田有秋，賈金霞，束旭，任曉婕，關(guān)月，謝紅，許楊潔，王昱灃

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京，210095)

淡紅側(cè)耳是一種側(cè)耳科、側(cè)耳屬的食用菌[1]，其色鮮味美，蛋白質(zhì)、粗纖維、維生素和氨基酸等含量豐富[2]，作為一種兼食用、藥用及觀(guān)賞的食用菌而逐步被人們接受。多糖是組成生物體的一種高分子碳水化合物，不僅是細(xì)胞的結(jié)構(gòu)材料，而且為細(xì)胞活動(dòng)提供能量；它在細(xì)胞分化、代謝、生長(zhǎng)、胚胎發(fā)育、免疫應(yīng)答、抗血栓和抗腫瘤等方面發(fā)揮著重大作用[3]。淡紅側(cè)耳子實(shí)體粗多糖具有抗氧化等活性[4]，是一種重要的活性成分。針對(duì)淡紅側(cè)耳的研究目前主要包括營(yíng)養(yǎng)成分分析[5-6]、提取條件優(yōu)化[7]、深層發(fā)酵[8]、和菌絲體多糖[9]等方面，對(duì)其子實(shí)體多糖的純化、純化后的多糖結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。多糖結(jié)構(gòu)與其生物活性息息相關(guān)，對(duì)純化多糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究不僅有助于進(jìn)一步開(kāi)展藥理學(xué)、毒理學(xué)研究以及結(jié)構(gòu)修飾改造等，更可以為多糖類(lèi)新藥的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

本研究以實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)該多糖的提取研究結(jié)果為基礎(chǔ)[10]，首次對(duì)所獲得的淡紅側(cè)耳粗多糖進(jìn)行分離純化，并對(duì)其純化組分進(jìn)行分子質(zhì)量測(cè)定及單糖組成分析，采用紫外光譜、紅外光譜及剛果紅實(shí)驗(yàn)對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步鑒定，且對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行研究，為淡紅側(cè)耳多糖的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

淡紅側(cè)耳，由廣東銀新現(xiàn)代農(nóng)業(yè)股份有限公司提供。

DEAE-纖維素-52，葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma公司；Sephadex G-150，臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠(chǎng)；單糖標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物科技有限公司；甲醇：(色譜純)，KBr：(光譜純)，無(wú)水乙醇，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈(色譜純)，苯酚、剛果紅、葡萄糖糖醛酸、K2SO4、H2SO4、NaCl(分析純)，南京化學(xué)試劑股份有限公司；咔唑、三氟乙酸、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)，阿拉丁試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

層析柱，上海煊盛生化科技有限公司；STARTER 3100冷凍干燥機(jī)，奧豪斯儀器有限公司；LNG-T83B 離心濃縮儀，太倉(cāng)華利達(dá)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備公司；EU-2600R紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海昂拉儀器有限公司；HL-2S恒流泵，上海滬西分析儀器有限公司；Nicolet IR200 紅外光譜儀，美國(guó)Nicolet公司；Waters 1525高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司；DBS-100電腦全自動(dòng)部分收集器，上海滬西分析儀器有限公司；LC-20AD島津高效液相色譜儀，美國(guó)島津公司； RE52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠(chǎng)；

1.3 方法

1.3.1 淡紅側(cè)耳粗多糖的提取

將淡紅側(cè)耳子實(shí)體干品洗凈、烘干后粉碎，稱(chēng)取2.0 g細(xì)粉，按固液比1∶30.6 (g∶mL)，提取溫度95 ℃，提取時(shí)間3.9 h的條件進(jìn)行水提醇沉，抽濾后得粗多糖粉末；將粗多糖粉末復(fù)溶至1.0 mg/mL，采用大孔陰離子交換樹(shù)脂D315按樹(shù)脂用量0.1 g/mL，pH 6，45 ℃，120 min的條件進(jìn)行靜態(tài)脫色；采用Sevage法對(duì)脫色后的多糖溶液進(jìn)行脫蛋白；透析48 h后冷凍干燥，得淡紅側(cè)耳粗多糖[10]。

