劉 歡， 周 欣， 王 意， 賀小賢

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)是一種條件性致病菌，主要分布于世界各地的水體環(huán)境中，是多種經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚(yú)類、蝦類和貝類的病原菌，給海水養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1,2].此外，溶藻弧菌還是一種人-畜共患菌，在人體接觸含有溶藻弧菌的水體時(shí)，可以通過(guò)創(chuàng)傷面或者耳朵等途徑感染人體，導(dǎo)致創(chuàng)傷面感染以及中耳炎等病癥的發(fā)生；還可經(jīng)由食用受污染的水產(chǎn)品而引起腸胃炎的發(fā)生.而傳統(tǒng)的抗生素防治易產(chǎn)生耐藥性導(dǎo)致超級(jí)細(xì)菌的產(chǎn)生,同時(shí)會(huì)因藥物殘留而對(duì)人體造成危害,因此,開(kāi)發(fā)綠色安全的新型防治手段迫在眉睫,而這就需要深入研究溶藻弧菌的毒力和致病性分子調(diào)控機(jī)理.

溶藻弧菌現(xiàn)已鑒定的主要毒力因子為胞外蛋白酶，另外還發(fā)現(xiàn)其運(yùn)動(dòng)性、生物被膜、鐵載體等也與毒力和致病性緊密相關(guān).而關(guān)于溶藻弧菌毒力調(diào)控機(jī)制的研究則主要集中在群體感應(yīng)系統(tǒng)(Quorum sensing,QS)和sRNA分子伴侶蛋白Hfq等方面[3-8].群體感應(yīng)系統(tǒng)通過(guò)合成、分泌、感知被叫做自誘導(dǎo)物(Autoinducer,AI)的信號(hào)分子，然后經(jīng)過(guò)磷酸化與去磷酸化等作用將環(huán)境信號(hào)一步步地傳遞到關(guān)鍵的調(diào)控元件，通過(guò)其控制下游不同受控基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，對(duì)外界環(huán)境的變化進(jìn)行響應(yīng).QS對(duì)細(xì)菌不同生理功能都有重要的影響，如營(yíng)養(yǎng)代謝、芽孢形成、鞭毛、生物被膜、毒力等.Hfq是反式非編碼sRNA的伴侶蛋白，sRNA是細(xì)菌中一類不編碼蛋白質(zhì)、由60～300個(gè)堿基組成的小RNA.當(dāng)外界環(huán)境變化時(shí)，細(xì)菌可以快速合成不同的sRNA，在伴侶蛋白Hfq的協(xié)助下，與靶標(biāo)mRNA分子通過(guò)堿基配對(duì)而結(jié)合，影響靶標(biāo)mRNA的穩(wěn)定性或翻譯活性，從轉(zhuǎn)錄后水平快速調(diào)控基因的表達(dá)來(lái)響應(yīng)環(huán)境變化.目前，關(guān)于Hfq和sRNAs在細(xì)菌生長(zhǎng)代謝、環(huán)境應(yīng)激、毒力因子合成、對(duì)宿主的致病性等生理功能的重要調(diào)控作用的研究報(bào)道也是越來(lái)越多[9-13].

RyhB是細(xì)菌中目前己知調(diào)控靶mRNA數(shù)目最多的sRNA,通過(guò)轉(zhuǎn)錄后作用對(duì)細(xì)菌胞內(nèi)鐵平衡和病原菌的毒力進(jìn)行調(diào)控.RyhB最早在大腸桿菌中被鑒定,如今也已經(jīng)在其他細(xì)菌體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了與大腸桿菌RyhB同源或功能相近的sRNA分子.這些sRNA分子主要通過(guò)對(duì)病原菌體內(nèi)鐵攝取利用、生物被膜、耐酸性等功能的影響進(jìn)而調(diào)控其致病性[14,15].霍亂弧菌體內(nèi)的RyhB與大腸桿菌RyhB在堿基組成上具有較高的保守性，同源度較高,主要受鐵攝取調(diào)控蛋白Fur和鐵離子的負(fù)向調(diào)控[16].RyhB已在多種細(xì)菌中得到了鑒定，其除了參與鐵代謝外，還參與細(xì)菌耐藥性、壓力應(yīng)激、毒力、致病性等多方面的調(diào)控[17,18].

