沙小梅，肖萬榕，葉云花，涂宗財(cái),3*，危紫徽，潘鳳濤，潘海艷，張露，劉堯，季中春

1(江西師范大學(xué) 功能有機(jī)小分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室&生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌，330022) 2(江西師范大學(xué) 體育學(xué)院，江西 南昌，330022) 3(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌，330047) 4(鹽城市怡美食品有限公司，江蘇 鹽城，224300)

魚骨富含鈣、磷和蛋白質(zhì)等成分，營養(yǎng)價(jià)值十分豐富[1]，添加于食品中，可以增加食品的營養(yǎng)價(jià)值[2]。對魚骨進(jìn)行超微細(xì)化加工是促進(jìn)魚骨和食品基質(zhì)有機(jī)融合，提升魚骨利用價(jià)值的有效手段，目前，對魚骨進(jìn)行超微細(xì)化的技術(shù)主要有球磨法[3-4]、酶法結(jié)合超微粉碎技術(shù)[5]等。課題組前期運(yùn)用亞臨界水技術(shù)實(shí)現(xiàn)了鰱魚魚骨的軟化[6]，若能進(jìn)一步對軟化后鰱魚魚骨進(jìn)行超微細(xì)化處理，將有望拓展魚骨的用途。

動態(tài)高壓微射流(dynamichighpressuremicrofluidization,DHPM)作為一種集輸送、混合、超微粉碎、加壓、膨化等多種單元操作于一體的新興動態(tài)高壓均質(zhì)技術(shù)[7]，其處理?xiàng)l件(如高速剪切、壓力梯度、高速沖撞等)十分劇烈，易導(dǎo)致大分子聚合物發(fā)生降解[8-10]。DHPM處理能有效地改善蛋白質(zhì)的溶解性、穩(wěn)定性、起泡性、乳化性和致敏性[11]等，同時(shí)改變蛋白質(zhì)和酶的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象[12]；DHPM處理能改變淀粉的凝膠硬度、彈性、內(nèi)聚性、膠著性和咀嚼性等[13]，并且能使非淀粉多糖分子降解，改變其表觀黏度、凝膠性能、吸水性、持水性、流動性、粒徑等性質(zhì)[14]。目前運(yùn)用DHPM超微細(xì)化鰱魚魚骨的研究還較少。

本文以亞臨界水處理后的魚骨為原料，利用DHPM不同壓力和次數(shù)處理，研究DHPM處理對鰱魚魚骨粒度分布、微觀結(jié)構(gòu)、表面疏水性、游離氨基含量和鈣離子溶出量的影響，為魚骨的超微細(xì)化提供依據(jù)，為魚骨的精深加工提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

鰱魚魚骨，購自洪湖市井力水產(chǎn)食品股份有限公司；其他試劑均屬于分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

M-7125型動態(tài)高壓微射流設(shè)備，美國Microfluidics公司；BioTek Synergy H1全功能酶標(biāo)儀，美國BioTek儀器有限公司；BT-9300HT激光粒度分布儀，遼寧丹東百特儀器有限公司；S-3400N掃描電子顯微鏡，日本日立(HITACHI)有限公司；YXQ-LS-100SII立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 魚骨的預(yù)處理

將冷凍的鰱魚魚骨置于室溫約25 ℃下解凍，用沸水加熱1 min，將魚骨表面殘存的魚肉和膜性組織剔除，經(jīng)蒸餾水沖洗干凈后，置于37 ℃的烘箱中烘12 h，用自封袋封好放入-20 ℃冰箱中備用。

1.2.2 魚骨的軟化

根據(jù)課題組前期研究結(jié)果，采用亞臨界水技術(shù)結(jié)合醋酸軟化鰱魚魚骨[6]，即將魚骨與0.9 mg/L醋酸以料液比1∶25(g∶mL)混合，采用亞臨界水處理，溫度設(shè)定為124 ℃，時(shí)間設(shè)定為1.5 h。

1.2.3 DHPM對魚骨進(jìn)行超微細(xì)化處理

(1)將軟化后魚骨先經(jīng)過膠體磨和均質(zhì)機(jī)預(yù)處理，再分別進(jìn)行0、40、60、80、100、120 MPa的DHPM處理3次，研究不同的DHPM壓力對亞臨界水處理后魚骨細(xì)化效果的影響。

