徐 騰，李 迪，李 林，王天星，劉欣然，李 勇

(北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系，北京 100191)

機(jī)體的營養(yǎng)狀況是影響傷口愈合的重要因素之一[1-4]。外科手術(shù)后病人很容易陷入營養(yǎng)不良狀態(tài)，導(dǎo)致傷口愈合延遲[5]。因此，通過提供合理的臨床營養(yǎng)支持，達(dá)到預(yù)防和減輕營養(yǎng)不良、增強(qiáng)機(jī)體免疫力，進(jìn)而促進(jìn)術(shù)后傷口愈合至關(guān)重要。

牛骨膠原低聚肽(BCOPs，以下簡稱牛骨肽)提取自牛骨，是一種動(dòng)物性生物活性肽。研究發(fā)現(xiàn)，低聚肽比單個(gè)氨基酸的吸收更有效，且能直接參與蛋白質(zhì)的合成，提高機(jī)體對蛋白質(zhì)的利用率[6]，具有促消化吸收、降膽固醇、增強(qiáng)免疫、降血壓、降血糖、抗肥胖、抗氧化、緩解疲勞等生理功能[7-8]。本研究采用牛骨肽作為干預(yù)物，通過建立模擬臨床的皮膚切口手術(shù)模型，探討B(tài)COPs作為營養(yǎng)制劑在傷口愈合中發(fā)揮的作用，為尋找促進(jìn)傷口愈合功能性保健食品及藥品的開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品

BCOPs，淡白色固體粉末，由北京天肽生物科技有限公司提供。經(jīng)凱氏定氮儀測定器肽含量為92.77g/100g，酸溶蛋白含量為95.5g/100g。進(jìn)一步經(jīng)高效液相色譜儀分析其中游離氨基酸組成，可知氨基酸總量占2.73%，其中精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、賴氨酸較多。

1.2 主要試劑及儀器

4%水合氯醛、6mm打孔器、Adventurer TM 通用型分析天平，美國奧豪斯國際貿(mào)易有限公司；Eppendorf 高速冷凍離心機(jī)，德國艾本德股份公司；電熱恒溫水浴鍋，北京天林恒泰科技有限公司；正置熒光顯微鏡，NIKON E400。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性ICR小鼠180只，體重18～22g，購于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。自由飲食、飲水。飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室符合國標(biāo)清潔級，溫度范圍25±1℃，相對濕度50%～60%，室內(nèi)照明控制在12h/12h光暗周期節(jié)律。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組與處理

1.4.1實(shí)驗(yàn)分組 經(jīng)適應(yīng)期喂養(yǎng)后，將180只小鼠隨機(jī)分為6組，設(shè)1個(gè)空白對照組和5個(gè)BCOPs劑量組(0.375、0.75、1.5、3.0、6.0g/kg·BW)，分別對應(yīng)BCOPs(0.375)、BCOPs(0.75)、BCOPs(1.5)、BCOPs(3.0)、BCOPs(6.0)，每組小鼠隨機(jī)分為3個(gè)亞組，每個(gè)亞組10只。

1.4.2皮膚切口手術(shù)模型建立 小鼠經(jīng)4%水合氯醛腹腔注射麻醉后，采用剃毛刀將背部毛發(fā)去除，使用碘伏與酒精消毒后，在距背部中線1cm的兩側(cè)分別切一個(gè) 1.5cm長的縱行切口，同時(shí)切開肌肉，深達(dá)腹腔，然后逐層縫合肌肉和皮膚，術(shù)后涂 2%碘酊，注射青霉素 G(1 000IU/g·BW)以防止感染，術(shù)后禁食6h，正常飲水。

1.4.3牛骨膠原低聚肽干預(yù) 將手術(shù)當(dāng)天記為術(shù)后第0天(POD0)，術(shù)后6h進(jìn)行受試物干預(yù)，每日經(jīng)口灌胃給予受試樣品?？瞻讓φ战M給予蒸餾水，BCOPs劑量組給予相應(yīng)濃度受試物，灌胃量為1mL/100g，受試樣品給予時(shí)間為11d。實(shí)驗(yàn)期間觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一般情況，包括毛色、精神狀態(tài)、日?；顒?dòng)情況等。