目前，關(guān)于溶藻弧菌中RyhB的克隆和功能鑒定還沒(méi)有研究報(bào)道.本文首先利用生物信息學(xué)手段，在溶藻弧菌MVP01中篩選得到RyhB編碼基因序列，進(jìn)一步地通過(guò)無(wú)標(biāo)記框內(nèi)缺失手段將ryhB基因1～233位堿基全部從基因組中缺失，獲得其缺失株，同時(shí)構(gòu)建相應(yīng)的互補(bǔ)菌株，通過(guò)不同表型檢測(cè)對(duì)RyhB在溶藻弧菌體內(nèi)的生物學(xué)功能進(jìn)行初步研究.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌DH5α、DH5αλpir、SM10λpir、溶藻弧菌野生型菌株MVP01、自殺質(zhì)粒pDM4、互補(bǔ)質(zhì)粒pBAD33均由本實(shí)驗(yàn)時(shí)保存.pMD18T購(gòu)自寶生物科技有限公司.互補(bǔ)菌株在培養(yǎng)過(guò)程中添加適量的阿拉伯糖及氯霉素.

1.1.2主要儀器和試劑

PCR熱循環(huán)儀伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；水平核酸電泳儀購(gòu)自北京六一生物科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自上海復(fù)日生物科技有限公司；阿拉伯糖、琥珀酸納、HTDMA、無(wú)水哌嗪、LB培養(yǎng)基購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；TaqDNA聚合酶、Pfu高保真DNA聚合酶、DNA分子標(biāo)準(zhǔn)量、DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒等都購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；限制性核酸內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司.

第一，分析同異步溝通對(duì)顧客心流體驗(yàn)的影響，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)顯示，同步溝通組的心流體驗(yàn)值顯著大于異步溝通組的分值(M同步=5.19 > M異步=4.11，df=120, t=5.956，p<0.01)，假設(shè)1再次得到驗(yàn)證。

TSS限鐵培養(yǎng)基:在1L容器中稱量NaCl30g、琥珀酸鈉5g、KCl3.7g、CaCl20.113g、MgCl20.1g、NH4Cl1.1g、KH2PO40.272g、Na2SO40.142g、Tris堿12.1g和Glucose4g，補(bǔ)水到1L.pH調(diào)節(jié)至7.4.滅菌備用.

CAS溶液配制方法為：將6mL10mM HTDMA溶液加到100mL刻度瓶，1.5mL鐵離子溶液(1m MFeCl3，10mM HCl)和7.5mL2mM的CAS溶液緩緩加入，并不斷攪拌.4.307g的無(wú)水哌嗪溶解在水中，加入6.25mL12M HCl.將此緩沖液加到刻度瓶，補(bǔ)加水至100mL.

1.1.3引物

表1為本文所使用的主要引物序列信息，由上海捷瑞生物工程有限公司合成.

表1 實(shí)驗(yàn)中所使用的引物

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ryhB基因的克隆與分析

根據(jù)已公布的溶藻弧菌MVP01基因組和霍亂弧菌以及大腸桿菌中的ryhB基因序列，利用生物信息學(xué)手段對(duì)其進(jìn)行比對(duì)分析，篩選溶藻弧菌中的ryhB基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)ryhB基因進(jìn)行克隆.在此基礎(chǔ)上，利用Mfold對(duì)其進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析(http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold).同時(shí)，為了探究RyhB可能參與的溶藻弧菌生理進(jìn)程，利用在線生物信息學(xué)軟件TargetRNA2(http://snowwhite.wellesley.edu/target)對(duì)RyhB在溶藻弧菌體內(nèi)的靶標(biāo)mRNA進(jìn)行預(yù)測(cè).

