盧嘉懿，張馳，李汴生,2*，阮征

1(華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州，510640) 2(廣東省天然產(chǎn)物綠色加工與產(chǎn)品安全重點實驗室，廣東 廣州，510640)

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid，GABA)是目前研究較多的一種非蛋白氨基酸[1-2]，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要抑制性神經(jīng)遞質(zhì),有降壓、利尿、鎮(zhèn)靜等生理功能[3]，對神經(jīng)系統(tǒng)疾病如癲癇、帕金森綜合征、精神分裂、失眠、抑郁等有一定療效[4]。

2017年中國生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)協(xié)會發(fā)布的《T/CBFIA08003—2017食用植物酵素》標準要求液態(tài)食用植物酵素中GABA含量不低于0.03mg/kg。

GABA在谷物、乳制品、酒類、泡菜制品等方面的研究應(yīng)用已較為深入。果蔬汁經(jīng)發(fā)酵后，GABA含量顯著增加，乳酸菌發(fā)酵的西紅柿汁中，GABA含量顯著高于未發(fā)酵西紅柿汁，且發(fā)酵結(jié)束后GABA含量仍在增加[5]；椰棗泥[6]、馬齒莧[7]、葛根汁[8]等經(jīng)發(fā)酵后，GABA含量亦有所提高。但目前仍缺乏對發(fā)酵果蔬汁中GABA產(chǎn)生來源的探究。

微生物主要利用GABA旁路來合成GABA(圖1)。葡萄糖通過檸檬酸循環(huán)(TCA循環(huán))代謝為α-酮戊二酸，并通過谷氨酸脫氫酶轉(zhuǎn)化為谷氨酸。谷氨酸鹽被谷氨酸脫羧酶(glutamatedecarboxylase,GAD)分解成GABA。GAD在動物、植物和微生物中均有存在。GAD所催化的L-谷氨酸(L-glutamicacid，L-Glu)脫羧生成GABA的反應(yīng)，是生物GABA合成的關(guān)鍵，絕大多數(shù)生物合成GABA的研究都依賴該途徑。

圖1 GABA代謝途徑 Fig.1 The metabolic pathway of GABA

除了L-Glu，谷氨酸鈉(sodiumglutamate,MSG)也可作為GAD的底物。此外，另一種腐胺途徑(見圖1)發(fā)現(xiàn)較晚,代謝途徑復(fù)雜,有毒且價格昂貴，應(yīng)用極少，難以像葡萄糖、L-Glu和谷氨酸鈉等物質(zhì)作為前體直接添加在發(fā)酵液或轉(zhuǎn)化液中用于GABA的生物合成。

在乳酸菌發(fā)酵果蔬汁中，因果蔬原料本身特性差異(例如GAD活性)，菌種發(fā)酵代謝特性差異以及添加物等都會影響產(chǎn)品中的GABA含量。本研究選取常用于發(fā)酵的雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、發(fā)酵桿菌和植物乳桿菌[9]，以荔枝、龍眼、青瓜、臍橙、蘋果、梨為對象，分析不同菌種和不同果蔬原料中GABA產(chǎn)生的異同，并探究MSG、葡萄糖和L-Glu這3種常用底物在發(fā)酵果蔬汁中的利用情況。最后，將菌液和果汁分開單獨處理并與發(fā)酵果汁做對比，以探究發(fā)酵果蔬汁中GABA的產(chǎn)生來源，為生產(chǎn)富含GABA的膳食飲品提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售青瓜、臍橙、紅富士蘋果、蜜梨、石硤龍眼、妃子笑荔枝，選擇成熟度合適、無明顯缺陷的果品；植物乳桿菌LP115(Lactobacillusplantarum)，雙歧桿菌 LYD 10DCU-S(Bifidobacterium)，嗜酸乳桿菌LYO 10DCU-S(Lactobacillusacidophilus)，副干酪乳桿菌 LYO 50DCU-NM(Lactobacillusparmesei)，杜邦·丹尼斯克公司提供；γ-氨基丁酸標準品，Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療機械廠；SPX-150D-Z生化(恒溫)培養(yǎng)箱，上海博訊實驗有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；752N紫外可見分光光度計，上海精密科學(xué)儀器有限公司；HR1895榨汁機，飛利浦(中國)投資有限公司；Thermo U-3000高效液相色譜儀。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

果蔬汁制備：臍橙、龍眼、荔枝洗凈并去皮去核，蘋果、梨、青瓜洗凈，用榨汁機分別榨汁，過100目紗布；每150 mL分裝于250 mL潔凈錐形瓶中，使用硅膠塞密封，將果汁迅速加熱至80 ℃，水浴保溫10 min后迅速冷卻至40 ℃，準備接種。

