 SNP多態(tài)性分析

利用13對引物對所檢測的個體進(jìn)行基因分型，利用Popgen32對所獲得的所有個體的基因型統(tǒng)計分析。結(jié)果顯示，3個位點(SNP6、SNP64和 SNP91)在檢測群體中沒有多態(tài)性，為單態(tài)位點，其余10個位點為多態(tài)性位點。10個多態(tài)性位點的最小等位基因頻率(MAF)介于 0.016(SNP9)～0.332(SNP160)之間，平均值為 0.173；各位點的觀測雜合度(Ho)介于 0.031(SNP113)～0.818(SNP9)之間，平均值為0.433；期望雜合度(He)介于 0.031(SNP113)～0.834(SNP9)之間，平均值為0.402；多態(tài)信息含量(PIC)介于0.030(SNP113)～0.393(SNP160)之間，平均0.248(表2)。6個位點的觀測雜合度(Ho)大于期望雜合度(He)，固定指數(shù)(F)只有在 SNP160位點是正值，其他均為負(fù)值；Hardy-Weinberg平衡分析結(jié)果顯示，有6個SNP位點顯著偏離平衡(P<0.05)。

2.3 SNP位點與相關(guān)性狀的關(guān)聯(lián)性驗證

對刺參體長、體重、體寬、棘刺總數(shù)和抗病力性狀與10個多態(tài)性SNP標(biāo)記的相關(guān)性分析結(jié)果見表3。經(jīng)驗證，SNP40、SNP88、SNP112、SNP126和SNP160位點與所關(guān)聯(lián)的性狀顯著相關(guān)(P＜0.05)。位點SNP40和SNP160與體長、體重、體寬、棘刺總數(shù)呈顯著相關(guān)，其中，SNP40與體長、體寬、體重呈極顯著相關(guān)(P＜0.01)；SNP160與體寬、體重呈極顯著相關(guān)(P＜0.01)；SNP88、SNP126與存活天數(shù)顯著相關(guān)(P＜0.05)；位點SNP112與存活天數(shù)極顯著相關(guān)(P＜0.01)。

2.4 SNP各位點不同基因型與生長性狀的相關(guān)性分析

對與5個經(jīng)濟(jì)性狀顯著相關(guān)的10個多態(tài)性SNP位點進(jìn)行不同基因型與生長性狀多重比較分析，結(jié)果見表4。SNP40的CC基因型的個體在體長、體重、體寬、棘刺總數(shù)4個性狀的平均值顯著高于CT基因型的個體(P＜0.05)；SNP88、SNP112、SNP126 基因型分別為 CC、AA、TT的個體在燦爛弧菌的攻毒實驗中的存活天數(shù)的平均值顯著高于CT、AG、TG基因型(P＜0.05)；SNP160的AA基因型個體在體長、體重、體寬、棘刺總數(shù)的平均值顯著高于基因型CC的個體。由此可見，與生長和棘刺相關(guān)的 SNP40和SNP160位點的優(yōu)勢基因型分別為CC和AA；抗病力相關(guān)的SNP88、SNP112和SNP126位點的優(yōu)勢基因型分別為CC、AA和TT。

表1 刺參13個SNP位點引物信息Tab.1 Information of 13 SNPs of A.japonicus

表2 10個多態(tài)性SNP位點的遺傳參數(shù)Tab.2 Genetic diversity at 10 polymorphic SNPs of A.japonicus

2.5 SNP二倍型構(gòu)建及其與性狀的關(guān)聯(lián)分析

分別對與抗病力相關(guān)和與生長性狀相關(guān)的 SNP位點構(gòu)建二倍型，比較二倍型關(guān)聯(lián)性狀之間的差異顯著性，結(jié)果分別見表5、表6。利用SNP88、SNP112和SNP126這3個抗病力相關(guān)的SNP位點在檢測群體中共檢測到6種二倍型，其中，K1(CC AA TT)的存活天數(shù)最高，該基因型所有個體在整個攻毒期間均未發(fā)病，K2(CC AA TG)次之，但都顯著高于其他二倍型；利用SNP40和SNP160這2個與生長和棘刺性狀相關(guān)的SNP位點，在檢測群體中共檢測到6種二倍型，關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，S1(CC AA)和S3(CC AC)在生長性狀(體長、體重、體寬)上顯著優(yōu)于其他二倍型。而棘刺總數(shù)性狀關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，S5(CT AC)為劣勢基因型，其他幾種二倍型差異不大。