1.2.2ΔryhB突變株的構(gòu)建

以溶藻弧菌MVP01基因組為模板，以引物ryhBupF和ryhBupR、ryhBdoF和ryhBdoR分別擴(kuò)增獲得上下游同源臂片段ryhBup和ryhBdo.將目的產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，并以其為模板，同時(shí)以ryhBupF和ryhBdoR為引物經(jīng)overlap PCR將上下游同源臂片段ryhBup和ryhBdo連接起來(lái)，得到缺失了第1～233 bp堿基序列的ΔryhB片段.通過(guò)限制性內(nèi)切酶SalI和SacI對(duì)ΔryhB片段與自殺質(zhì)粒pDM4進(jìn)行雙酶切，后對(duì)酶切后的片段進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pDM4-ΔryhB，并分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5αλpir和 SM10λpir，并挑選含有重組質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆株，作為供體菌株，與受體菌株溶藻弧菌MVP01進(jìn)行接合，通過(guò)兩輪同源重組交換獲得突變株.第一輪利用溶藻弧菌氨芐青霉素抗性和自殺質(zhì)粒的氯霉素抗性的正向選擇標(biāo)記篩選得到第一輪的單交換菌株，進(jìn)而再利用自殺質(zhì)粒的特性，以蔗糖作為反向篩選壓力，獲得框內(nèi)缺失突變株ΔryhB.

1.2.3 互補(bǔ)菌株ryhB+的構(gòu)建

以MVP01基因組為模板，利用互補(bǔ)引物對(duì)ryhBcomF和ryhBcomR擴(kuò)增獲得含有完整ryhB基因的DNA片段后，克隆至pDM18-T載體中,通過(guò)限制性內(nèi)切酶切割后與互補(bǔ)質(zhì)粒pBAD33連接得到重組質(zhì)粒pBAD-ryhB，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5αλpir中，得到陽(yáng)性克隆后抽提回補(bǔ)質(zhì)粒pBAD-ryhB，進(jìn)而轉(zhuǎn)化至供體菌株-大腸桿菌SM10λpir中.最終通過(guò)接合實(shí)驗(yàn)將互補(bǔ)質(zhì)粒pBAD-ryhB接合至受體菌ΔryhB中，在含有氨芐青霉素和氯霉素的雙抗平板上挑取菌落，利用互補(bǔ)引物通過(guò)菌落PCR篩選得到互補(bǔ)菌株ryhB+.

1.2.4 限鐵條件下溶藻弧菌的培養(yǎng)

將不同溶藻弧菌菌株進(jìn)行活化培養(yǎng)后接種至新鮮的TSS限鐵培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，之后按1%接種到TSS限鐵培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h.

1.2.5 鐵載體定性檢測(cè)

利用CAS法對(duì)不同菌株限鐵條件下的上清液中鐵載體的含量進(jìn)行檢測(cè)分析.具體操作如下：將在TSS限鐵培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌液在8 000 rpm下離心15 min，在500μL上清液中加入等體積的CAS溶液，再滴加10μL 0.2 M的磺基水楊酸，漩渦震蕩，在5 min內(nèi)顯粉紅色或橙黃色即表明發(fā)酵液中含鐵載體.

1.2.6 運(yùn)動(dòng)性分析

分別用含有0.3%(w/v)(軟平板)和1.5%(w/v)(硬平板)瓊脂粉的LBS平板測(cè)定各菌株的游動(dòng)性和泳動(dòng)性.將活化后的溶藻弧菌MVP01野生型菌株、ΔryhB突變株和ryhB+互補(bǔ)菌株用新鮮LBS液體培養(yǎng)基稀釋，至OD600=1.0，吸取2μL菌液，滴加于平板上，軟平板正置于30 ℃培養(yǎng)箱中，硬平板則倒置培養(yǎng)，至菌落生長(zhǎng)至合適大小后，取出對(duì)其進(jìn)行拍照.

