劉寶華，劉勝囡，田 翔，牛念念，李新宇，李 楊，江連洲，于文華

(1東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030；2山東萬得福實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司，山東東營 257000)

大豆分離蛋白(Soy protein isolate，SPI)以低溫變性脫脂豆粉為原料，經(jīng)堿提酸沉等工序處理后得到的蛋白質(zhì)[1]。蛋白質(zhì)凝膠是溶液中的蛋白質(zhì)分子通過有規(guī)則地交聯(lián)而形成的占據(jù)原溶液空間的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[2]。利用SPI的凝膠特性，可將其添加到火腿、腸等食品中，從而可改變產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)特性，提高產(chǎn)品對水分、油類和風(fēng)味物質(zhì)等的保持能力[3]。在儲藏過程中，SPI的品質(zhì)會隨著儲藏時間的延長而逐漸發(fā)生改變，從而影響利用SPI生產(chǎn)的產(chǎn)品品質(zhì)穩(wěn)定性，進(jìn)而極大程度地限制了商用SPI在食品領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用。近年來,關(guān)于儲藏時間對SPI結(jié)構(gòu)及凝膠性質(zhì)影響的研究較少，國內(nèi)主要集中在儲藏條件對SPI功能性質(zhì)影響的研究上，如石彥國等[4-5]對貯藏的環(huán)境以及包裝材料和氧氣含量進(jìn)行了研究；郭鳳仙[6]研究了貯藏條件、原料及加工損失對蛋白貯藏穩(wěn)定性的影響；Chun Liu等[7]研究了大豆蛋白在不同儲藏條件下的功能性質(zhì)變化；Vilene等[8]研究了儲藏溫度對不同水分活度大豆分離蛋白理化特性的影響。但目前國內(nèi)外鮮有關(guān)于儲藏時間對SPI結(jié)構(gòu)及凝膠性質(zhì)影響的研究報道。因此，本文模擬SPI的商業(yè)倉庫儲藏環(huán)境，重點(diǎn)研究儲藏時間對SPI結(jié)構(gòu)及凝膠性質(zhì)的影響，解析SPI結(jié)構(gòu)變化對其凝膠性質(zhì)的影響，以期為解決儲藏期內(nèi)SPI凝膠性質(zhì)改變提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白(蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)89.21%)，山東萬得福實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；SDS-PAGE凝膠配置試劑盒，北京索寶來試劑公司；氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉，北京新光化工試劑廠；國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

F-4500熒光分光光度計，日本日立公司；LD5-10型低速離心機(jī)，北京德世科技有限公司；K60型食品調(diào)理機(jī)，德國博朗；L-8800型氨基酸分析儀，日本日立公司；Healthcare SE260 電泳儀，美國GE公司；MAGNA-IR560傅里葉紅外光譜，美國尼高麗公司；TA.XTPLUS質(zhì)構(gòu)儀，英國SMS公司。

1.3 方法

1.3.1大豆分離蛋白的儲藏 將SPI采用PE膜真空袋(10cm×15cm，最大氧氣通透率為48cm3/(m2·24h·atm)，最大H2O 6.86g/(m2·24h·atm))包裝，置于25℃恒溫箱中儲藏。儲藏時間為150d，每隔30d對SPI性質(zhì)進(jìn)行分析。

1.3.2羰基含量的測定 參考Levine等[9]的方法對樣品的羰基含量進(jìn)行測定。將0.35mL樣品溶液與1mL含有10mmol/L 2，4-二硝基苯肼的2mol/L HCl混合，20℃水浴保溫2h。另取0.35mL樣品溶液與1mL不含有10mmol/L 2，4-二硝基苯肼的2mol/L HCl混合，同樣20℃水浴保溫2h，作為空白。隨后向每個離心管內(nèi)加入0.45mL 40%三氯乙酸，劇烈搖勻后靜置20min，10 000g離心20min后棄去上清液，隨后用1.5mL乙醇-乙酸乙酯混合溶液(1∶ 1，v/v)洗滌沉淀，然后10 000g離心10min棄去洗滌液，重復(fù)洗滌沉淀3次。最后懸浮于1.0mL 0.1mol/L含6mol/L鹽酸胍pH 7.0磷酸鹽緩沖液中，37℃水浴20min，每間隔5min劇烈振搖1次。以空白為對照在367nm處作校正，以22 000mol/(L·cm)為消光系數(shù)計算每mg蛋白質(zhì)羰基衍生物的摩爾數(shù)。