表3 SNP位點與體長、體重、體寬、棘刺總數(shù)、存活天數(shù)相關(guān)性分析結(jié)果Tab.3 Significant correlation analysis between SNP loci and body length, body weight, body breadth, pallet number and survival day

表4 SNP位點不同基因型在關(guān)聯(lián)性狀的多重比較分析Tab.4 Multiple comparisons of related traits with genotypes of SNP

表5 SNP二倍型與刺參抗病力的關(guān)聯(lián)分析Tab.5 Association between diplotypes of SNPs and disease resistance

表6 SNP二倍型與刺參生長性狀的關(guān)聯(lián)分析Tab.6 Association between diplotypes of SNPs and growth trait

3 討論

分子標(biāo)記輔助水產(chǎn)動物育種是目前水產(chǎn)動物遺傳育種的研究重點，但由于小樣本作圖 QTL區(qū)間過大，且數(shù)量性狀受環(huán)境影響大，導(dǎo)致 QTL的檢測和對QTL效應(yīng)評估發(fā)生偏離(Würschumet al, 2014)，在一個群體或者家系中定位到的 QTL可能不適用于另一個家系或者群體，因此，QTL的驗證和鑒定是實施MAS的前提(Houet al, 2011)。目前，在水產(chǎn)物種中已進(jìn)行了QTL驗證的相關(guān)研究報道，Wang等(2014)對牙鲆(Paralichthys olivaceus)的抗病力關(guān)聯(lián)的 QTL進(jìn)行驗證，韋國建等(2015)對馬氏珠母貝(Pinctada martensii)的2個生長關(guān)聯(lián)基因進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢基因型。隨著刺參研究熱度的增加(孫國華等, 2011)，目前對刺參性狀相關(guān)SNP發(fā)掘越來越多，Gao等(2013)開發(fā)了 26個與刺參的防御機(jī)制相關(guān)的 SNP位點；Dong等(2016)在對野生和人工養(yǎng)殖的刺參遺傳多樣性和種群結(jié)構(gòu)的研究中，利用HRM發(fā)掘了51個相關(guān)SNP位點，解釋了遺傳多樣性降低的原因；Li等(2016)發(fā)現(xiàn)了與刺參干重相關(guān)的3個SNP位點；董玉等(2016)在對SNP與生長的關(guān)聯(lián)分析中發(fā)現(xiàn)了10個與生長性狀顯著相關(guān)的位點。但這些標(biāo)記是否能直接用于遺傳育種，需在擴(kuò)大群體中進(jìn)一步驗證。本研究是在前期高密度遺傳連鎖圖譜和 QTL分析獲得的候選SNP位點的基礎(chǔ)上，在擴(kuò)大群體中對獲得的SNP位點進(jìn)一步驗證，篩選出可用于遺傳育種、與生長性狀和抗病力相關(guān)的SNP位點，并確定其優(yōu)勢基因型，可為分子標(biāo)記輔助育種在育種生產(chǎn)中直接應(yīng)用提供技術(shù)支撐。

QTL驗證分析的關(guān)鍵步驟是對SNP進(jìn)行準(zhǔn)確的基因分型，目前已有多種 SNP分型方法：半熱不對稱反向 PCR(Semi-thermal asymmetric reverse PCR)(Longet al, 2015)；多光譜分析法(Mass spectrometry)(Parkaet al, 2017)、Fast-GBS(Fast Genotyping-bysequencing) (Torkamanehet al, 2017)。SNP的檢測方法雖有很多種，但受設(shè)備與試劑昂貴、檢測時間長、步驟繁瑣的限制，不便大規(guī)模應(yīng)用。近年來興起的高分辨率熔解曲線分析技術(shù)(High Resolution Melting,HRM) (Liet al, 2012)，因其具有靈敏度高、特異性好、操作簡便、能實現(xiàn)真正的閉管操作、分型結(jié)果準(zhǔn)確率高、費用成本較低的優(yōu)勢，已被廣泛用于 SNP的檢測和分型(Liewet al, 2004)。本研究對13個位點的多態(tài)性分析結(jié)果表明，10個SNP位點的多態(tài)信息含量在0.030～0.393之間，沒有高等位多態(tài)性的位點，這與 SNP為二等位標(biāo)記、基因型較少有關(guān)(Bmokes,1998)。檢測結(jié)果中，位點SNP9、SNP40和SNP134所檢測的個體中的期望雜合度大于觀測雜合度，其他位點的觀測雜合度大于期望雜合度，但相差不大，固定指數(shù)(F)除位點SNP160是正值，其他均為負(fù)值，說明普遍存在雜合子缺失現(xiàn)象，這可能是選育造成純合度增加導(dǎo)致。