(2)將軟化后魚骨先經(jīng)過膠體磨和均質(zhì)機(jī)預(yù)處理，再于100 MPa的DHPM壓力下分別處理0、1、3、5、7次，研究不同的DHPM處理次數(shù)對亞臨界水處理后魚骨細(xì)化效果的影響。

1.2.4 魚骨粒度的測定

用蒸餾水將魚骨配制為1.0 mg/mL的溶液，采用納米激光粒度儀測定魚骨在溶液中的粒度分布[15]。以魚骨樣品的數(shù)量百分比為橫坐標(biāo)，粒徑為縱坐標(biāo)繪制曲線，研究DHPM處理對魚骨粒度分布的影響。

1.2.5 微觀結(jié)構(gòu)

將DHPM處理后的魚骨溶液凍干成魚骨粉，將魚骨粉樣品置于樣品臺的導(dǎo)電雙面膠上，采用掃描電鏡在低真空模式下放大5 000倍拍攝魚骨粉的微觀結(jié)構(gòu)[16]。

1.2.6 表面疏水性

采用ANS熒光探針法測定不同DHPM處理?xiàng)l件下魚骨粉表面疏水性的變化[17]。采用超純水溶解凍干過后的魚骨粉得到系列濃度的魚骨樣品溶液，取4 mL樣品溶液與20 μL 8 mmol/L ANS溶液(0.01 mol/L，pH 8.0)混合后，測定其熒光強(qiáng)度。測定條件：激發(fā)波長為370 nm，發(fā)射波長為400～600 nm，掃描速度為2 400 nm/min，激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均為5 nm，電壓為400 V。以魚骨粉濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖，采用線性回歸分析進(jìn)行曲線擬合，曲線的斜率即為魚骨粉的表面疏水性(H0)。

1.2.7 魚骨中鈣含量的測定

將DHPM處理的魚骨溶液離心取上清液后，用蒸餾水稀釋一定倍數(shù)，加入3 mL三乙醇胺和5 mL氨性溶液，然后滴入2滴鉻黑T指示劑，最后以0.02 mol/L的EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，當(dāng)溶液由酒紅色變成藍(lán)色即為滴定終點(diǎn)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)回歸方程求解溶液中的鈣離子含量，平行測量3次[18]。

1.2.8 魚骨中游離氨基含量的測定

參考SERPEN等[19]的方法并稍作修改，魚骨中游離氨基的含量采用OPA法測定。準(zhǔn)確稱取40.0 mg的OPA溶解于1.0 mL甲醇中，再加入200 g/L的十二烷基硫酸(SDS) 2.5 mL、硼砂(0.1 mol/L) 25.0 mL和β-巰基乙醇100 μL，最后用蒸餾水定容到 50 mL，即為OPA試劑，此試劑要現(xiàn)配現(xiàn)用。測定時(shí)，將DHPM處理的魚骨溶液離心取上清液作為樣品待用，取1.0 mL OPA試劑于試管中，加入50 μL樣品，混合均勻，放入35 ℃水浴中反應(yīng)2 min后在340 nm下測吸光度(A340nm)，另取1.0 mL OPA試劑于試管中，加入50 μL水作為空白對照。用相同的方法，以甘氨酸代替樣品作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)曲線計(jì)算樣品中游離氨基的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 DHPM處理對魚骨粒度分布的影響