2 結(jié)果與討論

2.1 ryhB序列克隆與分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中查找得到霍亂弧菌和大腸桿菌中的已鑒定的ryhB基因序列，隨后通過(guò)BLAST將其與已公布的溶藻弧菌MVP01全基因組序列進(jìn)行比對(duì)，篩得溶藻弧菌體內(nèi)的ryhB基因序列，并以此序列為模板設(shè)計(jì)引物，以溶藻弧菌MVP01的基因組為模板，利用PCR擴(kuò)增得到ryhB序列，結(jié)果如圖1所示.其中泳道2和4擴(kuò)增得到一條大小約為230 bp的特異性條帶，與目標(biāo)條帶大小相一致，后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行膠回收并進(jìn)行測(cè)序.測(cè)序結(jié)果表明，溶藻弧菌ryhB基因序列長(zhǎng)度為233 bp.

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1、3泳道：陰性對(duì)照(未加模版)；2、4泳道：目的片段圖1 ryhB基因的克隆

通過(guò)測(cè)序獲得溶藻弧菌ryhB基因序列堿基組成后，利用Genedoc軟件對(duì)溶藻弧菌，霍亂弧菌以及大腸桿菌中的ryhB基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果如圖2所示(圖2中“+1”表示基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)).可以看到,3個(gè)菌種中ryhB基因在大小上存在較大差異，其中大腸桿菌中ryhB基因?yàn)?31 bp，霍亂弧菌為147 bp，均遠(yuǎn)小于溶藻弧菌，這也反映出ryhB基因在不同種屬進(jìn)化過(guò)程中存在較大差異.此外，大腸桿菌和霍亂弧菌中ryhB基因均參與鐵攝取的調(diào)控，且受到鐵調(diào)蛋白Fur的調(diào)控.經(jīng)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，在溶藻弧菌ryhB基因上游-10至-35區(qū)也存在Fur蛋白結(jié)合位點(diǎn)序列，即Fur Box，且在種屬中存在很高的保守性，但其所在位置略有差異(如圖2紅色方框所示).而Fur作為革蘭氏陰性細(xì)菌的重要調(diào)控因子，主要參與細(xì)菌對(duì)鐵的攝取與利用，即RyhB可能在Fur蛋白的調(diào)控下參與溶藻弧菌鐵代謝過(guò)程.此外，三個(gè)菌株中ryhB基因其3′末端均具有Rho依賴型的終止子結(jié)構(gòu)(如圖2藍(lán)色方框所示).

2.2 RyhB二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

在對(duì)RyhB編碼基因進(jìn)行測(cè)序的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用Mfold在線分析工具對(duì)其轉(zhuǎn)錄的RNA分子進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn).預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：RyhB二級(jí)結(jié)構(gòu)具有5個(gè)RNA典型的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，在其3′端為多具U尾巴，同時(shí)在兩個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)間含有伴侶蛋白Hfq假定的結(jié)合位點(diǎn)AU富含區(qū)(如圖3所示).Hfq對(duì)sRNA的識(shí)別不僅與堿基組成相關(guān)，而且還與結(jié)合位點(diǎn)序列周圍RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)相關(guān)，Hfq對(duì)于位于莖環(huán)結(jié)構(gòu)間富含AU的ssRNA結(jié)合力更高.