1.3.3表面疏水性的測定 表面疏水性采用ANS熒光探針法[10]進(jìn)行測定。將樣品溶于0.01 mol/L、pH 7.0磷酸鹽緩沖溶液中，調(diào)節(jié)蛋白濃度分別為0.15、0.20、0.25、0.3、0.35、0.40、0.50mg/mL，取4.0mL上述蛋白溶液，加入20μL濃度為8.0mmol/L的ANS(1-苯胺基-8-萘磺酸)溶液(用0.01mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液配制得到)，混勻后迅速測定其熒光強(qiáng)度。設(shè)定激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為390nm和470nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬均為5nm，以未加ANS溶液的相應(yīng)濃度的蛋白溶液的熒光強(qiáng)度作空白。樣品的熒光強(qiáng)度值扣除試劑空白值即為蛋白的相對熒光強(qiáng)度值。以相對熒光強(qiáng)度對蛋白質(zhì)濃度作圖，其初始斜率作為蛋白質(zhì)的表面疏水性指數(shù)(H0)。

1.3.4氨基酸組成分析 準(zhǔn)確稱取30～50mg樣品(精確至0.000 1g)至訂制的水解管中，加入10mL 6mol/L HCl溶液，隨后將水解管用氮?dú)獯祾?5min，用酒精噴燈封管，隨后置于110℃烘箱中水解22～24h后取出，待冷卻到室溫后將樣品過濾至50mL容量瓶中，并用純水洗滌水解管和濾紙3次，收集合并洗滌液和濾液于容量瓶中，定容后準(zhǔn)確量取1mL樣品于60℃真空脫酸濃縮后，加入1mL檸檬酸鈉緩沖液，用震蕩混勻器混合均勻，經(jīng)0.2～0.45μm濾膜過濾后用氨基酸自動分析儀測試。

1.3.5SDS-PAGE凝膠電泳 采用SDS-PAGE凝膠電泳對大豆分離蛋白樣品中7S、11S含量進(jìn)行測定，具體實(shí)驗(yàn)方案如下：取20μL樣品加入20μL含β-巰基乙醇的4X上樣緩沖溶液中，煮沸5min。分別配置濃度為12%(w/v)的分離膠和濃度為5%(w/v)的濃縮膠，樣品添加量為10μL。電泳過程恒壓，濃縮膠和分離膠的電壓分別為80V和120V。染色液為0.1%考馬斯亮藍(lán)R-250(甲醇︰冰乙酸=4∶ 1∶ 5)的混合溶液，脫色液為(甲醇∶ 冰乙酸∶ 水=4∶ 1∶ 5)混合溶液。

1.3.6大豆分離蛋白凝膠的制備 將大豆分離蛋白與水(1∶ 4，w/v)倒入食品調(diào)理機(jī)中進(jìn)行預(yù)處理，處理結(jié)束后將混合物在3 500r/min下離心13min，85℃恒溫水浴鍋中加熱45min，冷卻至室溫后將其在4℃條件下冷藏8h以完全形成凝膠。冷藏結(jié)束后，制成厚度為30mm的凝膠塊，用于質(zhì)構(gòu)測定。

1.3.7大豆分離蛋白凝膠質(zhì)構(gòu)性質(zhì)的測定 大豆分離蛋白凝膠強(qiáng)度采用TA.XTPLUS質(zhì)地分析儀進(jìn)行測定，測定參數(shù)為穿刺模式、p/0.5 探頭，測試前速率1 mm/s、測試速率2 mm/s、測試后速率10 mm/s、感應(yīng)力5 g，壓縮程度80%，測定溫度為室溫，每個樣品重復(fù)3次測定，取其平均值作為最終結(jié)果。凝膠強(qiáng)度測試完畢后，調(diào)整TA.XTPLUS質(zhì)地分析儀的分析程序，測定凝膠塊的硬度，測定參數(shù)為TPA模式、測試前速率1 mm/s、測試速率5 mm/s、測試后速率5 mm/s、感應(yīng)力5 g、測試前速度距離10 mm。

