蘇冬娜， 吳詩品

(暨南大學(xué) 第二臨床醫(yī)學(xué)院∥深圳市人民醫(yī)院 感染內(nèi)科， 廣東 深圳 518020)

肝硬化是各種慢性肝病發(fā)展的晚期階段，具有發(fā)病率高、治療效果差及死亡率高的特點，我國是肝硬化高發(fā)病率國家，研究肝硬化的治療方法十分迫切.肝纖維化(hepatic fibrosis, HF)是慢性肝病進展至肝硬化的重要階段，其主要特點是細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的沉積[1-2].降解是治療肝纖維化的主要思路.肝纖維化是可逆的，但是肝硬化是不可逆的，加上肝硬化的治療效果很差，所以對逆轉(zhuǎn)纖維化潛在機制的研究具有極其重要的意義.

TGF-β基因家族在細胞的增殖、分化和免疫等方面起重要作用，能夠促進肝星狀細胞轉(zhuǎn)化為成纖維細胞，在損傷部位產(chǎn)生大量的細胞外基質(zhì)[3].TGF-β/Smad途徑是TGF-β發(fā)揮作用的主要途徑，在肝星狀細胞向肝纖維化的轉(zhuǎn)化過程中起關(guān)鍵作用[4].ECM的降解主要依靠蛋白酶水解，基質(zhì)金屬蛋白酶MMP家族就是其中比較重要的蛋白酶.近年來研究發(fā)現(xiàn)肝星狀細胞能夠分泌MMP-1、基質(zhì)金屬蛋白酶的抑制物TIMP-1[5-6]，所以MMP-1/TIMP-1系統(tǒng)的平衡對細胞外基質(zhì)ECM的降解影響較大，但是相關(guān)研究較少.在前期的研究中，發(fā)現(xiàn)Smad7修飾的骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)能夠在體內(nèi)減弱肝纖維化的發(fā)生[7]，在體外影響肝星狀細胞中TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過促進星狀細胞的凋亡對抗肝纖維化[8].本研究旨在探究Smad7修飾的BMSCs對肝星狀細胞中Smads信號與MMP-1/TIMP-1系統(tǒng)的影響，以揭示Smad7修飾的BMSCs對細胞外基質(zhì)ECM的降解逆轉(zhuǎn)肝纖維化的潛在機制.

1 材料與方法

1.1 主要試劑

Smad7基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細胞由本實驗室構(gòu)建保存；肝星狀細胞系HSC-T6購自中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)及胰蛋白酶購自美國Thermo公司；質(zhì)粒提取試劑盒、Trizol試劑均購自美國Thermo公司；熒光定量試劑盒One Step SYBR? PrimeScriptTMRT-PCR Kit購自大連寶生物有限公司；一抗Smad7、Smad3、p-Smad3、MMP-1、TIMP-1、Col1及GAPDH及HRP標記的二抗均購自美國Abcam公司;四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自碧云天生物科技公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 HSC-T6細胞培養(yǎng)和傳代

從液氮中取出HSC-T6細胞株迅速復(fù)蘇后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中(1×105/mL)，用質(zhì)量分數(shù)為10% 胎牛血清、1% 青霉素和鏈霉素混合液的DMEM 培養(yǎng)基于體積分數(shù)為5% CO2、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng).當細胞生長接近于90%，用質(zhì)量分數(shù)為0.25%的胰蛋白酶消化細胞，進行傳代.

1.2.2 Smad7-BMSCs處理肝星狀細胞

取生長狀態(tài)良好的肝星狀細胞HSC-T6接種到6孔板，每孔細胞密度為1×106.試驗分成A組和B組，待細胞融合至70%時，每組分別加入Smad7-BMSCs(1×104/mL)和同體積的PBS進行培養(yǎng)[9].

1.2.3 ELISA檢測HSC-T6合成的Ⅰ型膠原Col1及透明質(zhì)酸酶HA的表達

細胞處理72 h后，用ELISA檢測試劑盒檢測培養(yǎng)液中Ⅰ型膠原Col1及透明質(zhì)酸酶HA的表達.

1.2.4 MTT檢測肝星狀細胞HSC-T6增殖

將HSC-T6細胞按照毎孔1×106的密度接種到24孔板中，待孔內(nèi)的細胞密度達到80%左右.分別加入Smad7-BMSCs(1×104/mL)和同體積的PBS進行培養(yǎng).培養(yǎng)72 h后，每孔分別加入質(zhì)量濃度5 μg/μL的MTT溶液，置于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h后加入DMSO終止，采用酶標儀在490 nm的波長下測定各孔內(nèi)吸光度值，以空白為對照判斷各孔內(nèi)細胞的增殖情況.