1.3.2 淡紅側(cè)耳粗多糖的分離純化

1.3.2.1 DEAE-纖維素-52 陰離子層析柱純化淡紅側(cè)耳多糖

稱(chēng)取80.0 mg淡紅側(cè)耳粗多糖溶于8 mL去離子水中，上樣于層析柱(Φ26.0 mm×300.0 mm)，裝柱體積1 BV (設(shè)定1 BV=133 mL)；分別用0、0.1、0.3、0.5、0.7 mol/L NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫(流速1 mL/min，10 min/管)；苯酚-硫酸法[11]檢測(cè)偶數(shù)管多糖含量，繪制洗脫曲線(xiàn)，收集不同組分；50 ℃濃縮至約30 mL，去離子水透析48 h，將透析液真空冷凍干燥，得多糖各組分[12]。

1.3.2.2 Sephadex G-150層析柱純化淡紅側(cè)耳多糖

分別稱(chēng)取20.0 mg上述多糖組分溶于5 mL去離子水中，上樣于層析柱(Φ16.0 mm×300.0 mm)，裝柱體積1 BV (設(shè)定1 BV=50 mL)；用去離子水洗脫(流速0.3 mL/min，10 min /管)；以管數(shù)為橫坐標(biāo)，A490為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線(xiàn)，根據(jù)峰值分別收集不同組分；50 ℃濃縮至約30 mL，去離子水透析48 h，冷凍干燥后得多糖終純化產(chǎn)物。

1.3.3 淡紅側(cè)耳多糖的純度及相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

1.3.3.1 高效液相色譜條件

Waters 1525 高效液相色譜儀(配2410示差折光檢測(cè)器和Empower工作站)；檢測(cè)柱為UltrahydrogelTMLinear (Φ7.8 mm×300.0 mm)；流動(dòng)相為0.1 mol/L NaNO3；柱溫30 ℃，流速0.9 mL/min，進(jìn)樣量20 μL。

1.3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

稱(chēng)取不同相對(duì)分子質(zhì)量的葡聚糖標(biāo)品50.0 mg于25 mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶解，定容；上樣前用0.45 μm濾膜過(guò)濾，以保留時(shí)間為橫坐標(biāo)，相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)曲。

1.3.3.3 樣品的測(cè)定

將淡紅側(cè)耳純化多糖用流動(dòng)相溶解，同上操作，將保留時(shí)間代入標(biāo)曲，計(jì)算相對(duì)分子質(zhì)量。

1.3.4 淡紅側(cè)耳多糖的單糖組成分析

1.3.4.1 高效液相色譜條件

LC-20AD島津高效液相色譜儀(配SPD-20A紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器和LC solution色譜數(shù)據(jù)工作站)；色譜柱：Thermo C18色譜柱(Φ4.6 mm×250.0 mm，5 μm)；流動(dòng)相：0.1 mol/L PBS (pH 6.7)和乙腈(體積比為83∶17)；柱溫30 ℃，流速0.7 mL/min，進(jìn)樣量20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm。

1.3.4.2 混合單糖標(biāo)品衍生化

分別稱(chēng)取10種單糖標(biāo)準(zhǔn)品各3.0 mg，溶解到1 mL去離子水中；分別取0、20、40、60、80、100 μL混合單糖標(biāo)品溶液，補(bǔ)水至100 μL，再加入100 μL NaOH溶液(0.6 mol/L)，混勻；取100 μL混合液，加入等體積的PMP-甲醇溶液(0.5 mol/L)，混勻，70 ℃水浴100 min，30 min后加入100 μL HCl (0.3 mol/L)中和，于50 ℃濃縮儀中旋干溶液；依次加入去離子水、氯仿各1 mL，混勻靜置分層后吸取水相，如此重復(fù)3次，最終水相用0.45 μm水系濾膜過(guò)濾后進(jìn)行高效液相色譜分析[13-14]。

1.3.4.3 樣品的測(cè)定

分別稱(chēng)取3.0 mg PDP-1、PDP-2-1和PDP-2-2，用去離子水配成3 mg/mL溶液；取100 μL多糖溶液，加100 μL TFA (4 mol/L)，于120 °C干燥箱中反應(yīng)2 h；冷卻后加入200 μL甲醇，于50 ℃濃縮儀中旋干，如此重復(fù)3次后，分別加100 μL去離子水進(jìn)行衍生化，0.45 μm水系濾膜過(guò)濾后進(jìn)行高效液相色譜分析。

1.3.5 理化性質(zhì)的測(cè)定

1.3.5.1 總糖含量

分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液(40 μg/mL)和1 mL多糖樣品溶液(0.05 mg/mL)，用去離子水補(bǔ)至2 mL；加入1 mL苯酚溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%)，搖勻后迅速加入5 mL濃硫酸，混勻，靜置20 min后，測(cè)A490。以葡萄糖質(zhì)量為橫坐標(biāo)，A490為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。將多糖樣品測(cè)得的吸光值帶入標(biāo)曲，進(jìn)而求得多糖樣品中的總糖含量[11]。