DHPM處理對魚骨粒度分布的影響如圖1所示，結(jié)果表明，不同DHPM處理壓力和處理次數(shù)都能顯著地減小魚骨的粒徑。經(jīng)0、40、60、80、100和120 MPa的DHPM處理后，魚骨的D97(即魚骨顆粒累計(jì)粒度分布百分?jǐn)?shù)達(dá)到97%時(shí)所對應(yīng)的粒徑)分別為88.39、39.07、34.8、27.19、24.71和25.89 μm。經(jīng)DHPM處理0、1、3、5和7次后，魚骨的D97分別為88.39、33.7、24.71、24.69和25.39 μm。由圖1-A可知，魚骨的粒徑隨DHPM處理壓力的增大而減小，當(dāng)壓力增加到100 MPa時(shí)，粒徑達(dá)到最小，降低至未經(jīng)DHPM處理時(shí)魚骨顆粒D97的28%。而后，隨著壓力的增大，120 MPa的DHPM處理后魚骨顆粒的D97有所增大。這表明DHPM處理過程中的強(qiáng)力剪切，高速沖擊和高頻振動等作用能有效降低魚骨顆粒的大小，然而，當(dāng)DHPM處理壓力為120 MPa時(shí)，魚骨顆?？赡茉诜兜氯A力、靜電相互作用力等影響下重新聚集，導(dǎo)致魚骨粒徑稍有增加。這一結(jié)果與DHPM處理后玉米淀粉[20]、乳清蛋白[21]、大豆膳食纖維[22]等粒徑變化結(jié)果相一致。由圖1-B可知，當(dāng)DHPM處理壓力不變(100 MPa)，魚骨的粒徑隨DHPM處理次數(shù)的增加而減小，當(dāng)處理次數(shù)為3～5次時(shí)粒徑達(dá)到最小。隨著DHPM處理次數(shù)的進(jìn)一步增加，魚骨的粒徑呈現(xiàn)出小幅度增大趨勢，當(dāng)處理次數(shù)為7次時(shí)D97為25.39 μm，可能是因?yàn)檫^度的處理在一定程度上促使魚骨分子間發(fā)生聚集，高頻的聚集現(xiàn)象和極高的能量密度使魚骨顆粒產(chǎn)生了“過處理現(xiàn)象”[23]。

A-DHPM處理壓力對魚骨粒度分布的影響； B-DHPM處理次數(shù)對魚骨粒度分布的影響圖1 DHPM處理對魚骨粒度分布的影響Fig.1 The effect of DHPM on particle size distribution of fish bone

2.2 DHPM處理對魚骨微觀結(jié)構(gòu)的影響

DHPM處理對魚骨微觀結(jié)構(gòu)的影響如圖2、圖3所示。結(jié)果表明，DHPM處理能有效細(xì)化鰱魚魚骨。圖2為不同DHPM壓力處理后魚骨的掃描電鏡圖，未經(jīng)處理的魚骨樣品為薄片狀。DHPM處理后，魚骨的整體結(jié)構(gòu)被破壞，伴隨著顆粒狀碎片的出現(xiàn)。隨著DHPM處理壓力的增加，碎片顆粒的粒徑逐漸減小。當(dāng)DHPM處理壓力為80～100 MPa時(shí)，魚骨的顆粒最多、粒徑最小。然而，100 MPa DHPM處理后的魚骨部分碎片顆粒呈現(xiàn)聚集現(xiàn)象。這與鐘俊楨等[24]所研究的動態(tài)高壓微射流對β-乳球蛋白微觀結(jié)構(gòu)的影響有相似之處：隨著DHPM處理壓力的逐漸增大，β-乳球蛋白分子被逐漸打散，大部分顆粒逐漸變細(xì)，然而有小部分β-乳球蛋白分子在經(jīng)過100 MPa處理后，發(fā)生了部分團(tuán)聚現(xiàn)象。當(dāng)處理壓力為120 MPa時(shí)，聚集現(xiàn)象明顯增加，大部分顆粒粘連在一起，團(tuán)聚成片狀。這與納米激光粒度儀檢測溶液中魚骨粒度分布的結(jié)果一致。

圖3為不同次數(shù)DHPM處理后魚骨的掃描電鏡圖，由圖可知，未經(jīng)處理的魚骨樣品微觀結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出片狀薄片。隨著DHPM處理次數(shù)的增加，魚骨的片狀微觀結(jié)構(gòu)被破壞，魚骨碎片顆粒的粒徑先減小后增大。當(dāng)DHPM處理次數(shù)為3次時(shí)，魚骨顆粒的外觀形貌最小。然而，當(dāng)DHPM處理次數(shù)為5～7次時(shí)，魚骨表面出現(xiàn)典型的聚集現(xiàn)象，魚骨顆粒間已發(fā)生明顯粘連和團(tuán)聚，即出現(xiàn)“過處理現(xiàn)象”[23]。