不同菌種發(fā)酵差異實驗：荔枝汁制備完畢后分別接種植物乳桿菌、雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌和副干酪乳桿菌單一菌種，4種菌兩兩之間1∶1復(fù)配成混合菌種，和4種菌1∶1∶1∶1復(fù)配成混合菌種，使得初始活菌數(shù)達7.0 lg(CFU/mL)左右，采用37 ℃恒溫箱靜置發(fā)酵24 h，取0 h和24 h的樣品進行指標測定。

不同果蔬汁發(fā)酵差異實驗：6種果蔬汁接種4%的植物乳桿菌菌液，初始活菌數(shù)達7.0 lg(CFU/mL)，37 ℃恒溫箱靜置發(fā)酵24 h，取0 h和24 h的樣品進行指標測定。

不同添加物差異實驗：荔枝汁制備完畢后分別加入質(zhì)量分數(shù)為1%、2%、3%的谷氨酸鈉(MSG)、葡萄糖(Glucose)或L-谷氨酸(L-Glu)，并接種4%的植物乳桿菌，37 ℃恒溫箱靜置發(fā)酵24 h，取0 h和24 h的樣品進行指標測定。

發(fā)酵果汁中產(chǎn)生GABA機理探究：荔枝清汁(榨汁后過100 目紗布)接種4%的植物乳桿菌于37 ℃發(fā)酵24 h；MRS液體培養(yǎng)基接種4%的植物乳桿菌，后用乳酸調(diào)pH值至3.32(與發(fā)酵結(jié)束后的荔枝汁相同)的荔枝汁于37 ℃放置24 h。取荔枝濁汁(榨汁后不過濾)重復(fù)上述制樣步驟。

1.3.2 指標測定

活菌數(shù)：參考《GB 478935—2016食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗乳酸菌檢驗》，采用稀釋平板計數(shù)法進行測定；pH值：參考《GB 10468—1989水果和蔬菜產(chǎn)品pH值的測定方法》，采用電位差法；GAD粗酶液的制備參考文獻[10]；GAD活性測定參考文獻[11]。

1.3.3 高效液相色譜法測定GABA含量

色譜柱：Waters Symmetry C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，樣品處理及色譜條件參考文獻[12]，如圖2，圖3所示。

圖2 GABA標準品色譜圖Fig.2 The chromatogram of GABA standard

圖3 GABA標準溶液的工作曲線Fig.3 The standard curve of GABA solution

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 9.0、SPSS 20.0和Excel 2007軟件進行處理和分析。若無特別標明，每個數(shù)據(jù)均平行測定3次，結(jié)果表示為均值±標準偏差。采用Duncan新復(fù)極差分析法，取95%置信區(qū)間(p<0.05)；采用Pearson相關(guān)性分析，p<0.05為顯著相關(guān)，p<0.01為極顯著相關(guān)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵菌種對荔枝果汁中GABA含量的影響

植物乳桿菌是頻繁被報道的高產(chǎn)GABA的菌種[13]，常在泡菜[14]、米酒[15]等傳統(tǒng)發(fā)酵果蔬、谷物制品中分離及應(yīng)用。副干酪乳桿菌也有在發(fā)酵乳制品、發(fā)酵肉制品中分離及應(yīng)用于產(chǎn)生GABA的研究[16-17]。嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌也是常用于發(fā)酵果蔬汁的菌種，但與GABA相關(guān)方面的研究很少。不同菌種發(fā)酵產(chǎn)生GABA的能力差異值得深入研究。

荔枝是典型的富含GABA的水果，以荔枝為對象，探究不同菌種發(fā)酵對荔枝汁中GABA含量的影響。如圖4所示，各菌種在荔枝汁中增殖情況差異不大，發(fā)酵24 h后活菌數(shù)均能增加到10.0 lg(CFU/mL)左右，但不同菌種發(fā)酵的荔枝汁中GABA含量差異較大，其中植物乳桿菌發(fā)酵荔枝汁中GABA含量最高。KIM等[3]在短乳桿菌發(fā)酵的黑樹莓汁和KO等[19]在黑豆乳中的研究都表明菌種發(fā)酵產(chǎn)生GABA與其代謝增殖能力差異無顯著相關(guān)性，而與菌種中GAD活性相關(guān)。

不同菌種發(fā)酵荔枝汁中GABA含量增加情況與各菌種的酸化能力顯著相關(guān)(p<0.05)。各菌種在荔枝汁中酸化能力不同，其中植物乳桿菌酸化能力最強，能將荔枝汁的pH值從初始的6.65降3.32。荔枝果汁中初始GABA含量為1.33 mg/kg,植物乳桿菌發(fā)酵后的荔枝果汁中GABA含量最高(1.87 mg/kg)，其次是嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌和雙歧桿菌。研究表明，當(dāng)初始發(fā)酵pH值為3.5～5.5時，GABA的合成差異不顯著，當(dāng)初始發(fā)酵pH值為6.0時，GABA產(chǎn)量顯著減少[3]。由于發(fā)酵時乳酸等有機酸的積累，使pH值下降并激活GAD開始生產(chǎn)GABA[20]，而厭氧條件亦可促進GAD的表達，有利于GABA的合成。而負責(zé)分解GABA的Gab T和Gab D的最適pH值約為 9.0，因此乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的酸性環(huán)境除了可以促進GABA合成外還可抑制GABA的分解代謝[20]。

