羅倉學(xué)， 張春芳

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

黑豆中蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪、維生素、微量元素和粗纖維含量豐富.中醫(yī)認(rèn)為黑豆有活血、利水、祛風(fēng)、解毒之功效，基于以上保健功能，黑豆常被加工為保健產(chǎn)品[1].黑豆淀粉含量可達(dá)30%[2]，糊化溫度為78℃，是很好的碳水化合物來源.黑豆淀粉在一些產(chǎn)品加工(如黑豆豆?jié){[3]、黑豆酸奶[4]、黑豆多肽保健飲品[5]等)中作為廢渣被浪費(fèi).目前有關(guān)淀粉酶解方面的研究較多，如黃旖旎等[6]用α-淀粉酶酶解百合淀粉，畢金峰等[7]用α-淀粉酶酶解玉米淀粉等，黑豆淀粉研究較少，其主要原因是黑豆淀粉含量低為3～30%[8,9]，常見的淀粉提取法濕磨法[10]和酶解法[11]淀粉提取率較低為50%左右[12]，不利于黑豆淀粉提取，所以黑豆淀粉糊化溫度對(duì)淀粉酶解效果的研究更少.一般淀粉糊化是在低于100℃溫度下進(jìn)行，此溫度是否為最利于淀粉酶解的預(yù)處理溫度并未有相關(guān)報(bào)道.

本文主要對(duì)比了黑豆淀粉在100℃以下和100℃以上高溫糊化對(duì)淀粉酶解率的影響，并通過響應(yīng)面優(yōu)化α-淀粉酶酶解工藝，旨在獲得較高酶解程度的黑豆淀粉酶解液，提高黑豆淀粉利用率.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

α-淀粉酶 ，丹麥諾維信酶制劑公司；食用調(diào)和植物油，益海嘉里食品工業(yè)有限公司；亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、鹽酸、氫氧化鈉、硫酸銅、亞甲基藍(lán)、冰乙酸、葡萄糖、酒石酸鉀鈉，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司.

1.2 儀器與設(shè)備

220V-AC萬用電爐，北京科偉永興儀器有限公司；FA2104S分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；U610052單道可調(diào)式移液器，上海普林斯頓生物科技發(fā)展有限公司；101-2型干燥箱，上海新苗醫(yī)療器械有限公司； PB-10Sartorius pH計(jì)，德國賽多利斯集團(tuán)； MJ-BL25B36粉碎機(jī)，廣東美的集團(tuán)股份限公司；DF-101S集熱式恒溫磁力攪拌器、DF-1集熱式恒溫磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1葡萄糖含量測(cè)定

將黑豆酶解液在沸水浴中滅酶10min，等溫度降至60℃，3000r/min離心10min，根據(jù)GB/T5009.7-2016中方法測(cè)上清液中葡萄糖(以還原糖計(jì))含量.

1.3.2淀粉酶解率測(cè)定方法

將1.3.1葡萄糖含量測(cè)定過程中離心后的上清液測(cè)定體積，并將葡萄糖含量和體積代入式(1).

(1)

式(1)中：m為葡萄糖當(dāng)量等于葡萄糖含量與酶解液質(zhì)量乘積，g；0.9為還原糖轉(zhuǎn)化為淀粉含量的系數(shù)；M為黑豆重量，g；0.28為該黑豆樣品中淀粉含量為28%.

1.4 糊化溫度對(duì)黑豆淀粉酶解率的影響

取黑豆5g和50mL純凈水于帶橡膠塞的圓底燒瓶，選擇糊化溫度為68℃、78℃、98℃、108℃、118℃、128℃在油浴鍋中加熱20min，待黑豆糊中心溫度降至65℃時(shí)加入α-淀粉酶，酶解條件：加酶量30μL、酶解pH值6.0、酶解溫度65℃，酶解時(shí)間1h，沸水浴加熱10min滅酶，測(cè)定不同糊化溫度下的淀粉酶解率，確定最佳糊化溫度，以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次.

1.5 α-淀粉酶酶解實(shí)驗(yàn)

取黑豆5g按質(zhì)量比1∶10加入純凈水在55℃下浸泡5h，按1.4優(yōu)化的糊化溫度在帶有攪拌器的加熱容器中糊化1h，進(jìn)行以下單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn).