圖2 不同細(xì)菌中ryhB基因序列的比對(duì)分析

圖3 RyhB二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖

2.3 RyhB在溶藻弧菌中潛在靶標(biāo)mRNA預(yù)測(cè)

反式sRNA分子可以與不同的目標(biāo)mRNA分子之間形成不完全互補(bǔ)配對(duì)的堿基作用，影響目標(biāo)mRNA分子自身的穩(wěn)定性或翻譯活性.為了進(jìn)一步探究RyhB對(duì)溶藻弧菌不同生理功能的影響，首先利用生物信息學(xué)軟件TargetRNA2對(duì)RyhB可能的靶標(biāo)mRNA分子進(jìn)行預(yù)測(cè).RyhB在溶藻弧菌體內(nèi)的潛在靶標(biāo)基因共有32個(gè)，由表2所列舉的部分基因可以看出，RyhB可以與溶藻弧菌不同生理功能相關(guān)的基因之間進(jìn)行堿基配對(duì)，對(duì)這些基因都具有潛在的調(diào)控作用，部分靶標(biāo)基因包括鐵攝取相關(guān)蛋白FecB、鞭毛基體桿狀蛋白B、鉀離子攝取蛋白TrkH等.可見(jiàn),RyhB可能通過(guò)對(duì)這些靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用,參與溶藻弧菌鐵攝取、運(yùn)動(dòng)性、滲透壓平衡等多種不同的生理進(jìn)程的影響.

表2 RyhB部分靶標(biāo)基因

2.4 ΔryhB突變株的構(gòu)建

在克隆得到ryhB基因序列的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步根據(jù)同源交換的原理利用自殺質(zhì)粒得到缺失ryhB基因1～233位共233 bp的突變株ΔryhB.在含有10%蔗糖的反向篩選平板上，進(jìn)行突變株的篩選，通過(guò)菌落PCR對(duì)所篩菌株進(jìn)行初步驗(yàn)證，即利用位于突變株構(gòu)建片段外側(cè)的引物進(jìn)行驗(yàn)證.結(jié)果如圖4所示，1號(hào)泳道為野生型對(duì)照，2號(hào)泳道為ΔryhB突變株，可見(jiàn)ΔryhB突變株通過(guò)引物擴(kuò)增獲得的目的片段比野生型中的片段大小減少了約230 bp，即突變株構(gòu)建時(shí)所設(shè)計(jì)的第1～233位共計(jì)233 bp.

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：WT；2：ΔryhB圖4 ΔryhB突變株P(guān)CR驗(yàn)證電泳圖

隨后對(duì)所得的突變株進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，抽提基因組，以其為模板，采用相同引物進(jìn)行測(cè)序分析.測(cè)序結(jié)果證明，所篩得的PCR菌落驗(yàn)證正確的ΔryhB突變株中，ryhB基因第1～233位核苷酸序列被缺失掉，與設(shè)計(jì)完全相同，即成功構(gòu)建獲得ΔryhB突變株.

2.5 ryhB+互補(bǔ)株的構(gòu)建

在成功獲得了ΔryhB突變株后，利用帶有阿拉伯糖啟動(dòng)子的廣宿主互補(bǔ)質(zhì)粒pBAD33進(jìn)行互補(bǔ)菌株的構(gòu)建，將含有完整RyhB編碼基因序列連接至pBAD33質(zhì)粒中，接合至ΔryhB突變株中.利用引物ryhBcomF和ryhBcomR對(duì)篩得的互補(bǔ)菌株進(jìn)行PCR驗(yàn)證.電泳結(jié)果表明在ryhB+互補(bǔ)株中，互補(bǔ)引物對(duì)共擴(kuò)增得到大小為233 bp的特異條帶，而野生型菌株中也出現(xiàn)了233 bp的條帶，突變株中則無(wú)特異性條帶的產(chǎn)生.這是由于互補(bǔ)引物擴(kuò)增的缺失片段大小為0 bp.證明攜帶有目的片段的回補(bǔ)質(zhì)粒pBAD-ryhB成功接合到ΔryhB突變株中，ryhB+互補(bǔ)株成功構(gòu)建(如圖5所示).

