烏 蘭，劉 睿，杜 倩，陳啟賀，任金威，樊 蕊，李 勇

(北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生系，北京 100191)

疲勞是機(jī)體一種復(fù)雜生理生化的變化過程，對(duì)人們的健康狀態(tài)、生存質(zhì)量和工作效率會(huì)產(chǎn)生許多不良影響，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí){人們的身心健康。隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快，社會(huì)競(jìng)爭(zhēng)的加劇，由于工作、學(xué)習(xí)的壓力，使得疲勞成為困擾許多人的健康問題。由于疲勞的持續(xù)或反復(fù)發(fā)作，嚴(yán)重影響著人們正常的個(gè)人活動(dòng)和社會(huì)行為，甚至長(zhǎng)期累積疲勞引起“過勞死”，即由于過度疲勞而導(dǎo)致死亡的案例也屢見不鮮[1-2]。不論在我國(guó)還是世界其他國(guó)家，疲勞現(xiàn)象早已引起了人們的關(guān)注。因此，探討具有緩解疲勞、抗疲勞作用的保健食品具有極其重要的現(xiàn)實(shí)意義。

核桃是我國(guó)由來已久的藥食兩用食品。我國(guó)食用核桃的歷史悠久，且是核桃的發(fā)源地，從秦漢時(shí)期起一直被我國(guó)人民作為藥食兩用食品，明代的《本草綱目》記載：“核桃味甘性平微苦微澀，有補(bǔ)腎固精、健脾補(bǔ)血、通便潤(rùn)腸、寧心安神等功效”[3]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，核桃中不僅含有豐富的蛋白質(zhì)、糖類、脂肪類成分，更含有人體需要的不飽和脂肪酸、維生素E、黃酮、葉酸、多酚類等多種生理活性成分。其中，核桃蛋白是一種具有經(jīng)濟(jì)、食用及藥用價(jià)值的優(yōu)質(zhì)植物蛋白，富含豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，核桃中蛋白質(zhì)含量約為15%，核桃蛋白中含有18種氨基酸，8種必需氨基酸種類齊全，其組成比與人體必需氨基酸含量近似，氨基酸組成中精氨酸、谷氨酸、組氨酸、酪氨酸等含量相對(duì)較高[4]。研究發(fā)現(xiàn)，核桃蛋白具有抗氧化、抑菌、抗病毒、降血壓、抗腫瘤等功效[5]。核桃中含有多種生物活性肽，作為一種天然活性肽，其安全性高，具有極好的應(yīng)用前景。段心妍[6]實(shí)驗(yàn)證明，核桃肽可以有效促進(jìn)雄性SD大鼠體力疲勞的恢復(fù)。賈靖霖等[7]研究了核桃多肽對(duì)小鼠負(fù)重實(shí)驗(yàn)的影響，結(jié)果表明，小鼠負(fù)重游泳力竭時(shí)間和血清尿素氮的含量差異均極顯著，表明核桃多肽具有抗疲勞作用。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，食物中的蛋白質(zhì)必須在消化道中被分解成游離氨基酸才能夠被機(jī)體吸收利用，發(fā)揮其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。近些年研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物消化道中蛋白質(zhì)水解終產(chǎn)物大多是由10個(gè)或10個(gè)以下氨基酸殘基組成的小分子低聚肽，不需消化分解成游離氨基酸便可直接以低聚肽的形式被機(jī)體吸收利用，比單個(gè)氨基酸的吸收更為有效，對(duì)提高蛋白質(zhì)的利用率有重要作用[8]。伴隨著生物化學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，有關(guān)低聚肽的研究正逐漸引起人們的重視。但有關(guān)核桃低聚肽的抗疲勞作用尚無文獻(xiàn)報(bào)道，故本實(shí)驗(yàn)通過應(yīng)用不同劑量的核桃低聚肽溶液對(duì)小鼠進(jìn)行的飲水干預(yù)，探討核桃肽對(duì)小鼠抗疲勞的作用。乳清蛋白是牛乳中酪蛋白沉淀分離時(shí)保留在上清液中的多種蛋白質(zhì)組分的統(tǒng)稱，包含多種蛋白及大量生物活性物質(zhì)，具有增強(qiáng)體質(zhì)、提高免疫力、抗疲勞等多種功效[9]。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置乳清蛋白對(duì)照組是為避免單純蛋白質(zhì)攝入量的提高對(duì)結(jié)果的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