1.3.8紅外光譜 依據(jù)Mantsch[11]的方法對不同儲藏時間的樣品進(jìn)行紅外光譜測試。稱取樣品2 mg，加入溴化鉀100 mg，壓片后進(jìn)行測定。在25℃條件下，掃描波數(shù)譜段范圍為4 000～400 cm-1，波數(shù)精度為0.01 cm-1，掃描次數(shù)為64次，譜圖利用Peakfit Version軟件進(jìn)行處理。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

每組試驗(yàn)都進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，采用Origin 8.5和PeakFit 4.12軟件分析數(shù)據(jù)并作圖。利用SPSS Statistics 22軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA差異顯著性分析，P<0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 儲藏時間對SPI樣品羰基含量的影響

SPI中羰基含量的多少可以反映其被氧化的程度，由于SPI的羰基衍生物通常來源于賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)和脯氨酸(Pro)等氨基酸殘基的氧化，或來源于蛋白骨架斷裂的產(chǎn)物(α-酰胺化反應(yīng))，因此，SPI的蛋白質(zhì)羰基含量增加通常表明其發(fā)生了氧化反應(yīng)[12]。由圖1可知，隨著儲藏時間的延長，SPI羰基含量逐漸升高，說明SPI在儲藏過程中發(fā)生了氧化反應(yīng)。在SPI的制取過程中，大豆細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞會使多不飽和脂肪酸易被脂肪氧合酶催化而產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，進(jìn)而生成自由基和活性次生氧化產(chǎn)物，可能會誘導(dǎo)SPI氧化[13]。工業(yè)上生產(chǎn)SPI所采用的原料為低變性脫脂豆粕，其中含有1%左右的殘余脂質(zhì)，工業(yè)化生產(chǎn)SPI的過程中存在高溫加熱過程，可能會導(dǎo)致這些油脂發(fā)生氧化生成脂質(zhì)過氧化物，進(jìn)而發(fā)生自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而生成大量自由基，所生成的自由基可能攻擊蛋白質(zhì)使其氧化[14]。SPI的制備過程中會涉及原料與攪拌器以及噴霧干燥器等設(shè)備的接觸，從而有可能向SPI中引入金屬離子，并與過氧化物反應(yīng)產(chǎn)生自由基進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)氧化[15]。也有可能是PE膜真空袋中存有微量氧氣，在儲藏過程中，誘導(dǎo)SPI發(fā)生了氧化反應(yīng)。蛋白質(zhì)的氧化可使其氨基酸側(cè)鏈和蛋白質(zhì)多聚肽骨架發(fā)生一系列變化，如蛋白質(zhì)斷裂、交聯(lián)、伸展和構(gòu)象的改變[16]。

圖1 儲藏期內(nèi)大豆分離蛋白羰基含量變化

2.2 儲藏時間對SPI表面疏水性的影響

蛋白質(zhì)的疏水作用是一種配位體間非共價鍵相互作用。Boatright等[17]發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)發(fā)生氧化后會使其表面疏水性下降。黃友如[18]研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)的表面疏水性會隨著蛋白質(zhì)氧化程度的加劇而逐漸下降。由圖2可知，隨著儲藏期延長，SPI的表面疏水性逐漸降低，這可能是由于SPI發(fā)生氧化反應(yīng)，較大程度地促進(jìn)了聚集物的形成，從而使蛋白表面疏水性氨基酸逐漸包埋于分子內(nèi)部，降低了大豆蛋白表面疏水性。吳偉[2]研究發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物可以氧化SPI疏水側(cè)鏈基團(tuán)，進(jìn)而使蛋白質(zhì)部分去折疊，暴露出的疏水基團(tuán)在疏水相互作用和氧化共價交聯(lián)的共同作用下可生成氧化聚集體，從而降低蛋白質(zhì)的表面疏水性。此外，儲藏期內(nèi)SPI表面疏水性的下降也有可能是由于親水基團(tuán)(羰基)形成，蛋白質(zhì)聚集以及疏水性殘基的暴露引起的結(jié)構(gòu)修飾[19]。