A-0 MPa; B-40 MPa; C-60 MPa; D-80 MPa; E-100 MPa; F-120 MPa圖2 不同壓力DHPM處理后魚骨的掃描電鏡圖Fig.2 The scanning electron microscope photographs of fish bone treated by DHPM with different pressures

A-0次;B-1次;C-3次;D-5次;E-7次圖3 不同次數(shù)DHPM處理后魚骨的掃描電鏡圖Fig.3 The scanning electron microscope photographs of fish bone treated by DHPM with different times

2.3 DHPM處理對魚骨表面疏水性的影響

魚骨中的蛋白質(zhì)大多數(shù)為Ⅰ型膠原蛋白，其空間結(jié)構(gòu)會影響表面疏水性[25]。DHPM處理能改變蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)發(fā)生去折疊[26]，因此，本文進(jìn)一步研究了DHPM處理對魚骨表面疏水性的影響，結(jié)果如圖4所示。隨著DHPM處理壓力的增加，魚骨表面疏水性先增加后降低(p<0.05)，在40 MPa時(shí)達(dá)到最大值。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是DHPM處理使魚骨中蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，破壞了其內(nèi)部的疏水相互作用，使疏水基團(tuán)暴露，從而大大提高了魚骨的表面疏水性。而經(jīng)過60～80 MPa的DHPM處理后，由于魚骨顆粒的分散，分子間的親水區(qū)域被暴露，導(dǎo)致表面疏水性的下降[27]。之后隨處理壓力增大，魚骨顆粒的聚集可能導(dǎo)致部分蛋白質(zhì)分子聚集，疏水基團(tuán)被掩蔽，使其表面疏水性再次降低。這一現(xiàn)象與遲玉杰等[28]所研究的動態(tài)高壓微射流對蛋清蛋白表面疏水性的影響相似。由圖4-B可知，DHPM處理壓力不變(100 MPa)時(shí)，處理次數(shù)的不同對魚骨表面疏水性會產(chǎn)生不同的影響。當(dāng)處理次數(shù)為1次時(shí)，其表面疏水性高于未經(jīng)處理的魚骨樣品(p<0.05)，SHEN等[29]研究表明，DHPM處理能使蛋白質(zhì)發(fā)生去折疊、暴露內(nèi)部疏水基團(tuán)，從而提高表面疏水性。而隨處理次數(shù)的增加，魚骨表面疏水性均低于未經(jīng)處理的樣品?？赡艿脑蚴请S處理次數(shù)的增加，蛋白質(zhì)將會聚集，其內(nèi)部疏水基團(tuán)被掩蔽[28]，導(dǎo)致疏水性低于未經(jīng)處理的魚骨樣品(p<0.05)。

A-不同處理壓力對魚骨表面疏水性的影響； B-不同處理次數(shù)對魚骨表面疏水性的影響圖4 DHPM處理對魚骨表面疏水性的影響Fig.4 The effect of DHPM treatment on the surface hydrophobicity of fish bone

2.4 DHPM處理對魚骨鈣離子含量的影響

DHPM處理對魚骨鈣離子含量的影響如圖5所示。由圖5-A可知，魚骨中鈣離子含量隨DHPM處理壓力的增加，整體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，并在處理壓力為80 MPa時(shí)，魚骨中鈣離子含量達(dá)到最大值。原因可能是繼亞臨界水處理后，40～80 MPa的DHPM處理進(jìn)一步破壞了魚骨內(nèi)部膠原纖維的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和羥基磷灰石結(jié)晶的結(jié)構(gòu)，有利于鈣離子更大程度地析出[30]。而當(dāng)壓力高于80 MPa時(shí)，過高的壓力使得魚骨部分碎片顆粒呈現(xiàn)聚集現(xiàn)象，導(dǎo)致魚骨內(nèi)部結(jié)構(gòu)變得更加緊湊，不利于鈣離子的析出，從而使鈣離子含量降低。DHPM處理次數(shù)對魚骨中鈣離子溶出量的影響如圖5-B所示，當(dāng)DHPM處理次數(shù)為1次時(shí)，魚骨中鈣離子溶出量較對照組稍有降低，但變化程度不大。隨著DHPM處理次數(shù)的增加，魚骨中鈣離子溶出量增加，然而DHPM處理3、5和7次的魚骨鈣離子溶出量無顯著性變化。可能是由于多次的DHPM處理已使魚骨顆粒與水分子發(fā)生充分接觸，因而鈣離子溶出量呈現(xiàn)出穩(wěn)定值。