1.3.5.2 蛋白質(zhì)含量

分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液(100 μg/mL)和1 mL多糖樣品溶液(3 mg/mL)，用去離子水補(bǔ)至1 mL；加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250，搖勻后測(cè)A595。以牛血清白蛋白質(zhì)量為橫坐標(biāo)，A595為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。測(cè)得樣品吸光值，依據(jù)標(biāo)曲計(jì)算蛋白質(zhì)含量[15]。

1.3.5.3 糖醛酸含量

分別取0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 mL葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)液(200 μg/mL)和1 mL多糖樣品溶液(0.14 mg/mL)，用去離子水補(bǔ)至1 mL，加入5 mL四硼酸鈉-硫酸溶液(9.54 mg/mL)，混勻，沸水浴10 min，冷卻后加入0.2 mL咔唑-乙醇溶液(1.25 mg/mL)，混勻，沸水浴15 min，冷卻后測(cè)A530。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算多糖樣品中的糖醛酸含量[16]。

1.3.5.4 硫酸基含量

分別取0、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20 mL硫酸鉀標(biāo)準(zhǔn)液(0.6 mg/mL)，用1 mol/L鹽酸補(bǔ)至0.2 mL，加入3.8 mL TCA(30 g/L)；加1 mL氯化鋇-明膠溶液(5 g/L)混勻，記為A1，加1 mL明膠溶液(5 g/L)，記為A2；混勻后靜置20 min，測(cè)A360。取10.0 mg多糖樣品，溶于1 mL鹽酸(1 mol/L)，于100 ℃水解6 h，冷卻，50 ℃濃縮至干；加1 mL去離子水復(fù)溶，取0.2 mL復(fù)溶液同上處理。以硫酸鉀質(zhì)量為橫坐標(biāo)，A1、A2差值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。依據(jù)標(biāo)曲計(jì)算多糖樣品的硫酸基含量[17]。

1.3.6 淡紅側(cè)耳多糖的光譜分析

1.3.6.1 紫外光譜分析

分別將淡紅側(cè)耳粗多糖和純化多糖樣品配制成0.5 mg/mL的溶液，于200～400 nm進(jìn)行紫外-可見(jiàn)光譜掃描，觀(guān)察其在260～280 nm有無(wú)吸收峰[18]。

1.3.6.2 紅外光譜分析

取適量KBr于100 ℃干燥箱中烘干至恒重，稱(chēng)取100.0 mg干燥KBr，于瑪瑙研缽中研磨至細(xì)，用壓片機(jī)壓成透明薄片后用于空白實(shí)驗(yàn)基線(xiàn)校正；再分別稱(chēng)取1.0 mg多糖樣品與100.0 mg干燥KBr，充分研磨后壓成透明薄片，于4 000～400 cm-1進(jìn)行掃描[19]。

1.3.7 剛果紅實(shí)驗(yàn)分析

分別稱(chēng)取5.0 mg三種多糖組分，加入2 mL蒸餾水，充分溶解后加入2 mL剛果紅試劑(80 μmol/L)，混勻；依次加入0.44、1.00、1.70、2.70、4.00 mL NaOH溶液(1 mol/L)，NaOH最終為0、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mol/L。于紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)中，在200～800 nm掃描，測(cè)量各NaOH濃度下溶液的最大吸收波長(zhǎng)。不加多糖樣品，按相同方法測(cè)量空白條件下的最大吸收波長(zhǎng)[20]。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)3次取平均值，使用Origin 8.5作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 淡紅側(cè)耳粗多糖的分離純化

2.1.1 DEAE-纖維素-52層析柱純化

由圖1可知，淡紅側(cè)耳粗多糖經(jīng)DEAE-纖維素-52層析柱純化后得到4個(gè)組分，分別為去離子水洗脫的組分PDP-1，0.1 mol/L NaCl洗脫的2個(gè)組分PDP-2和PDP-3以及0.3 mol/L NaCl洗脫的組分PDP-4。組分PDP-4得率過(guò)低，不易于收集，由于時(shí)間有限，故只收集前3個(gè)組分繼續(xù)過(guò)Sephadex G-150層析柱。