1.5.1α-淀粉酶酶解單因素實(shí)驗(yàn)

固定酶解溫度為65℃，加酶量為30μL，酶解時(shí)間為2h，以淀粉酶解率為指標(biāo)觀察不同酶解pH(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)對(duì)淀粉酶解率的影響；固定酶解溫度為65℃，酶解時(shí)間為2h，酶解pH值為6.0，觀察不同加酶量(10μL、20μL、30μL、40μL、50μL)對(duì)淀粉酶解率的影響；固定加酶量為30μL，酶解溫度為65℃，酶解pH值為6.0，觀察不同酶解時(shí)間(1h、2h、3h、4h、5h)對(duì)淀粉酶解率的影響；固定加酶量為30μL，酶解pH值為6.0，酶解時(shí)間為3h，觀察不同酶解溫度(55℃、60℃、65℃、70℃、75℃)對(duì)淀粉酶解率的影響，以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次.

1.5.2α-淀粉酶響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

采用Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，固定酶解時(shí)間為3h，選取酶解pH、加酶量、酶解溫度對(duì)淀粉酶解率影響較大的三個(gè)因素，建立三因素三水平的Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)，以淀粉酶解率為響應(yīng)值，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)詳見表1所示.

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)水平

1.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

將黑豆分別在最佳糊化溫度和78 ℃下糊化后，在最佳酶解條件下酶解，對(duì)比響應(yīng)面軟件所得預(yù)測(cè)值與真實(shí)值之間的誤差及通過比較78 ℃和最佳糊化溫度糊化后淀粉酶解率，得高溫糊化對(duì)淀粉酶解率的影響，以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次.

2 結(jié)果與討論

2.1 糊化溫度對(duì)黑豆淀粉酶解率的影響

由圖1可知，當(dāng)糊化溫度范圍在78 ℃～98 ℃時(shí)，淀粉酶解率基本不變.溫度高于108 ℃時(shí)，淀粉酶解率迅速增加并隨著溫度升高趨于穩(wěn)定.魏毛毛[13]比較了常見的八種淀粉，發(fā)現(xiàn)其中綠豆直鏈淀粉含量最高為37.0%，95 ℃處理下，其膨脹體積最低.黑豆淀粉中直鏈淀粉含量為45.5%[14]，所以推斷出黑豆淀粉膨脹能力較弱，需要高溫才能使其淀粉顆粒完全破壞.當(dāng)溫度大于108 ℃淀粉顆粒才能充分吸水膨脹，淀粉酶解率迅速增加到50%左右并趨于穩(wěn)定.為了節(jié)約資源，所以108 ℃為最佳糊化溫度.

圖1 糊化溫度對(duì)淀粉酶解率的影響

2.2 α-淀粉酶酶解實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1α-淀粉酶單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

(1)酶解pH值對(duì)淀粉酶解率的影響

由圖2可知，酶解pH在5.0～6.0范圍內(nèi)，淀粉酶解率逐漸增大，酶解pH為6.0時(shí)淀粉酶解率達(dá)到最大，酶解pH在6.0～7.0之間淀粉酶解率基本保持穩(wěn)定，說明酶解pH在6.0～7.0之間酶活力穩(wěn)定，此時(shí)的酶解離狀態(tài)最有利于酶與底物結(jié)合.酶解pH在7.0～8.0范圍內(nèi)，淀粉酶解率逐漸降低.原因可能是pH 值影響酶活性中心上必需基團(tuán)的解離程度和催化基團(tuán)中質(zhì)子供體或質(zhì)子受體所需的離子化狀態(tài)，從而影響酶與底物的結(jié)合[15]，因此酶解 pH 值在6.0～7.0為最佳.

圖2 酶解pH對(duì)淀粉酶解率的影響

(2)加酶量對(duì)淀粉酶解率的影響

由圖3可知，隨著加酶量的增加淀粉酶解率逐漸增加，這是因?yàn)榉磻?yīng)起始時(shí)淀粉過量，加酶量與酶促反應(yīng)速度成正比.當(dāng)加酶量增加至30μL時(shí)，淀粉酶解率達(dá)到最大值，大于30μL后淀粉酶解率略有下降，原因是酶與淀粉反應(yīng)為可逆反應(yīng)，當(dāng)還原糖積累到一定程度時(shí)，加速了逆反應(yīng)，更多最終產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為中間產(chǎn)物，抑制正反應(yīng)進(jìn)行，因此淀粉酶解率略有降低[16].所以最佳加酶量為30μL.