1.2.5 總RNA的提取及cDNA合成

細胞處理72 h后，向毎孔細胞中加入1 mL Trizol試劑進行裂解，將裂解液轉(zhuǎn)移至干凈的EP管中，加入200 μL氯仿用力震蕩15 s后室溫放置10 min，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min. 吸取上層水相至新EP管，加入500 μL異丙醇，室溫放置10 min，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，棄上清，可見白色RNA沉淀.用預(yù)冷的體積分數(shù)為75%乙醇洗滌，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，棄上清液；重復(fù)2次.自然晾干，DEPC水溶解RNA.cDNA合成使用TAKARA的One Step PrimeScript Cdna Synthesis Kit按照說明書進行逆轉(zhuǎn)錄PCR.

1.2.6 熒光定量PCR實驗

RT-qPCR使用的One Step SYBR? PrimeScriptTMRT-PCR Kit(taraka)按照說明書在ABI 7300 Real-Time PCR System 儀器上進行(引物列表見表1)，反應(yīng)的程序如下：95 ℃ 30 s；40個循環(huán)的95 ℃ 5 s及 60 ℃ 30 s.樣品中目標基因的表達使用GAPDH作為內(nèi)參，定量結(jié)果采用2-ΔΔCt表示.

表1 引物序列表Table 1 Primer sequence

1.2.7 Western blot檢測

待轉(zhuǎn)細胞處理72 h后，向毎孔細胞中加入200 μL蛋白裂解液(已添加蛋白酶抑制劑)，冰上裂解30 min后，將裂解液轉(zhuǎn)入EP管中12 000 r/min離心10 min，取上清用BCA法測定蛋白濃度.每組取等量的蛋白樣品，加入SDS上樣緩沖液混勻后于煮沸10 min使蛋白變性.然后進行常規(guī)SDS-PAGE凝膠電泳，采用濕轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜.經(jīng)過質(zhì)量分數(shù)為5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h，4 ℃過夜孵育一抗(稀釋體積比為1∶1 000).第2天室溫孵育二抗1 h， TBST洗滌3次后用ECL化學(xué)發(fā)光顯色液進行顯色，并采用凝膠成像設(shè)備進行結(jié)果觀察并拍照.最終結(jié)果表示為目標條帶與內(nèi)參GAPDH的光密度比值.

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Smad7修飾的BMSCs降低肝星狀細胞HSC-T6的Ⅰ型膠原Col1與透明質(zhì)酸酶HA的表達

通過ELISA法檢測結(jié)果顯示，與對照組相比Smad7修飾的BMSCs處理組細胞培養(yǎng)液中Col1與HA的表達量顯著降低(P<0.05，圖1).

2.2 Smad7修飾的BMSCs抑制肝星狀細胞HSC-T6的增殖

為了探究通過Smad7修飾的BMSCs抑制肝星狀細胞HSC-T6增殖的影響，通過MTT法檢測Smad7修飾的BMSCs與HSC-T6細胞共培養(yǎng)24、48、72 h后細胞的增殖情況.結(jié)果顯示，與對照組相比Smad7修飾的BMSCs處理組顯著抑制細胞增殖(P<0.05，圖2).

2.3 Smad7修飾的BMSCs對肝星狀細胞HSC-T6中Smad2/3表達的影響

為了探究通過Smad7修飾的BMSCs對肝星狀細胞HSC-T6中Smad3表達的影響，Smad7修飾的BMSCs與HSC-T6細胞共培養(yǎng)72 h后，提取細胞中總RNA和總蛋白.通過定量PCR檢測細胞中Smad7、Smad3的表達；Western blot檢測細胞中Smad7、Smad3、p-Smad3蛋白的表達水平.結(jié)果顯示，與對照組相比Smad7修飾的BMSCs處理組細胞中Smad7表達顯著增加(P<0.05)，而Smad3的mRNA與蛋白表達沒有顯著性變化(P>0.05)，但是p-Smad3蛋白的表達量顯著降低(P<0.05,圖3).

1)P<0.05; A：細胞培養(yǎng)液中Col1含量；B：細胞培養(yǎng)液中HA的含量.

1)P<0.01

Fig.2 The effect of smad7 modified BMSCs on the proliferation of HSC-T6 cells

1)P<0.01， 2)P>0.05.