核桃肽，淡黃色固體粉末，主要成分為分子量小于1 000的低聚肽，谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、亮氨酸含量較多，購(gòu)自北京天肽生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)ICR雄性小鼠240只，18～22g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物室，溫度范圍為22±2℃，相對(duì)濕度為50%～60%，晝：夜明暗交替時(shí)間為12h：12h。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由進(jìn)食。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1分組及處理 動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1w后，按體重隨機(jī)分為5個(gè)組：1個(gè)空白對(duì)照組、1個(gè)乳清蛋白組[220mg/(kg·BW)]和3個(gè)核桃肽干預(yù)組[110、220、440mg/(kg·BW)]。每日經(jīng)飲水給予受試樣品，空白對(duì)照組給予高壓消毒蒸餾水，乳清蛋白組和核桃肽干預(yù)組給予相應(yīng)濃度受試物，核桃肽和乳清蛋白溶液均用蒸餾水配制。動(dòng)物每周稱重2次，按體重調(diào)整受試樣品劑量。受試樣品給予時(shí)間30d。實(shí)驗(yàn)過程中每周觀察各組小鼠的一般情況，包括毛色、精神狀態(tài)、攝食及日常活動(dòng)情況等。

30d干預(yù)結(jié)束后，每組隨機(jī)分為A、B、C、D 4個(gè)亞組，A亞組進(jìn)行各組小鼠血乳酸水平的檢測(cè)；B亞組檢測(cè)各組小鼠血清尿素氮含量、乳酸脫氫酶活力及血糖水平；C亞組為負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)，記錄小鼠負(fù)重游泳力竭時(shí)間；D亞組檢測(cè)小鼠肝糖原和肌糖原含量。

1.3.2血乳酸測(cè)定 小鼠尾尖采血20μL，隨后不負(fù)重在30℃的水中游泳10min。再于游泳后0和20min分別采血20μL。將3次采得的血樣分別加入0.48mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的NaF溶液中充分混勻至透明，加入1.5mL蛋白沉淀劑，震蕩混勻，3 000r/min離心10min，取上清液測(cè)定血乳酸含量。

采用自配試劑測(cè)定血乳酸含量，主要原理為在銅離子催化下，乳酸與濃硫酸在沸水中反應(yīng)，乳酸轉(zhuǎn)化為乙醛，乙醛與對(duì)羥基聯(lián)苯反應(yīng)產(chǎn)生紫色化合物，在波長(zhǎng)560nm處有強(qiáng)烈的光吸收，故可進(jìn)行定量測(cè)定。

1.3.3血清尿素氮和乳酸脫氫酶、血糖水平的測(cè)定 在30℃的水中不負(fù)重游泳90min，休息60min后眼球采血。置4℃冰箱約3 h，血凝固后2 000r/min離心15min，取血清備用。根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行尿素氮、乳酸脫氫酶和血糖水平的測(cè)定。

1.3.4負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn) 置小鼠在游泳箱(大小約50cm*50cm*40cm)中游泳。水深不少于30cm，水溫25±1.0℃，鼠尾根部負(fù)荷5%體重的鉛皮。記錄小鼠自游泳開始至死亡的時(shí)間，即小鼠負(fù)重游泳時(shí)間。

1.3.5肝糖原和肌糖原測(cè)定 處死D組動(dòng)物，取新鮮肝臟和肌肉組織樣本用生理鹽水漂洗后，濾紙吸干，精確稱重，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃肽對(duì)小鼠體重的影響

各組小鼠開始體重和結(jié)束末次體重相比較無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

組別只數(shù)初次體重(g)末次體重(g)空白對(duì)照組4825.73±1.4639.08±2.47乳清蛋白組4825.40±1.9439.21±3.03低劑量組4825.18±1.6139.37±2.38中劑量組4825.18±1.5639.07±2.96高劑量組4824.95±1.4939.89±3.68

2.2 核桃肽對(duì)小鼠血乳酸含量的影響

取A亞組12只小鼠，測(cè)定小鼠血乳酸水平。如表2所示，游泳前，核桃肽低、中、高劑量組小鼠血乳酸含量均大于空白對(duì)照組(P<0.01)；游泳后20min，核桃肽低、中、高劑量組小鼠血乳酸含量均顯著小于空白對(duì)照組(P<0.01、P<0.01、P<0.01)，且核桃肽中、高劑量組小鼠游泳后20min血乳酸含量均顯著小于乳清蛋白對(duì)照組(P<0.01、P<0.01)；核桃肽高劑量組血乳酸曲線下面積小于空白對(duì)照組(P<0.05)。

組別游泳前血乳酸值游泳后0min血乳酸值游泳后20min血乳酸值血乳酸曲線下面積值空白對(duì)照組4 240.48±1 295.497 302.38±1 383.257 700.00±1 102.50207 738.10±25 954.21乳清蛋白組5 664.94±1 523.437 283.12±1 128.885 709.09±1 287.67194 662.34±27 169.33低劑量組6 378.57±980.037 633.33±768.575 273.81±567.71a199 130.95±9 942.78中劑量組6 735.71±2 072.468 835.71±1 128.235 019.05±570.30ab216 404.76±24 982.36高劑量組6 895.24±1 895.076 930.95±1 694.364 759.52±663.10ab186 035.71±24 646.60c

