楊玲　安麗　付佩勝

摘要：采用半致死濃度法，對(duì)4種鯉（東平湖鯉、建鯉、俄羅斯鯉及德國(guó)鏡鯉）對(duì)柱狀黃桿菌引起的柱形?。礌€鰓?。┑目共×M(jìn)行了試驗(yàn)研究，分別采用1×104、2×104、4×104、8×104、1.6×105 cfu/mL濃度的柱狀黃桿菌G4菌株菌液浸泡攻毒1 h，參考Reed-Muench法計(jì)算半致死濃度（LC50）。結(jié)果表明，東平湖鯉LC50為104.7174 cfu/mL；建鯉LC50為104.6821 cfu/mL ；俄羅斯鯉LC50為104.6414 cfu/mL；鏡鯉LC50為104.5694 cfu /mL ，表明不同品種鯉魚(yú)對(duì)柱形病的抗病能力存在差異，四種鯉抗病力大小依次為東平湖鯉>建鯉>俄羅斯鯉>鏡鯉，其中東平湖鯉和建鯉無(wú)顯著差異，二者和鏡鯉的差異極顯著（P<0.01）。

關(guān)鍵詞：鯉魚(yú)；柱形?。€鰓病）；抗病力

東平湖鯉（Cyprinus carpio）屬鯉形目、鯉科，源自黃河，和黃河鯉魚(yú)同屬一個(gè)品種，是東平湖久負(fù)盛名的大型經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)，水汛時(shí)黃河鯉隨河水進(jìn)入湖內(nèi)，因湖內(nèi)水質(zhì)肥沃，適宜魚(yú)類(lèi)繁育和生長(zhǎng)而在湖內(nèi)定居。相對(duì)隔離的生存環(huán)境使得東平湖鯉與黃河鯉等其它水體的鯉魚(yú)基因交流較少，形成相對(duì)獨(dú)立的地理種群，該魚(yú)體型短寬，背蒼黑色，腹黃白色，尾鰭下葉呈紅色，譽(yù)謂“金翅金鱗”，其肉嫩鮮美，肥而不膩，營(yíng)養(yǎng)極為豐富，為魚(yú)中之上品。近年來(lái)由于市場(chǎng)需求量的急劇增加，過(guò)度捕撈使得東平湖鯉野生資源銳減，近年來(lái)湖區(qū)人工增殖放流和民間放生活動(dòng)的的開(kāi)展，導(dǎo)致東平湖鯉這一長(zhǎng)久以來(lái)形成的獨(dú)特地理群體遭受到不同程度的遺傳漸滲，造成基因污染，而一旦污染，這一種質(zhì)資源的原種便再難找到和恢復(fù)，因此有必要對(duì)東平湖鯉的種質(zhì)資源進(jìn)行發(fā)掘，以培育生長(zhǎng)速度快、抗病抗逆能力強(qiáng)等優(yōu)良性狀的經(jīng)濟(jì)品系。鯉的地方群體或品系較多，為了比較不同鯉魚(yú)對(duì)柱形病抗病能力的差異，本文以東平湖鯉、建鯉、俄羅斯鯉及鏡鯉等作為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)柱形病抗病力的差異測(cè)定和比較，以期為鯉魚(yú)抗病遺傳育種提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)魚(yú)及試驗(yàn)菌種

東平湖鯉取自東平湖，是用野生東平湖鯉繁育的F1代個(gè)體，建鯉購(gòu)自槐蔭區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)，俄羅斯鯉和鏡鯉取自省淡水漁業(yè)研究院，購(gòu)買(mǎi)后飼養(yǎng)1個(gè)月，以消除養(yǎng)殖環(huán)境因子的影響，暫養(yǎng)期間定期潑灑藥物以防發(fā)生魚(yú)病。試驗(yàn)魚(yú)體長(zhǎng)11.5～156 cm，體重22.9～38.5 g，試驗(yàn)菌種為柱狀黃桿菌 （F.columnare），由中科院水生生物研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 柱狀黃桿菌的培養(yǎng)和記數(shù) 采用含1μg/mL妥普霉素的Shieh培養(yǎng)基培養(yǎng)柱狀黃桿菌，先用固體培養(yǎng)基27 ℃培養(yǎng)，再挑取單克隆接種到4 mL液體培養(yǎng)基27 ℃振蕩培養(yǎng)，18 h 后取1 mL 接種到100 mL中再培養(yǎng)18 h，測(cè)其OD600值，并進(jìn)行菌落記數(shù)。分別稀釋101、102、103、104、106五個(gè)梯度，各濃度取0.2 mL涂布到固體培養(yǎng)基平板上，各濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)。27 ℃恒溫培養(yǎng)17 h 后菌落計(jì)數(shù)。