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：WT；2：ryhB+；3：ΔryhB圖5 ryhB+回補(bǔ)菌株P(guān)CR驗(yàn)證電泳圖

2.6 RyhB對(duì)溶藻弧菌鐵載體含量的調(diào)控

通過(guò)對(duì)RyhB編碼基因序列的分析發(fā)現(xiàn)，其上游-10至-35區(qū)存在鐵調(diào)控蛋白Fur的結(jié)合位點(diǎn)序列，即RyhB可能在Fur的調(diào)控下參與溶藻弧菌鐵代謝，且靶標(biāo)mRNA預(yù)測(cè)分析也發(fā)現(xiàn)存在鐵攝取相關(guān)蛋白的mRNA，因此，利用CAS法對(duì)不同菌株在限鐵培養(yǎng)條件下鐵載體含量的變化進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖6所示.

可見(jiàn)，溶藻弧菌野生型菌株在限鐵條件下會(huì)合成一定量的鐵載體(藍(lán)色CAS溶液轉(zhuǎn)變?yōu)檩^淺的橙黃色)，而前期實(shí)驗(yàn)已鑒定參與鐵載體合成的調(diào)控元件Hfq和LuxO作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果與前期研究結(jié)果相一致，即Hfq表達(dá)受損后，鐵載體合成受損；LuxO表達(dá)受損后，鐵載體合成量則上升.當(dāng)RyhB編碼基因缺失后，CAS檢測(cè)溶液顯示為淡藍(lán)色，未發(fā)生淺粉色或橙黃色的轉(zhuǎn)變，即RyhB對(duì)溶藻弧菌鐵載體的形成具有正向調(diào)控作用；而其相應(yīng)的回補(bǔ)株則呈現(xiàn)與野生型類似的顏色變化，即當(dāng)RyhB編碼基因回補(bǔ)后，鐵載體合成恢復(fù)到與野生型類似的水平.前期研究發(fā)現(xiàn)，sRNA分子伴侶蛋白Hfq對(duì)溶藻弧菌在限鐵條件下的生長(zhǎng)具有顯著影響，而本論文發(fā)現(xiàn)RyhB對(duì)鐵攝取載體的合成具有正向調(diào)控作用，后期可開(kāi)展相關(guān)工作深入闡明Hfq與RyhB對(duì)溶藻弧菌鐵攝取相關(guān)生理進(jìn)程的調(diào)控機(jī)制.

圖6 RyhB對(duì)溶藻弧菌鐵載體含量的影響

2.7 RyhB對(duì)溶藻弧菌運(yùn)動(dòng)性的調(diào)控

前期靶標(biāo)mRNA預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，RyhB的一個(gè)靶標(biāo)mRNA分子為鞭毛基體桿狀蛋白B，為了研究RyhB是否參與了溶藻弧菌運(yùn)動(dòng)性的調(diào)控并進(jìn)一步驗(yàn)證靶標(biāo)mRNA預(yù)測(cè)的可靠性，分別通過(guò)含有0.3%和1.5%瓊脂的LBS軟平板和硬平板對(duì)不同菌株的游動(dòng)性和爬動(dòng)性進(jìn)行分析.結(jié)果如圖7所示.