1.5 皮膚切口抗張力強(qiáng)度檢測

術(shù)后第7、11天，沿切口垂直方向切取以切口為中線，寬為0.5cm、長為中線雙側(cè)各0.5cm并包含切口在內(nèi)的皮膚組織，去除皮下脂肪組織，于長方形短邊以絲線縫合作為牽引線，將皮條放置在帶有張力感受器的裝置中間，張力感受器另一端鏈接于多功能生物信號采集系統(tǒng)，采用帶有游標(biāo)卡尺的微調(diào)裝置手動(dòng)逐漸拉伸皮條，記錄皮條被拉斷時(shí)的張力。測微尺測量皮膚的厚度，每平方毫米面積的張力即為切口的抗張力強(qiáng)度。

1.6 血清指標(biāo)檢測

在術(shù)后第3、7、11天經(jīng)內(nèi)眥采血分批處死小鼠，留取血清。采用ELISA法測定血清PA、IL-10、TNF-α含量。

1.7 病理觀察

各組小鼠分別于術(shù)后3、7、11天于傷口處距切口邊緣0.3cm處取全層皮膚組織，用4%甲醛進(jìn)行固定，保存后待做石蠟切片及HE染色。

1.8 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，差異顯著者進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊者以LSD法對多組均數(shù)進(jìn)行post-hoc分析，方差不齊者以Dunnett’s T3法對多組均數(shù)進(jìn)行post-hoc分析。以P<0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠一般狀況

實(shí)驗(yàn)期間各組小鼠無死亡，飲食、飲水正常，生長、活動(dòng)未見異常，毛色、精神狀況未見異常；實(shí)驗(yàn)期間小鼠體重在術(shù)后下降，隨后正常增長，與對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

2.2 牛骨肽對皮膚切口抗張力強(qiáng)度的影響

在POD7，BCOPs(0.375、0.75、1.5)劑量組抗張力強(qiáng)度高于對照組，但是結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；POD11，牛骨肽各劑量組小鼠抗張力強(qiáng)度均高于對照組，其中BCOPs(1.5)劑量組與對照組相比，抗張力強(qiáng)度結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(表1)。

2.3 牛骨肽對小鼠血清PA、IL-10、TNF-α含量的影響

POD3，除了BCOPs(6.0)劑量組小鼠血清PA濃度明顯低于對照組外(P<0.05)，其余各劑量組小鼠血清PA濃度均明顯高于對照組(P<0.05)；POD7，BCOPs(0.375、1.5、6.0)劑量組小鼠血清PA濃度明顯低于對照組(P<0.05)；POD11，BCOPs(3.0)劑量組小鼠血清PA濃度明顯高于對照組；其余各劑量組則明顯低于對照組(P<0.05)(表2)。

組別抗張力強(qiáng)度(g/mm2)POD7POD11空白對照組22.51±1.7334.05±4.77BCOPs(0.375)27.58±3.9836.98±4.21BCOPs(0.75)25.69±6.5337.99±4.39BCOPs(1.5)23.46±3.5940.16±6.07aBCOPs(3.0)22.82±1.2937.58±3.02BCOPs(6.0)25.56±4.2436.20±2.40

注：a與對照組相比結(jié)果有明顯差異，P<0.05

組別血清PA濃度(μg/mL)POD3POD7POD11空白對照組31.62±2.7540.71±4.2139.98±3.32BCOPs(0.375)45.93±2.08a25.97±3.16a25.36±3.54aBCOPs(0.75)47.29±3.34a41.01±3.2620.61±3.87aBCOPs(1.5)39.71±3.17a35.17±4.04a28.67±4.09aBCOPs(3.0)36.68±3.13a42.13±4.2947.84±3.89aBCOPs(6.0)23.86±3.75a28.83±3.76a26.96±3.81a

注：a與對照組相比結(jié)果有明顯差異，P<0.05

POD3，BCOPs(0.375、0.75)劑量組小鼠血清IL-10濃度明顯大于對照組(P<0.05)；POD7，BCOPs(0.375、0.75、1.5)劑量組小鼠血清IL-10濃度明顯大于對照組(P<0.05)；POD11，BCOPs(0.75、1.5、3.0、6.0)劑量組小鼠血清濃度明顯大于對照組(P<0.05)(表3)。

組別血清IL-10濃度(pg/mL)POD3POD7POD11空白對照組508.07±70.39533.71±86.23499.31±75.09BCOPs(0.375)901.18±101.05a633.29±82.11a498.37±66.53BCOPs(0.75)825.55±114.94a710.37±56.71a569.32±73.90aBCOPs(1.5)899.85±94.80632.43±85.35a743.78±73.26aBCOPs(3.0)625.79±62.26454.28±77.67700.89±94.40aBCOPs(6.0)512.92±49.37595.06±74.14590.23±47.65a