圖2 儲藏期內(nèi)SPI表面疏水性變化

2.3 儲藏時間對SPI氨基酸組成的影響

如表1所示，由于在預(yù)處理過程中采用了濃HCl水解樣品，從而使色氨酸(Trp)被完全破壞，且天冬酰胺(Asn)和谷氨酰胺(Gln)的酰胺基被水解，因此表1中沒有Trp、Asn和Gln的含量。在氧氣及金屬離子(Fe3+)的作用下，由于自由基傳遞反應(yīng)的發(fā)生，使得蛋白質(zhì)肽鏈中氨基酸殘基損傷以及肽鍵斷裂，從而使蛋白質(zhì)發(fā)生氧化。一般參與氧化反應(yīng)的有N-末端的α-氨基、Pro、Arg和Lys側(cè)鏈以及半胱氨酸(Cys)。由表1可知，Cys、Arg和Lys的含量隨著儲藏時間的延長而逐漸降低，由此可推測，在儲藏過程中發(fā)生了氧化反應(yīng)使得Arg和Lys側(cè)鏈被氧化生成羰基。吳偉[2]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)ROO·、HPODE和丙烯醛分別氧化后，大豆蛋白的游離氨基和有效賴氨酸含量顯著下降(P<0.05)。Liu等[20]研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)經(jīng)ROO·氧化處理后，其Lys殘基的ε-氨基可轉(zhuǎn)變?yōu)轸驶倥c蛋白質(zhì)的氨基反應(yīng)進(jìn)一步生成西佛堿，從而使蛋白質(zhì)的游離氨基和有效賴氨酸含量發(fā)生下降。相關(guān)性分析表明，酪氨酸(r=0.144，P<0.05)、半胱氨酸(r=0.877，P<0.05)、苯丙氨酸(r=0.480，P<0.05)、賴氨酸(r=0.956，P<0.05)、精氨酸(r=0.814，P<0.05)和脯氨酸(r=0.825，P<0.05)含量與表面疏水性呈正相關(guān)。

表1 儲藏期內(nèi)SPI氨基酸含量變化

2.4 SDS-PAGE凝膠電泳分析

由圖3可知，儲藏30 d后，7S和11S亞基條帶顏色明顯加深，條帶變寬，而在30～150 d儲藏過程中，7S和11S亞基條帶并未發(fā)生顯著變化，且在儲藏過程中并沒有新的蛋白質(zhì)聚合物生產(chǎn)。自由基可通過奪氫、加氧、偶合以及裂解等反應(yīng)直接誘導(dǎo)蛋白質(zhì)發(fā)生氧化，從而使蛋白主肽鏈斷裂、側(cè)鏈基團(tuán)氧化以及形成共價交聯(lián)物[15]。而吳偉[2]通過對大豆蛋白進(jìn)行AAPH、HPODE和MAD氧化，結(jié)果表明，隨著AAPH、HPODE和MAD濃度的增大，大豆蛋白的亞基條帶顏色呈現(xiàn)不同程度的變淺，并在分離膠頂部出現(xiàn)聚集體條帶。由此推測，本試驗(yàn)在模擬倉儲環(huán)境儲藏下，SPI的氧化反應(yīng)并不劇烈，肽鏈未出現(xiàn)顯著斷裂。

圖3 儲藏期內(nèi)SPI的SDS-PAGE電泳

2.5 大豆分離蛋白紅外光譜分析

FT-IR光譜的研究可以定量給出樣品中蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。由圖4、表2可知，在儲藏初期，大豆蛋白的結(jié)構(gòu)是以β-折疊為主，其含量為37.42%。儲藏0～60 d時，無規(guī)則卷曲的含量逐漸下降，說明蛋白質(zhì)趨向于一種有序的狀態(tài)，而α-螺旋和β-折疊的含量總體呈現(xiàn)上升的趨勢。由于α-螺旋和β-折疊埋藏在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部，從而在0～60 d內(nèi)蛋白質(zhì)的表面疏水性會下降。儲藏60～120 d時，無規(guī)則卷曲含量逐漸上升，α-螺旋和β-折疊的含量逐漸下降，蛋白質(zhì)趨向于一種無序狀態(tài)。當(dāng)儲藏時間達(dá)到150d時，α-螺旋含量下降至13.78%，β-折疊上升至42.48%，無規(guī)則卷曲含量下降至15.57%，從而推測該階段蛋白質(zhì)趨向于一種有序狀態(tài)，但大量的α-螺旋和β-折疊包埋在分子內(nèi)部導(dǎo)致蛋白表面疏水性呈下降趨勢，從而分子間疏水作用力下降。吳偉[2]通過研究脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物對SPI結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)氧化會導(dǎo)致SPI的α-螺旋含量下降，并伴隨著聚集體和共價交聯(lián)物的生成。由此可推測，儲藏期內(nèi)SPI的二級結(jié)構(gòu)逐漸發(fā)生改變。