(a)爬動(dòng)性分析

(b)游動(dòng)性分析圖7 RyhB對(duì)溶藻弧菌爬動(dòng)性和游動(dòng)性的影響

由圖7可知：野生型菌株培養(yǎng)16 h后，在硬平板上顯示出較為突出的爬動(dòng)能力，沿著點(diǎn)樣處向四周爬散開(kāi)來(lái)；而ΔryhB突變株的爬動(dòng)能力則基本喪失，在點(diǎn)樣處四周沒(méi)有出現(xiàn)明顯的爬動(dòng)情況，即僅在點(diǎn)樣處進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖；而互補(bǔ)菌株則表現(xiàn)出與野生型基本相當(dāng)?shù)呐绖?dòng)能力，沿著點(diǎn)樣處向四周爬散開(kāi)來(lái)(如圖7(a)所示).而各菌株在軟平板上的游動(dòng)能力基本與硬平板相一致，即野生型菌株在軟平板上過(guò)夜培養(yǎng)后，已經(jīng)基本鋪滿了整個(gè)平板，且形成一定厚度的菌層；而ΔryhB菌株的游動(dòng)能力幾乎喪失，僅在點(diǎn)樣處出現(xiàn)很小范圍的游動(dòng)；ryhB+互補(bǔ)株的游動(dòng)能力則基本恢復(fù)到野生型菌株的水平，鋪板整個(gè)平板(如圖7(b)所示).可見(jiàn)，RyhB對(duì)溶藻弧菌的游動(dòng)和爬動(dòng)能力均具有較為顯著的正向調(diào)控作用，并再次驗(yàn)證了利用生物信息學(xué)手段進(jìn)行靶標(biāo)mRNA預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性.在后續(xù)的工作中，可以深入研究RyhB與鞭毛基體桿狀蛋白B的調(diào)控作用機(jī)制，同時(shí)對(duì)生物信息學(xué)手段預(yù)測(cè)的靶標(biāo)mRNA相關(guān)生理功能進(jìn)行進(jìn)一步的研究.

3 結(jié)論

溶藻弧菌是海水中存在數(shù)量最多的病原菌，給世界范圍內(nèi)的海水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失.溶藻弧菌病害的傳統(tǒng)防治手段為抗生素的使用，但長(zhǎng)期使用易造成細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生及藥物殘留等問(wèn)題，開(kāi)發(fā)新型安全的防治手段已成為迫在眉睫的問(wèn)題，而這就需要明晰溶藻弧菌的毒力及其調(diào)控機(jī)制.sRNA是一類非編碼的小RNA,通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控實(shí)現(xiàn)對(duì)環(huán)境等變化的快速響應(yīng).細(xì)菌體內(nèi)存在多種sRNA，而每一種sRNA分子又存在多種靶標(biāo)mRNA分子，因此sRNA廣泛參與細(xì)菌的多種生理功能的調(diào)控，尤其對(duì)于病原菌的毒力和致病性具有重要調(diào)控作用.

RyhB作為一種sRNA分子，廣泛存在于不同細(xì)菌體內(nèi)，參與鐵代謝、毒力因子合成、致病性、耐藥性等多種生理進(jìn)程[17,18].本文通過(guò)生物信息學(xué)手段在溶藻弧菌MVP01基因組中成功篩查得到RyhB編碼基因，對(duì)其基因序列進(jìn)行了克隆及分析，發(fā)現(xiàn)RyhB在不同細(xì)菌中存在一定的同源性，尤其在其上游啟動(dòng)子區(qū)域都存在鐵攝取調(diào)控元件Fur的結(jié)合區(qū)，即Fur BOX，而且堿基組成高度保守.同時(shí)，通過(guò)生物信息學(xué)手段對(duì)RyhB在溶藻弧菌體內(nèi)的靶標(biāo)mRNA進(jìn)行了預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)RyhB存在多個(gè)靶標(biāo)mRNA，包括鐵攝取、鞭毛合成、滲透壓等相關(guān)組分.隨后，通過(guò)同源重組構(gòu)建了缺失其全基因序列的無(wú)標(biāo)記基因框內(nèi)缺失突變株，同時(shí)利用pBAD33質(zhì)粒構(gòu)建了相應(yīng)的回補(bǔ)菌株.通過(guò)對(duì)比不同菌株不同生理特性發(fā)現(xiàn)：RyhB對(duì)溶藻弧菌鐵載體的合成以及運(yùn)動(dòng)性都具有一定的正向調(diào)控作用，與生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的靶標(biāo)基因功能相符合，表明生物信息學(xué)手段分析的可靠性.