注：a與對照組相比結(jié)果有明顯差異，P<0.05

POD3，BCOPs(6.0)劑量組小鼠血清TNF-α濃度明顯低于對照組(P<0.05)；POD7，BCOPs(0.375、0.75、1.5、6.0)劑量組小鼠血清TNF-α濃度均明顯低于對照組(P<0.05)；POD11，BCOPs(0.375、0.75、3.0、6.0)劑量組小鼠血清TNF-α濃度均明顯低于對照組(P<0.05)(表4)。

組別血清TNF-α濃度(ng/L)POD3POD7POD11空白對照組498.29±46.91625.99±69.02611.05±65.08BCOPs(0.375)400.54±97.34515.31±84.31a501.99±56.12aBCOPs(0.75)503.99±41.71456.88±59.89a365.92±58.41aBCOPs(1.5)461.23±79.06518.22±64.51a570.31±52.09BCOPs(3.0)590.36±71.59594.22±97.76318.58±64.29aBCOPs(6.0)345.54±23.87a377.74±53.47a535.95±54.18a

注：a與對照組相比結(jié)果有明顯差異，P<0.05

2.4 組織病理學(xué)觀察

圖1～3分別為皮膚切口手術(shù)模型小鼠在術(shù)后3、7、11d時(shí)的HE染色結(jié)果。POD3，鏡下可見對照組表皮連接，真皮層斷裂，依稀可見炎性細(xì)胞；各劑量組表皮連接，且表皮層厚度較對照組高，傷口處可見炎性細(xì)胞浸潤，BCOPs(0.375、1.5、3.0)劑量組可見真皮層連接。POD7，對照組表皮層增厚，真皮層斷裂，而各劑量組真皮層均已連接，BCOPs(0.375、0.75)劑量組可見炎性細(xì)胞浸潤，BCOPs(1.5、3.0、6.0)劑量組可見纖維母細(xì)胞分化增生，膠原排列不整齊；BCOPs(3.0、6.0)鏡下可見血管增生；POD11，對照組表皮層與真皮層均已連接，鏡下可見纖維母細(xì)胞和毛細(xì)血管，BCOPs(0.375、0.75)劑量組可見毛囊等附屬器官，膠原、排列趨于整齊，BCOPs(1.5、3.0、6.0)劑量組愈合良好，傷口處與正常組織相差不大。

3 討論

正常的傷口愈合包括3個(gè)時(shí)期，即炎癥期、增生期和修復(fù)期[9-11]。本實(shí)驗(yàn)以蒸餾水組作為空白對照，采用皮膚切口手術(shù)模型，模擬臨床Ⅰ期愈合方式，觀察牛骨肽對小鼠術(shù)后傷口愈合的促進(jìn)作用?？箯埩?qiáng)度可以反映新生成的皮下膠原纖維在分子層面上的連接能力，是衡量傷口愈合狀況的一個(gè)重要指標(biāo)[12]。本實(shí)驗(yàn)選擇在傷口愈合的第7天和第11天測量小鼠術(shù)后傷口愈合的抗張力強(qiáng)度，是因?yàn)榇藭r(shí)基本處于傷口愈合的增生期和瘢痕期，在此時(shí)期，包括纖維母細(xì)胞分化、血管生成、膠原纖維形成等一系列變化，傷口具有一定的張力。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，術(shù)后第7天，各劑量組抗張力強(qiáng)度與對照組之間無明顯差異，但是其均值均大于對照組；術(shù)后第11天，BCOPs(1.5)劑量組小鼠皮膚抗張力強(qiáng)度明顯大于對照組，提示了皮膚愈合良好，此劑量組對于傷口愈合具有明顯的促進(jìn)作用。其他劑量組與對照組相比雖然無明顯差異，但是均值均大于對照組，顯現(xiàn)出傷口愈合良好的趨勢。