1.2.2 攻毒預(yù)試驗(yàn) 采用菌液浸泡法攻毒，試驗(yàn)在塑料周轉(zhuǎn)箱中進(jìn)行，每組試驗(yàn)魚(yú)20尾，分別用1×104 cfu/mL、1×105cfu/mL 、1×106 cfu/mL的菌液濃度浸泡1 h 后，轉(zhuǎn)移到盛有清水的塑料箱中觀察，箱內(nèi)保持充氣，試驗(yàn)水溫26 ℃。

1.2.3 半數(shù)致死濃度（LC50）的測(cè)定 每組試驗(yàn)用魚(yú)20尾，分別用濃度為1×104 cfu/mL、2×104 cfu/mL、4×104 cfu/mL、8×104 cfu/mL、1.6×105 cfu/mL的菌液浸泡攻毒，另外設(shè)置空白對(duì)照組。菌液浸泡1 h 后，轉(zhuǎn)移到清水中，每天記錄2次魚(yú)的死亡情況，連續(xù)記錄3 d。試驗(yàn)在塑料周轉(zhuǎn)箱中進(jìn)行，試驗(yàn)期間保持充氣，試驗(yàn)水溫26 ℃，半數(shù)致死濃度（LC50）計(jì)算方法參考Reed-Muench法[1]。

2 結(jié)果

2.1 柱狀黃桿菌的培養(yǎng)和菌落記數(shù)

取1 mL 培養(yǎng)液接種到100 mL液體培養(yǎng)基中27 ℃振蕩培養(yǎng)18 h后，測(cè)得其OD600值后結(jié)合菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算出菌液濃度為2×108cfu/mL。

2.2 預(yù)攻毒試驗(yàn)

攻毒處理24 h后觀察發(fā)現(xiàn)用1×104 cfu/mL濃度浸泡處理的鯉魚(yú)全部存活，而用1×105cfu/mL和 1×106 cfu/mL濃度處理的魚(yú)則全部死亡。

2.3 半數(shù)致死濃度（LC50）的測(cè)定結(jié)果

四種鯉魚(yú)感染柱狀黃桿菌3 d內(nèi)的死亡情況見(jiàn)表1，計(jì)算得出各自的半數(shù)致死濃度（LC50）見(jiàn)表2。試驗(yàn)結(jié)果的方差分析表明，四種鯉魚(yú)中東平湖鯉與建鯉無(wú)顯著差異，二者與鏡鯉的差異極顯著（P<001），俄羅斯鯉與鏡鯉也有顯著差異（P<0.05）。

3 討論

東平湖鯉選育的主要目標(biāo)是提高生長(zhǎng)速度和增強(qiáng)抗逆抗病能力，本研究選用4種不同品種鯉魚(yú)來(lái)探討其對(duì)柱形病的抗病力差異，其中東平湖鯉是捕自東平湖的野生親本經(jīng)人工繁育的子一代；建鯉為濟(jì)南本地養(yǎng)殖群體，經(jīng)過(guò)連續(xù)多代人工繁育的后代；俄羅斯鯉和鏡鯉取自山東省淡水漁業(yè)研究院，引自天津市水產(chǎn)研究所。