注：a與空白對(duì)照組比較差異具有顯著性(P<0.01)；b與乳清蛋白對(duì)照組比較差異具有顯著性(P<0.01)；c與空白對(duì)照組比較差異具有顯著性(P<0.05)

2.3 核桃肽對(duì)小鼠血清尿素氮、乳酸脫氫酶活性和血糖的影響

核桃肽中、高劑量組小鼠血清尿素氮均低于空白對(duì)照組(P<0.01、P<0.05)；核桃肽低劑量組小鼠乳酸脫氫酶活性高于乳清蛋白對(duì)照組(P<0.05)；核桃肽低、中、高劑量組小鼠血糖水平明顯高于乳清蛋白對(duì)照組(P<0.01、P<0.01、P<0.01)(表3)。

組別尿素氮(mmol/L)乳酸脫氫酶(U/L)血糖(mmol/L)空白對(duì)照組21.13±12.381 971.29±578.626.15±2.82乳清蛋白組14.17±5.051307.71±333.038.43±1.71低劑量組16.57±11.161 834.26±810.03c5.82±1.61d中劑量組11.99±1.63b1 348.14±399.125.33±2.22d高劑量組12.56±1.28a1 277.23±347.055.19±1.90d

注：a與空白對(duì)照組比較差異有顯著性(P<0.05)；b與空白對(duì)照組比較差異有顯著性(P<0.01)；c與乳清蛋白對(duì)照組比較差異有顯著性(P<0.05)；d與乳清蛋白對(duì)照組比較差異有顯著性(P<0.01)

2.4 核桃肽對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響

空白對(duì)照組與乳清蛋白對(duì)照組小鼠平均負(fù)重游泳時(shí)間相比較無顯著差異(P>0.05)；核桃肽低、高劑量組游泳時(shí)間比空白對(duì)照組有顯著延長(zhǎng)，分別是空白對(duì)照組的2、1.7倍(P<0.01、P<0.05)(附圖)。

附圖 核桃肽對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響注：a與空白對(duì)照組比較差異具有顯著性(P<0.01)；b與空白對(duì)照組比較差異具有顯著性(P<0.05)

2.5 核桃肽對(duì)小鼠肝糖原、肌糖原含量的影響

如表5所示，核中劑量組小鼠肌糖原含量高于空白對(duì)照組小鼠(P<0.05)，其他無顯著性差異。

組別肝糖原含量(mg/g)肌糖原含量(mg/g)空白對(duì)照組4.72±2.742.24±0.50乳清蛋白組7.66±2.372.63±0.35低劑量組6.25±1.642.40±0.44中劑量組5.25±1.283.06±1.22a高劑量組5.55±2.042.26±0.58

注：a與空白對(duì)照組比較差異具有顯著性(P<0.05)

3 討論

軀體性疲勞是由運(yùn)動(dòng)引起機(jī)體一系列生化改變而導(dǎo)致的肌肉力量下降?？蛊?，即延緩疲勞的產(chǎn)生或加速疲勞的消除。疲勞的發(fā)生及其發(fā)展變化過程伴隨著一系列生化指標(biāo)的改變[10]。故本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)血乳酸、乳酸脫氫酶活性、血清尿素氮和肝、肌糖原等生化指標(biāo)以及負(fù)重游泳的時(shí)間，來探討核桃肽對(duì)小鼠的緩解疲勞作用及其可能的機(jī)制。

乳酸是劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)碳水化合物在無氧條件下的糖酵解產(chǎn)物，在正常情況下血中乳酸濃度可維持在一定水平。隨著高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)的增加，更高水平的乳酸可引起H+濃度的增加，并改變內(nèi)部pH。pH下降會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)相關(guān)酶的活性，同時(shí)還會(huì)抑制肌質(zhì)網(wǎng)對(duì)鈣離子的釋放和攝取，產(chǎn)生疲勞[11]。乳酸的消除途徑基本包括三種[12]，即在乳酸脫氫酶作用下，乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸隨后氧化分解成二氧化碳和水；在肝和骨骼肌內(nèi)重新合成葡萄糖和糖原；在肝內(nèi)合成脂肪酸等其他物質(zhì)。在本研究中，服用核桃肽低劑量組的小鼠乳酸脫氫酶活性高于乳清蛋白對(duì)照組，但該組小鼠血乳酸含量并未明顯下降，可能是核桃肽并未全部通過乳酸脫氫酶途徑消除掉體內(nèi)產(chǎn)生的乳酸。但核桃肽高劑量組血乳酸含量有所下降，可提示核桃肽有減緩疲勞的作用。