圖1 淡紅側(cè)耳粗多糖經(jīng)DEAE-纖維素-52層析 柱純化的洗脫曲線(xiàn)Fig.1 Elution curve of crude Pleurotus djamor polysaccharides on DEAE-cellulos-52 column

2.1.2 Sephadex G-150層析柱純化

由圖2可知，PDP-1、PDP-2和PDP-3經(jīng)Sephadex G-150層析柱純化后各得到一個(gè)組分，即PDP-1-1、PDP-2-1和PDP-3-1。這3個(gè)組分都呈現(xiàn)單一對(duì)稱(chēng)峰，表明所得組分為較純多糖。分別收集這3個(gè)組分，50 ℃旋蒸濃縮，透析后真空冷凍干燥，得到白色絮狀的淡紅側(cè)耳多糖純品PDP-1-1、PDP-2-1和PDP-3-1。

2.2 淡紅側(cè)耳多糖的純度及相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

由圖3可知，淡紅側(cè)耳多糖純化組分PDP-1-1、PDP-2-1、PDP-3-1的高效液相色譜圖呈現(xiàn)單一對(duì)稱(chēng)峰，表明組分純度較高。三組分的保留時(shí)間分別為17.175、17.309、13.956 min，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算可得，三組分的相對(duì)分子質(zhì)量分別為：12.9、10.6、2 753.7 kDa。

2.3 淡紅側(cè)耳多糖的單糖組成分析

由圖4可知，單糖標(biāo)品的保留時(shí)間如下：甘露糖(tR=16.030 min)，核糖(tR=20.830 min)，鼠李糖 (tR=21.700 min)，葡萄糖醛酸(tR= 23.770 min)，半乳糖醛酸(tR= 26.570 min)，葡萄糖(tR=31.412 min)，半乳糖(tR=35.426 min)，木糖(tR=37.710 min)，阿拉伯糖(tR=38.623 min)，巖藻糖(tR=44.400 min)。純化組分PDP-1-1由甘露糖(tR=16.011 min)、葡萄糖(tR=31.403 min)、半乳糖(tR=35.413 min)、阿拉伯糖(tR=38.944 min)、巖藻糖(tR=44.131 min)5種單糖組成，各單糖物質(zhì)的量百分比分別為：4.79%、28.68%、47.59%、13.37%、5.57%；PDP-2-1由甘露糖(tR=16.155 min)、葡萄糖(tR= 31.424 min)、半乳糖(tR=35.179 min)、木糖(tR=37.611 min)、阿拉伯糖(tR=39.296 min)、巖藻糖(tR=43.819 min)6種單糖組成，各單糖物質(zhì)的量百分比分別為：6.43%、33.65%、36.17%、7.20%、9.88%、6.68%；PDP-3-1由甘露糖(tR=16.366 min)、葡萄糖(tR= 31.307 min)、半乳糖(tR=35.019 min)、巖藻糖(tR=44.501 min)4種單糖組成，各單糖物質(zhì)的量百分比分別為：4.12%、87.24%、3.90%、4.74%。

圖2 PDP-1、PDP-2、PDP-3經(jīng)Sephadex G-150層析柱純化的洗脫曲線(xiàn)Fig.2 Elution curve of PDP-1、PDP-2、PDP-3 on Sephadex G-150 column

圖3 淡紅側(cè)耳純化多糖的高效液相色譜圖Fig.3 HPLC of purified Pleurotus djamor polysaccharides

圖4 混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品及淡紅側(cè)耳純化多糖的高效液相色譜圖Fig.4 HPLC of mixed standard monosaccharide and purified Pleurotus djamor polysaccharides

2.4 理化性質(zhì)的測(cè)定

總糖含量、蛋白質(zhì)含量、糖醛酸含量、硫酸基含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)分別為：y=0.007 4x+0.001 3(R2=0.999 5)，y=0.003 5x-0.014 0(R2=0.998 4)，y=0.012 5x+0.023 1(R2=0.999 3)，y=0.001 7x-0.040 4(R2=0.999 6)。粗多糖及純化組分中總糖、蛋白質(zhì)、糖醛酸及硫酸基的具體含量見(jiàn)表1。由表1可知，與淡紅側(cè)耳粗多糖相比，純化組分PDP-1-1、PDP-2-1和PDP-3-1的總糖含量明顯增加；純化組分的蛋白質(zhì)含量減少，分別僅剩0.48%、0.79%、0.64%，這與紫外光譜分析結(jié)果一致；PDP-3-1的糖醛酸及硫酸基含量均高于粗多糖、PDP-1-1和PDP-2-1。有研究顯示糖醛酸和硫酸基含量與多糖的生物活性呈正相關(guān)，喬德亮[21]從三角帆蚌中純化出3種多糖組分HCPS-1、HCPS-2和HCPS-3，HCPS-3含有的糖醛酸和硫酸基均高于其他兩組分，生物活性分析結(jié)果表明HCPS-3比HCPS-1和HCPS-2具有較高的體外抗氧化活性和免疫增強(qiáng)活性。