柱狀黃桿菌是世界范圍的水生動(dòng)物致病菌，其宿主范圍極廣泛，可感染鮭科、鯉科、鯰科、鱸科等多個(gè)科的魚(yú)類(lèi)，幾乎所有的淡水魚(yú)均對(duì)該菌敏感，是我國(guó)重要養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)草魚(yú)、鯉魚(yú)等爛鰓病的病原菌[2]，它是條件致病菌，組織損傷、高溫、低氧、操作不當(dāng)及繼發(fā)感染等都有可能發(fā)病，主要危害魚(yú)鰓，也可引起體表潰瘍。通過(guò)本試驗(yàn)研究，計(jì)算出各自的半致死濃度（LC50），結(jié)果顯示柱狀黃桿菌對(duì)四種鯉半致死濃度順序?yàn)闁|平湖鯉>建鯉>俄羅斯鯉>鏡鯉，方差分析表明，東平湖鯉和建鯉差異不顯著，兩者與鏡鯉有極顯著差異（P<0.01）。

本研究結(jié)果為野生東平湖鯉子一代的抗柱形病能力最強(qiáng)，鏡鯉的抗病力最弱，和蔡完其等[3]研究鯉魚(yú)對(duì)嗜水氣單胞菌的LC50的結(jié)果建鯉>野鯉>鏡鯉及盧彤巖等[4]對(duì)高寒鯉和散鱗鏡鯉的比較結(jié)果相似。分析可能有以下幾個(gè)方面原因：一是東平湖鯉為野生親本的子一代，其親本是自東平湖采集的7齡以上的天然野生群體，經(jīng)過(guò)多年優(yōu)勝劣汰的自然選擇，天然群體中體質(zhì)弱的苗種已經(jīng)遭淘汰，能夠成活下來(lái)的都是體質(zhì)比較壯的個(gè)體；二是野生群體的親本數(shù)量多，具有較高的遺傳變異度和遺傳多樣性水平，避免了因近親繁殖造成的種質(zhì)退化；德國(guó)鏡鯉1984年從德國(guó)引進(jìn)我國(guó)，具有生長(zhǎng)快、耐低溫等特點(diǎn)，但是其抗病力差[5]，是因?yàn)轶w表鱗片少，缺乏第一層防御系統(tǒng)的保護(hù)的原因造成的；建鯉是1996年雜交育成的優(yōu)良品種，具有生長(zhǎng)快、適應(yīng)性和抗病力強(qiáng)等特點(diǎn)[6]，本實(shí)驗(yàn)所用的建鯉是附近養(yǎng)殖者多年人工養(yǎng)殖的，親本數(shù)量相對(duì)較少外，又經(jīng)過(guò)連續(xù)多代人工繁育，存在一定程度的近交衰退，加之是在人工環(huán)境下養(yǎng)殖，飼料營(yíng)養(yǎng)因素、養(yǎng)殖水環(huán)境因素、人為管理等因素的不當(dāng)，也會(huì)導(dǎo)致群體整體抗病能力的減弱；俄羅斯鯉又名烏克蘭鱗鯉，是大馬哈魚(yú)與鯉魚(yú)的雜交品種，具有耐低溫、生長(zhǎng)快、性成熟晚等特點(diǎn)[7]，1998年引進(jìn)我國(guó)，但是引進(jìn)的基礎(chǔ)群體較少，經(jīng)過(guò)多代的人工繁育，存在近交衰退的問(wèn)題，從而使其抗病能力減弱。

通過(guò)引進(jìn)野生種質(zhì)，更新親本，提高養(yǎng)殖苗種的遺傳多樣性水平，可能在抗病性狀方面獲得一定的改善，然而近交不一定就帶來(lái)衰退，遺傳多樣性高也未必能大幅提高抗病和生長(zhǎng)效果，有目的的近交可以在很短的時(shí)間內(nèi)將某一目標(biāo)性狀進(jìn)行純化和固定，應(yīng)充分利用好現(xiàn)有的種質(zhì)資源，在保護(hù)好野生種質(zhì)資源的基礎(chǔ)上，針對(duì)抗病力、生長(zhǎng)速度等指標(biāo)進(jìn)行品系和品種的培育才是遺傳育種工作的關(guān)鍵[8]。

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（收稿日期：2015-06-25）