血清尿素氮是腎功能能量代謝的產(chǎn)物，較長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)動(dòng)后，當(dāng)糖、脂肪代謝不能供給機(jī)體足夠的能量時(shí)，蛋白質(zhì)和氨基酸分解代謝加強(qiáng)，導(dǎo)致機(jī)體中血尿素氮含量增加。體內(nèi)尿素氮和身體耐力之間呈正相關(guān)。即表示身體承受運(yùn)動(dòng)耐力越差，尿素氮水平增加越多，故血清尿素氮是評(píng)估疲勞水平的敏感指標(biāo)[13]。本研究中核桃肽中、高劑量組小鼠血清尿素氮水平均低于空白對(duì)照組，表明核桃肽可減少血清中尿素氮的堆積，可提示核桃肽有提高身體承受運(yùn)動(dòng)耐力的能力，能有效緩解疲勞。

糖是人體最重要的能源物質(zhì)，主要包括肌糖原、肝糖原和血糖。其中，肌糖原是維持肌肉運(yùn)動(dòng)的重要能源，肝糖原分解是血糖維持穩(wěn)定的重要保障[14]。正常運(yùn)動(dòng)時(shí)機(jī)體的能量提供主要來自于糖原的分解，糖原儲(chǔ)備量對(duì)于運(yùn)動(dòng)具有十分重要的作用，因此肝糖原和肌糖原是與疲勞相關(guān)的敏感指標(biāo)[15]。研究發(fā)現(xiàn)，肌糖原消耗增加時(shí)，機(jī)體將分解肝糖原產(chǎn)生葡萄糖進(jìn)入血液，以維持血糖水平。但是當(dāng)肝糖原儲(chǔ)備耗竭時(shí)，機(jī)體不能維持正常的血糖水平，也會(huì)導(dǎo)致大腦產(chǎn)能不足，從而功能受抑制[16]。在本研究中，核桃肽低、中、高劑量組小鼠血糖水平明顯高于乳清蛋白對(duì)照組，提示核桃肽可提高一定程度的血糖水平，提高緩解疲勞能力。核桃肽中劑量組小鼠肌糖原含量高于空白對(duì)照組小鼠，可提高肌糖原儲(chǔ)備，提高運(yùn)動(dòng)耐力，達(dá)到抗疲勞作用。

疲勞的最主要表現(xiàn)是運(yùn)動(dòng)耐力的下降，運(yùn)動(dòng)耐力是反映機(jī)體疲勞最直接、最客觀的指標(biāo)[10]。負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)是評(píng)估身體耐受力最常用的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)，且減少疲勞的敏感性與游泳時(shí)間相關(guān)[17]。負(fù)重游泳時(shí)間越長(zhǎng)，表示抗疲勞的能力越強(qiáng)。本次研究中，核桃肽低、高劑量組游泳時(shí)間比空白對(duì)照組有顯著延長(zhǎng)，表明核桃肽提高了小鼠的運(yùn)動(dòng)耐力，即提高了小鼠的抗疲勞能力。此外，本實(shí)驗(yàn)中核桃肽低劑量組干預(yù)僅提高了乳酸脫氫酶活性和負(fù)重游泳時(shí)間，核桃肽中劑量組干預(yù)可增加小鼠肌糖原含量，而核桃肽高劑量組干預(yù)可改善與疲勞相關(guān)的多個(gè)指標(biāo)，如血乳酸含量、血清尿素氮含量及負(fù)重游泳時(shí)間，可能提示干預(yù)效果與劑量之間存在線性關(guān)系。

以上結(jié)果表明，核桃肽可通過減少體內(nèi)乳酸的堆積降低血乳酸水平，通過延長(zhǎng)負(fù)重游泳時(shí)間和有效清除血清尿素氮的含量提高身體承受運(yùn)動(dòng)耐力的能力，通過提高肌糖原的含量穩(wěn)定維持肌肉運(yùn)動(dòng)的能力來源，從而起到提高小鼠抗疲勞能力的作用。

綜上，本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)小鼠進(jìn)行核桃低聚肽的干預(yù)，發(fā)現(xiàn)了核桃低聚肽對(duì)小鼠的抗疲勞作用，但其中機(jī)制未能明確，需根據(jù)進(jìn)一步的研究進(jìn)行探討。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究通過設(shè)立空白對(duì)照組和乳清蛋白組作為對(duì)照組，探討核桃肽的抗疲勞作用。結(jié)果表明，核桃肽可提高乳酸脫氫酶活性，降低血乳酸和血清尿素氮含量，提高肌糖原儲(chǔ)備量，顯著延長(zhǎng)負(fù)重游泳時(shí)間，具備一定的緩解疲勞的作用。但未能明確核桃肽抗疲勞作用的機(jī)制，其有待進(jìn)一步的探討?！?/p>