表1 淡紅側(cè)耳粗多糖及純化多糖的理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of crude and purified Pleurotus djamor polysaccharides

2.5 淡紅側(cè)耳多糖的光譜分析

2.5.1 紫外光譜分析

由圖5可知，淡紅側(cè)耳粗多糖在260～280 nm有吸收峰，表明其含有蛋白質(zhì)和核酸；純化組分PDP-1-1、PDP-2-1和PDP-3-1在此處均無(wú)明顯吸收峰，表明這3種純化組分不含有或含有較少的蛋白質(zhì)和核酸等物質(zhì)，這與理化性質(zhì)測(cè)定結(jié)果一致。

圖5 淡紅側(cè)耳粗多糖及純化組分的紫外光譜圖Fig.5 Ultraviolet spectra of crude and purified Pleurotus djamor polysaccharides

2.5.2 紅外光譜分析

圖6 淡紅側(cè)耳多糖純化組分的紅外光譜圖Fig.6 Infrared spectra of purified Pleurotus djamor polysaccharides

2.6 剛果紅實(shí)驗(yàn)分析

剛果紅是一種酸性染料，可與具有三股螺旋結(jié)構(gòu)的物質(zhì)發(fā)生絡(luò)合作用，使溶液的最大吸收波長(zhǎng)增加。當(dāng)NaOH濃度較低時(shí)，溶液的最大吸收波長(zhǎng)由于絡(luò)合作用的發(fā)生而增大；NaOH濃度逐漸升高時(shí)，最大吸收波長(zhǎng)由于三股螺旋的解開(kāi)而減小。由圖7可知，純化組分PDP-1-1和PDP-3-1的最大吸收波長(zhǎng)先增加后減小，說(shuō)明其含有三股螺旋，而PDP-2-1的最大吸收波長(zhǎng)一直呈減小趨勢(shì)，說(shuō)明其不含三股螺旋結(jié)構(gòu)。

圖7 NaOH濃度對(duì)淡紅側(cè)耳純化多糖的影響Fig.7 Effect of NaOH concentration to purified Pleurotus djamor polysaccharides

3 結(jié)論

淡紅側(cè)耳粗多糖經(jīng)DEAE-纖維素-52和Sephadex G-150純化后共得到了3種組分PDP-1-1、PDP-2-1和PDP-3-1；采用高效凝膠過(guò)濾色譜法測(cè)定純度及相對(duì)分子質(zhì)量，可得三組分均為單一對(duì)稱(chēng)峰，說(shuō)明純化多糖的純度較高；采用柱前衍生高效液相色譜法測(cè)定單糖組成，可知PDP-1-1主要由半乳糖、葡萄糖和阿拉伯糖等5種單糖組成，PDP-2-1主要由半乳糖和葡萄糖等6種單糖組成，PDP-3-1由葡萄糖和巖藻糖等4種單糖組成；紫外掃描和理化性質(zhì)測(cè)定結(jié)果均表明3種純化多糖含有極少量的蛋白質(zhì)和較高的糖醛酸；紅外掃描結(jié)果顯示三組分均為吡喃糖，PDP-1-1和PDP-2-1以β-型糖苷鍵連接；剛果紅結(jié)果顯示PDP-1-1和PDP-3-1具有三股螺旋結(jié)構(gòu)而PDP-2-1不具有三股螺旋結(jié)構(gòu)。

多糖的結(jié)構(gòu)與其生物活性密切相關(guān)，對(duì)多糖結(jié)構(gòu)的深入研究，可推動(dòng)多糖類(lèi)新藥的開(kāi)發(fā)。目前對(duì)淡紅側(cè)耳多糖結(jié)構(gòu)的解析只涉及特征官能團(tuán)和單糖組成方面，為進(jìn)一步了解糖苷鍵構(gòu)型及單糖殘基的連接方式等，還需進(jìn)行甲基化和核磁共振分析，以期為其生物活性和構(gòu)效間關(guān)系研究提供理論依據(jù)。