圖4 不同菌種發(fā)酵荔枝汁中的GABA含量Fig.4 The content of GABA in lychee juices fermented by different starters

將4種菌種進行兩兩復(fù)配研究，因菌種之間的協(xié)同作用，菌種復(fù)配發(fā)酵時，荔枝汁中活菌數(shù)、產(chǎn)酸量和GABA含量均比菌種單一發(fā)酵有不同程度的提高。

結(jié)合圖4和圖5，單一菌種發(fā)酵時產(chǎn)生的GABA的能力基本決定了復(fù)配時菌種產(chǎn)生GABA的能力，有植物乳桿菌參與的復(fù)配方案所發(fā)酵果汁中的GABA含量均排在前列，其中植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌1∶1復(fù)配發(fā)酵時表現(xiàn)最優(yōu)。與當(dāng)4種菌1∶1∶1∶1混合發(fā)酵時，GABA含量與植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌1∶1發(fā)酵無顯著差異，說明4種菌混合發(fā)酵時，植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌在荔枝汁中起主導(dǎo)作用。菌種復(fù)配發(fā)酵實驗規(guī)律也與單一發(fā)酵時結(jié)果相符合，不同復(fù)配方案發(fā)酵荔枝汁中GABA增加情況與菌種產(chǎn)酸能力呈正相關(guān)(p<0.05)。菌種產(chǎn)酸能力越強，其創(chuàng)造的酸性條件越能刺激組織產(chǎn)生GABA。

圖5 不同菌種復(fù)配發(fā)酵荔枝汁中的GABA含量Fig.5 The content of GABA in lychee juices fermented by different combinations of starters

2.2 不同果蔬汁發(fā)酵前后GABA含量的變化

用前文所述在荔枝果汁中發(fā)酵表現(xiàn)最優(yōu)的植物乳桿菌發(fā)酵不同的果蔬汁。如圖6所示，不同果蔬汁中初始GABA含量差異較大，蘋果汁和梨汁中GABA含量只有0.01 mg/kg左右，而荔枝汁和龍眼汁中含量最高，分別為1.33 mg/kg和1.27 mg/kg。雖然蘋果汁和梨汁初始GABA含量沒有達到《T/CBFIA 08003—2017食用植物酵素》標準中液態(tài)食用植物酵素中GABA含量不低于0.03 mg/kg的要求，但經(jīng)植物乳桿菌發(fā)酵后蘋果汁和梨汁中的GABA含量增加到0.11 mg/kg和0.14 mg/kg，遠超過了標準。

圖6 不同果蔬汁發(fā)酵前后GABA含量變化Fig.6 The content of GABA in different juices before and after fermentation

發(fā)酵后各果蔬汁中GABA含量增加程度不一，增加量與果蔬汁中初始GAD活性顯著相關(guān)(p<0.05)，蘋果汁、梨汁、青瓜汁和橙汁中GAD活性較低，發(fā)酵后增量較不顯著，而龍眼汁、荔枝汁中GAD活性高，發(fā)酵后GABA含量增加明顯。

2.3 添加物對發(fā)酵荔枝汁中GABA含量的影響

葡萄糖(glucose)、谷氨酸鈉(MSG)和L-谷氨酸(L-Glu)沒有毒性且相對廉價易得，因而不少研究將其作為前體，直接添加在發(fā)酵液或轉(zhuǎn)化液以促進GABA的合成。例如乳酸菌在棗渣中發(fā)酵時添加谷氨酸，轉(zhuǎn)化率可達80%～90%[21]；在牛奶中加入谷氨酸可使GABA產(chǎn)量提高20%[22]；加入糖、MSG的黑豆乳中GABA含量都有不同程度的提高。如圖1和圖7所示，MSG、glucose、L-Glu都是GABA代謝路徑中的底物，但在植物乳桿菌發(fā)酵荔枝汁中，這3種底物的轉(zhuǎn)化規(guī)律不盡相同。