2.4 Smad7修飾的BMSCs對肝星狀細胞HSC-T6中MMP-1/TIMP-1系統(tǒng)的影響

為了探究通過Smad7修飾的BMSCs對肝星狀細胞HSC-T6中相關(guān)因子表達的影響， Smad7修飾的BMSCs與HSC-T6細胞共培養(yǎng)72 h后，提取細胞中總RNA和總蛋白.通過定量PCR檢測細胞中Smad7、MMP-1、TIMP-1、 Col1的表達；Western blot檢測細胞中MMP-1、TIMP-1、Col1蛋白的表達水平.結(jié)果顯示，對于對照組相比Smad7修飾的BMSCs處理組Smad7、MMP-1表達顯著增加(P<0.01)，而TIMP-1、 Col1的表達則顯著降低(P<0.01，圖4).

1)P<0.01

3 討論

肝纖維化是肝臟遭受損傷以后的一種自我恢復(fù)反應(yīng)，細胞外基質(zhì)ECM的過度合成和沉積是肝纖維化的主要特征之一.研究發(fā)現(xiàn)肝星狀細胞是肝臟分泌細胞外基質(zhì)ECM 的主要場所，而肝星狀細胞的激活是肝纖維化形成的重要環(huán)節(jié)[10].當機體處于正常狀態(tài)時，肝星狀細胞處于靜息狀態(tài)，僅合成少量膠原；當肝臟發(fā)生病變的情況下，肝星狀細胞被激活，分泌大量的Col1使ECM降解受到抑制從而引發(fā)肝纖維化.肝細胞中Col1主要在肝星狀細胞中表達，因此抑制星狀細胞中Col1的表達，對肝纖維化的治療具有重要意義.

骨髓間充質(zhì)干細胞BMSCs是一種多能干細胞，能夠分化為多種器官組織參與機體的多項功能調(diào)節(jié)[11].近年來，研究顯示BMSCs能夠一定程度的保護肝功能衰竭、改善肝衰竭大鼠的免疫功能和肝組織炎性反應(yīng)壞死狀態(tài)，促進肝功能的恢復(fù)[12].Smads是TGF-β信號通路中的關(guān)鍵因子，Smad7與Smad3參與TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并且Smad7是改信號通路中的重要負向調(diào)節(jié)因子，Smad7表達上調(diào)會阻止Smad2/3磷酸化，從而抑制TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[13].研究顯示TGF-β/Smad信號能夠促進肝星狀細胞的增殖與細胞外基質(zhì)ECM的沉積與合成[14].本研究通過ELISA檢測細胞培養(yǎng)液發(fā)現(xiàn)Smad7修飾的BMSCs能夠抑制肝星狀細胞增殖，降低肝星狀細胞分泌的一型膠原和透明脂酸；另外，Smad7修飾的BMSCs能夠抑制細胞中Smad3蛋白的磷酸化.說明Smad7-BMSCs可能通過下調(diào)Smad3蛋白的磷酸化從而抑制TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，降低肝星狀細胞分泌的Col1和透明脂酸HA進而減少細胞外基質(zhì)ECM的積累.

基質(zhì)金屬蛋白酶MMP及其抑制劑TIMP在細胞外基質(zhì)ECM的降解過程中起著重要的作用.MMP與TIMP的活性呈負相關(guān)，與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān).研究發(fā)現(xiàn)，TIMP能夠抑制MMP，而MMP能夠降解細胞外基質(zhì)ECM.所以MMP/TIMP系統(tǒng)的平衡對細胞外基質(zhì)的沉積與降解甚至對肝纖維化的進程起著極其重要的作用[15].本研究發(fā)現(xiàn)Smad7修飾的BMSCs能夠促進細胞中MMP-1的表達，而抑制TIMP-1與Col1的表達.說明Smad7-BMSCs可能通過影響肝星狀細胞中MMP-1/TIMP-1系統(tǒng)的平衡來影響細胞外基質(zhì)的沉積.有研究發(fā)現(xiàn)TGF-β信號能夠上調(diào)TIMP的表達從而抑制細胞外基質(zhì)ECM的降解.所以，Smad7修飾的BMSCs可能通過TGF-β中Smads蛋白的磷酸化影響肝星狀細胞中MMP/TIMP系統(tǒng)的平衡進而影響肝纖維化的進程.

綜上所述，本研究證實了Smad7修飾的BMSCs能夠降低肝星狀細胞中Smad3蛋白的磷酸化，增加MMP/TIMP的比值、抑制細胞分泌膠原蛋白與透明質(zhì)酸促進ECM的降解從而緩解肝纖維化.揭示Smad7修飾的BMSCs抗肝纖維化的潛在機制，為肝纖維化的治療提供理論基礎(chǔ).