A-不同處理壓力對魚骨鈣離子含量的影響； B-不同處理次數(shù)對魚骨鈣離子含量的影響圖5 DHPM處理對魚骨鈣離子含量的影響Fig.5 The effect of DHPM treatment on the calcium ion content of fish bone

2.5 DHPM處理對魚骨游離氨基含量的影響

DHPM處理對魚骨游離氨基含量的影響如圖6所示。魚骨經(jīng)不同處理壓力和次數(shù)的DHPM處理后，游離氨基含量均有所降低。由圖6-A可知，當(dāng)DHPM處理壓力從40 MPa增加到60 MPa時(shí)，可能由于魚骨顆粒的分散，蛋白質(zhì)分子擺脫束縛，游離氨基含量呈現(xiàn)出增加的趨勢(p<0.05)。然而，隨著壓力的進(jìn)一步增加，魚骨中蛋白質(zhì)分子發(fā)生去折疊，部分游離氨基被包裹，導(dǎo)致游離氨基含量表現(xiàn)出降低的趨勢[31](p<0.05)。DHPM處理壓力達(dá)到120 MPa時(shí)，游離氨基含量有所上升，據(jù)郭麗萍利用超高壓結(jié)合熱處理對豬肉蛋白的研究可知，壓力可以穩(wěn)定氫鍵，使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定，而靜電相互作用和疏水相互作用在壓力的作用下被削弱，可導(dǎo)致蛋白質(zhì)有序結(jié)構(gòu)的減少，無序結(jié)構(gòu)增多[32]，這一現(xiàn)象會引起游離氨基含量的上升。由圖6-B可知，魚骨游離氨基含量隨DHPM處理次數(shù)的增加呈現(xiàn)出先降低后增加的趨勢(p<0.05)，并在處理次數(shù)達(dá)到5次時(shí)，游離氨基含量達(dá)到最低。出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因可能是DHPM處理次數(shù)的增加導(dǎo)致魚骨顆粒聚集，部分游離氨基被包裹，使其含量降低，之后當(dāng)處理次數(shù)達(dá)到7次時(shí)，靜電相互作用和疏水相互作用在壓力的作用下被削弱，使蛋白質(zhì)有序結(jié)構(gòu)減少，無序結(jié)構(gòu)增多[32]，導(dǎo)致游離氨基含量再次增加。

A-不同處理壓力對魚骨游離氨基含量的影響； B-不同處理次數(shù)對魚骨游離氨基含量的影響圖6 DHPM處理對魚骨游離氨基含量的影響Fig36 The effect of DHPM treatment on the calcium ion content of fish bone

3 結(jié)論

本文研究了DHPM處理對魚骨超微細(xì)化后理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)的影響。研究結(jié)果表明：隨著處理壓力和處理次數(shù)的增大，魚骨粒徑明顯減小。當(dāng)DHPM處理壓力為100 MPa、處理次數(shù)為3～5次時(shí)，粒徑達(dá)到最小。掃描電鏡圖像顯示魚骨經(jīng)DHPM處理后，其表面形貌發(fā)生改變，片狀結(jié)構(gòu)被破壞形成小顆粒，繼而出現(xiàn)凝聚現(xiàn)象。DHPM處理能顯著改變魚骨的表面疏水性和鈣離子含量。經(jīng)80 MPa的DHPM處理3次后，魚骨鈣離子含量達(dá)到最大值；經(jīng)40 MPa的DHPM處理3次后，魚骨表面疏水性達(dá)到最大值。經(jīng)不同處理壓力和次數(shù)的DHPM處理后，魚骨游離氨基含量均有所降低。當(dāng)DHPM處理壓力為100 MPa、處理次數(shù)為5次時(shí)，游離氨基含量達(dá)到最低。上述結(jié)果表明DHPM處理能有效降低魚骨的粒度，影響魚骨的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)。