圖7中可看出，植物乳桿菌在荔枝汁中對MSG的利用率最高，相同添加量下，3種物質(zhì)中添加MSG的發(fā)酵荔枝汁中的GABA含量最高。但隨著MSG添加量的增加，果汁中GABA含量反而有下降的趨勢，這有可能是因底物的濃度的增加而觸發(fā)了逆反應(yīng)。在發(fā)芽糙米的GABA富集上也出現(xiàn)了相似的情況，當(dāng)MSG含量大于2 mg/kg時，GABA含量隨MSG濃度升高而下降[23]。相對于MSG和L-Glu，葡萄糖的添加對發(fā)酵荔枝汁中的GABA產(chǎn)量影響較小，這與荔枝汁中達到17.82 g/100g的總糖含量相關(guān)。在發(fā)酵果蔬汁中添加底物不僅要考慮對GABA含量的影響，還要考慮添加物對健康、果汁感官及消費者接受度等因素[3]，例如有研究表明在黑豆乳中加入5%的MSG后風(fēng)味變得難以接受[19]。

LJ-荔枝汁；無添加LF-未添加前體物質(zhì)的發(fā)酵荔枝汁圖7 不同添加物對荔枝果汁中GABA含量的影響Fig.7 The content of GABA in fermented lychee juices after addry glncose,MSG and L-Glu

2.4 發(fā)酵荔枝汁中產(chǎn)GABA機理探究

植物乳桿菌發(fā)酵荔枝汁中增加的GABA包括兩種來源：一是因荔枝組織對外界條件(如破碎、溫度、低氧、酸度)應(yīng)激代謝生成；二是植物乳桿菌在荔枝汁中代謝產(chǎn)生。為了探究植物乳桿菌發(fā)酵荔枝汁中GABA增加的機理，將菌液和汁分開處理并與發(fā)酵荔枝汁對比。荔枝汁接種4%植物乳桿菌并于37 ℃發(fā)酵24 h后GABA含量由1.33 mg/kg增加至1.87 mg/kg;經(jīng)過調(diào)酸酸化的荔枝汁在37 ℃下儲藏24 h后，GABA含量從1.33 mg/kg增加到1.38 mg/kg。添加了4%植物乳桿菌的MRS液體培養(yǎng)基(即圖8中的純菌液)中的GABA含量則由0 mg/kg增加到0.18 mg/kg。

圖8 發(fā)酵荔枝汁中GABA含量構(gòu)成圖Fig.8 The composition of GABA content in fermented lychee juice

可以發(fā)現(xiàn)純菌液和酸化荔枝汁單獨放置后兩者共同增加的GABA含量仍顯著低于發(fā)酵荔枝汁中的增加量。一是因為發(fā)酵荔枝汁中由植物乳桿菌創(chuàng)造的外界條件(如發(fā)酵產(chǎn)生的比人為添加乳酸酸化更復(fù)雜穩(wěn)定的有機酸體系)更能促使荔枝組織產(chǎn)生GABA；二是因為植物乳桿菌在荔枝汁中有更充足的營養(yǎng)物質(zhì)，比在MRS培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)生更多GABA；三是因為發(fā)酵荔枝汁中因植物乳桿菌作用使得荔枝組織細胞通透性增強，使得原有荔枝汁中的GABA和因外界刺激而新產(chǎn)生的GABA更好地溶出，例如在乳酸菌發(fā)酵棗渣的制備中，為提高GABA的含量，對棗渣的前處理如添加淀粉酶、纖維素酶和果膠酶是必不可少的[21]，除了能使菌種更好地利用營養(yǎng)物質(zhì)之外，也能使組織中產(chǎn)生的GABA更好地溶出。

酸化的荔枝濁汁放置后GABA增加量高于酸化后荔枝清汁GABA的增加量，這是因荔枝濁汁中含有更多的荔枝組織和其內(nèi)GAD活性導(dǎo)致的。因此濁汁發(fā)酵后GABA增量顯著高于清汁發(fā)酵后GABA的增量。

3 結(jié)論

乳酸菌發(fā)酵能顯著提高果蔬汁中GABA含量。不同果蔬組織中原有GAD活性越高，發(fā)酵后GABA增量越多。不同發(fā)酵菌種酸化能力越強，發(fā)酵果汁中GABA增量越多。與葡萄糖和L-Glu相比，植物乳桿菌在荔枝汁中對MSG的利用率最高，但隨著MSG添加量的增加，果汁中GABA含量反而有下降的趨勢，而葡萄糖的添加對發(fā)酵荔枝汁中的GABA含量幾乎沒有影響。植物乳桿菌不僅能在荔枝中發(fā)酵產(chǎn)生GABA，其創(chuàng)造的酸性低氧條件能刺激荔枝組織代謝產(chǎn)生GABA，并且能使荔枝組織細胞通透性增強，讓荔枝汁中原有的GABA和因外界刺激而使荔枝組織新產(chǎn)生的GABA更好地溶出。通過乳酸菌發(fā)酵果蔬汁這一系列產(chǎn)品來滿足消費者對富含GABA的膳食的需求是可靠并具有前景的。