圖4 儲藏期內(nèi)SPI的紅外光譜

圖5 儲藏期內(nèi)大豆分離蛋白酰胺Ⅰ帶的擬合圖譜

2.6 儲藏期對SPI凝膠性質(zhì)的影響

在大豆蛋白凝膠形成的過程中，7S的β亞基與11S的堿性亞基有選擇地進(jìn)行相互作用，并直接影響著大豆蛋白的凝膠性，11S蛋白質(zhì)的酸性亞基對凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成具有重要作用。蛋白凝膠形成時，受熱會使蛋白分子分散，憎水基團(tuán)暴露并由氫鍵、二硫鍵等結(jié)合形成特殊的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，因此大豆蛋白的結(jié)構(gòu)決定了其凝膠的形成過程。由圖6可知，在0～60 d時，SPI凝膠的凝膠強(qiáng)度及硬度逐漸下降，在60～120 d時，其凝膠強(qiáng)度及硬度又逐漸上升，在150 d時，下降至最低值。SPI凝膠的凝膠強(qiáng)度及硬度變化規(guī)律與其二級結(jié)構(gòu)相似，由此可推測，儲藏期內(nèi)SPI二級結(jié)構(gòu)的改變會進(jìn)而影響其凝膠性質(zhì)。由表1可知，隨著儲藏時間的延長，半胱氨酸的含量逐漸降低，而蛋白質(zhì)氧化可以改變半胱氨酸的氧化還原狀態(tài)，改變巰基和二硫鍵的數(shù)量和分布[21]。

表2 儲藏期內(nèi)SPI的二級結(jié)構(gòu)含量

圖6 儲藏期內(nèi)大豆分離蛋白的凝膠性質(zhì)變化

吳偉等[22-23]研究發(fā)現(xiàn)，隨著蛋白質(zhì)氧化程度的加深，凝膠硬度逐漸下降，這是由于蛋白質(zhì)氧化使得維持其凝膠硬度的主要作用力(二硫鍵)降低。這主要是由于蛋白質(zhì)氧化導(dǎo)致二硫鍵向游離巰基轉(zhuǎn)變，隨著蛋白質(zhì)氧化過程的持續(xù)，這種游離巰基被不斷氧化，最終變?yōu)椴豢赡鏍顟B(tài)[2]。Ooizumi等[24]研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)氧化聚集會破壞大豆蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，進(jìn)而降低大豆蛋白凝膠的強(qiáng)度和持水性，改變其微觀結(jié)構(gòu)。還可能是由于隨著儲藏時間的延長，-SH基團(tuán)被脂肪氧合酶催化產(chǎn)生的脂質(zhì)氫過氧化物部分氧化，進(jìn)而使通過-SH/-S-S-交換反應(yīng)形成的分子間二硫鍵數(shù)量降低[25]，從而導(dǎo)致SPI凝膠強(qiáng)度及硬度下降。相關(guān)性分析表明，SPI凝膠強(qiáng)度與表面疏水性(r=0.592，P<0.05)，凝膠硬度與表面疏水性(r=0.793，P<0.05)均呈正相關(guān)。

3 結(jié)論

將SPI采用PE膜真空袋包裝，25℃儲藏0、30、60、90、120、150d，研究儲藏時間對SPI結(jié)構(gòu)及凝膠性質(zhì)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著儲藏時間的延長，SPI的羰基含量逐漸上升，表明SPI在儲藏過程中發(fā)生了氧化反應(yīng)；隨著儲藏時間的延長，SPI的表面疏水性下降，氨基酸含量發(fā)生改變，且紅外光譜結(jié)果表明，儲藏期內(nèi)SPI的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變；儲藏0～60d時，SPI凝膠強(qiáng)度及硬度隨著儲藏期的延長而逐漸減弱，60～120d時，凝膠強(qiáng)度及硬度逐漸增強(qiáng)，當(dāng)儲藏時間達(dá)到150d時，凝膠強(qiáng)度及硬度降至最小值，SPI凝膠性質(zhì)的變化規(guī)律與其二級結(jié)構(gòu)相似，且其凝膠強(qiáng)度及硬度的數(shù)值均與表面疏水性呈正相關(guān)?！?/p>