孫效文等(2010)建議，將 QTL結(jié)果應(yīng)用育種之前，最好在大樣本量的隨機(jī)群體中進(jìn)行驗證，以增加QTL在育種群體中的利用價值。本研究對10個多態(tài)性的候選性狀關(guān)聯(lián)位點與性狀進(jìn)行相關(guān)性分析驗證，篩選出5個性狀相關(guān)位點，驗證成功率為50%。由此可見，在擴(kuò)大群體中對 QTL位點進(jìn)行驗證對提高標(biāo)記的準(zhǔn)確性具有重要意義。對所檢測 SNP位點與相關(guān)性狀的關(guān)聯(lián)性驗證表明，位點 SNP40和 SNP160與體長、體重、體寬、棘刺總數(shù)4個性狀均呈顯著相關(guān)，即出現(xiàn)了同一個位點關(guān)聯(lián)多個性狀的現(xiàn)象，說明這4個性狀之間存在一定程度的關(guān)聯(lián)，相關(guān)結(jié)果可為刺參不同性狀間的間接良種選育提供參考。孫文靜(2010)和董玉等(2016)相關(guān)研究結(jié)果也表明，刺參所檢測的相關(guān) SNP位點同時與體長、體寬、體重和體壁重4個性狀顯著相關(guān)，相關(guān)研究結(jié)果與本結(jié)果基本一致。此外，在抗病力相關(guān)SNP位點檢測中，SNP88、SNP112和SNP126均與抗病力顯著相關(guān)，出現(xiàn)一個性狀有多個 SNP位點與之關(guān)聯(lián)的現(xiàn)象，表明該性狀受多個位點控制，符合數(shù)量遺傳學(xué)相關(guān)理論(孫效文,2010)。抗病力相關(guān)SNP位點與生長相關(guān)SNP位點不存在重合現(xiàn)象，表明生長與抗病力2個性狀相關(guān)性不大，后期選擇育種過程中需作為2個性狀進(jìn)行獨立選擇。

對同一個 SNP位點不同基因型關(guān)聯(lián)性狀的多重比較分析結(jié)果顯示，生長和刺型相關(guān)SNP位點SNP40和SNP160的優(yōu)勢基因型分別為CC和AA，抗病力相關(guān) SNP位點 SNP88、SNP112、SNP126的優(yōu)勢基因型分別為 CC、AA、TT。由此可見，相應(yīng)位點的純合型會表現(xiàn)出更好的表型，在以后的選育工作中可對相應(yīng)基因進(jìn)行篩選與組合。

為了降低利用單個 SNP標(biāo)記進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)分析的局限性，本研究對性狀相關(guān)的多個 SNP位點通過構(gòu)建二倍性相關(guān)分析，以提高分析的準(zhǔn)確性(De Bakkeret al, 2005)。利用SNP40、SNP160構(gòu)建的與生長相關(guān)的二倍型，顯示S1(CC AA)和S3(CC AC)在生長性狀(體長、體重、體寬)上顯著優(yōu)于其他二倍型，均為與生長性狀(體長、體重、體寬)相關(guān)的優(yōu)勢基因型組合，證明 SNP40位點對生長貢獻(xiàn)率更大一些，鑒于 SNP40、SNP160分別位于LG22和LG19連鎖群上，二者不存在連鎖效應(yīng)，在將來育種實踐中對攜帶這 2個位點優(yōu)勢基因型的親本進(jìn)行組合構(gòu)建優(yōu)勢二倍型個體。同樣，利用SNP88、SNP112、SNP126這 3個位點構(gòu)建的二倍型與性狀分析結(jié)果表明，K1型(CC AA TT)個體的存活天數(shù)最高，也就是抗病力最強(qiáng)，鑒于SNP88、SNP112、SNP126均來自高密度遺傳連鎖圖譜的LG19連鎖群，相關(guān)位點是否存在互作效應(yīng)有待下一步證實。

綜上所述，本研究是在前期高密度遺傳連鎖圖譜和QTL分析獲得的候選SNP位點的基礎(chǔ)上，在擴(kuò)大群體中對獲得的 SNP位點進(jìn)一步驗證，篩選出可用于遺傳育種的、與生長性狀和抗病力相關(guān)的 SNP位點，并確定其優(yōu)勢基因型，相關(guān)研究結(jié)果為實施刺參分子標(biāo)記輔助育種在育種生產(chǎn)中應(yīng)用有重要意義。