術(shù)后對于機(jī)體進(jìn)行必要的營養(yǎng)支持，有利于機(jī)體的快速恢復(fù)[13]。血清PA具有半衰期短、代謝迅速、特異性和敏感性強(qiáng)的特點(diǎn)，其血清中的濃度與營養(yǎng)狀況的早期變化密切相關(guān)，可反映人體臟器蛋白質(zhì)含量狀況，是評價(jià)和監(jiān)測患者營養(yǎng)狀態(tài)的金標(biāo)準(zhǔn)[14-15]。術(shù)后第3天，BCOPs(0.375)、BCOPs(0.75)、BCOPs(1.5)、BCOPs(3.0)劑量組小鼠血清PA濃度明顯高于對照組，提示此時(shí)機(jī)體營養(yǎng)狀況良好，此劑量牛骨肽可通過促進(jìn)PA的表達(dá)使小鼠保持良好的營養(yǎng)狀態(tài)；同時(shí)多個(gè)劑量組血清ALB濃度明顯高于對照組，進(jìn)一步證明牛骨肽對于術(shù)后小鼠的蛋白營養(yǎng)作用。由于PA屬于急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，半衰期較短，因此，隨著術(shù)后時(shí)間的推進(jìn)其濃度降低。而其在術(shù)后第7天和第11天濃度明顯低于對照組的情況，推測可能的原因是由于傷口愈合進(jìn)程加快，導(dǎo)致組織修復(fù)消耗了大量的能量。

圖1 皮膚切口手術(shù)模型小鼠皮膚組織POD3組織形態(tài)(HE染色，200×)

圖2 皮膚切口手術(shù)模型小鼠皮膚組織POD7組織形態(tài)(HE染色，200×)

圖3 皮膚切口手術(shù)模型小鼠皮膚組織POD11組織形態(tài)(HE染色，200×)

白介素10(IL-10)是一種抗炎性細(xì)胞因子。 IL-10可以不依賴于其對抗原呈遞細(xì)胞的抑制而直接作用于T細(xì)胞。在中性粒細(xì)胞中，IL-10能抑制炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，從而抑制由脂多糖和吞噬細(xì)菌引起的腫瘤壞死因子 TNF-α及 IL-1β的產(chǎn)生[16]。此外，IL-10能抑制各種趨化中性粒細(xì)胞化學(xué)因子釋放，也能夠抑制環(huán)氧合酶-2和前列腺素E2的合成。在嗜酸性粒細(xì)胞中，IL-10能抑制脂多糖引起的各種炎性介質(zhì)(如 TNF-α等)的產(chǎn)生，進(jìn)而避免了炎癥反應(yīng)的發(fā)生[17]。本實(shí)驗(yàn)中，除了術(shù)后第7天時(shí)BCOPs(3.0)劑量組IL-10濃度小于空白對照組外，其余時(shí)期牛骨肽劑量組IL-10濃度均大于對照組，提示牛骨肽通過促進(jìn)IL-10的表達(dá)抑制炎癥反應(yīng)。

腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)在創(chuàng)傷愈合中的主要作用是炎性細(xì)胞滲透[18]，并且TNF-α具有雙重生物學(xué)效應(yīng)，濃度較低時(shí)主要作為白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的自分泌及旁分泌的調(diào)節(jié)物質(zhì)，可以抵抗細(xì)菌、病毒和寄生蟲的感染，促進(jìn)組織修復(fù)，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，引起腫瘤細(xì)胞凋亡等；高濃度時(shí)，過量的TNF-α則會(huì)破壞機(jī)體的免疫平衡，與其他炎癥因子一起產(chǎn)生多種病理損傷[19-20]。POD3，BCOPs(6.0)劑量組小鼠血清TNF-α濃度明顯低于對照組(P<0.05)；POD7，BCOPs(0.375、0.75、1.5、6.0)劑量組小鼠血清TNF-α濃度均明顯低于對照組(P<0.05)；POD11，BCOPs(0.375、0.75、3.0、6.0)劑量組小鼠血清TNF-α濃度均明顯低于對照組(P<0.05)，提示牛骨肽可通過下調(diào)TNF-α的表達(dá)促進(jìn)組織修復(fù)，其具體的通路可能與IL-10的表達(dá)增加有關(guān)。

除以上證據(jù)外，病理觀察結(jié)果也同樣提示牛骨肽劑量組傷口愈合情況優(yōu)于空白對照組。因此，筆者認(rèn)為牛骨肽可在術(shù)后早期提供充分的營養(yǎng)支持，并且其可抑制IL-10和TNF-α的表達(dá)以促進(jìn)傷口愈合。

4 結(jié)論

本研究通過建立小鼠傷口模型，探討B(tài)COPs對于傷口愈合是否具有促進(jìn)作用。結(jié)果表明，牛骨肽可以有效促進(jìn)小鼠傷口愈合，這一方面是因?yàn)榕９请目赏ㄟ^術(shù)后早期營養(yǎng)支持使機(jī)體具有充足的組織修復(fù)的能量，另一方面與牛骨肽抑制炎癥因子的表達(dá)有關(guān)。由于傷口愈合是一個(gè)復(fù)雜的過程，BCOPs對于促進(jìn)傷口愈合的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究?！?/p>