圖3 加酶量對(duì)淀粉酶解率的影響

(3)酶解時(shí)間對(duì)淀粉酶解率的影響

由圖4可知，在0～3 h范圍內(nèi)淀粉酶解率隨著酶解時(shí)間的增加而增加.當(dāng)酶解時(shí)間大于3 h時(shí)，淀粉酶解率基本穩(wěn)定不變，原因可能是底物逐步被酶解，淀粉酶解率趨于穩(wěn)定，也可能是酶解時(shí)間的增加，導(dǎo)致酶活力逐漸降低，產(chǎn)物逐步積累，對(duì)酶解作用產(chǎn)生抑制，淀粉酶解率趨于穩(wěn)定.所以最佳酶解時(shí)間為3 h[17].

圖4 酶解時(shí)間對(duì)淀粉酶解率的影響

(4)酶解溫度對(duì)淀粉酶解率的影響

由圖5可知，酶解溫度在55 ℃～65 ℃之間淀粉酶解率緩慢增加，在65 ℃～70 ℃之間，淀粉酶解率基本保持穩(wěn)定，高于70 ℃后淀粉酶解率迅速降低.這一現(xiàn)象與酶促反應(yīng)的普遍規(guī)律相吻合.酶解溫度對(duì)酶促反應(yīng)的影響有兩方面.一方面，當(dāng)酶解溫度升高，單位時(shí)間內(nèi)的有效碰撞次數(shù)增加，反應(yīng)速度增快，達(dá)到最佳溫度范圍后反應(yīng)速度保持穩(wěn)定；另一方面，酶本質(zhì)是蛋白質(zhì)，酶解溫度高于該酶所能承受的最大溫度后，隨著酶解溫度升高，酶發(fā)生變性失活淀粉酶解率迅速降低[18]，所以最佳酶解溫度為70 ℃.

圖5 酶解溫度對(duì)淀粉酶解率的影響

2.2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，由Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)軟件設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案.以淀粉酶解率為響應(yīng)值，以加酶量(A)、酶解pH(B)酶解溫度(C)為自變量，進(jìn)行三因素三水平中心組合實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果如表2所示.

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及酶解結(jié)果

(1)回歸方程擬合及方差分析

采用Design Expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，回歸方程結(jié)果如表3所示.對(duì)各因素回歸擬合后，得到回歸方程：淀粉酶解率=54.80+2.29A+1.89B-0.47C-1.59AB-0.58AC+1.23BC-1.75A2-5.06B2-2.14C2回歸模型的R2=0.988 8，RAdj=0.968 5由方差分析可知回歸方程模型顯著(p<0.05),說明該模型與實(shí)際擬合良好，實(shí)驗(yàn)方法可靠，失擬項(xiàng)不顯著(p>0.05)，說明所得方程與實(shí)際擬合中非正常誤差所占比例小，可用該回歸方程代替實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析.結(jié)果表明，加酶量(A)、酶解pH值(B) 、加酶量與酶解pH值交互項(xiàng)(AB)、 酶解pH值與酶解溫度交互項(xiàng)(BC)、加酶量二次項(xiàng)(A2) 、酶解pH值二次項(xiàng)(B2)、酶解溫度二次項(xiàng)(C2)對(duì)應(yīng)響應(yīng)值顯著，根據(jù)P得各因素顯著性的排序?yàn)锳>B>C.根據(jù)軟件所建立的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行參數(shù)最佳化分析，得α-淀粉酶最佳酶解工藝為：加酶量33.29μL、酶解溫度 69.09 ℃、酶解pH6.03、酶解時(shí)間3 h，淀粉酶解率預(yù)測(cè)值為54.80%.

注：**p<0.01為極顯著；*p<0.05為顯著.

(2)響應(yīng)面圖分析

根據(jù)軟件Design-Expert 獲得響應(yīng)值的3D曲面，分析各因素對(duì)淀粉酶解率的影響及各因素間的交互作用.圖6所示固定加酶量，酶解pH值，酶解溫度中的任意一個(gè)因素為零水平時(shí)，觀察其余兩個(gè)因素間的交互作用及對(duì)淀粉酶解率的影響.淀粉酶解率隨其中任意兩個(gè)變量的增加均呈上升趨勢(shì)，達(dá)到某一定值時(shí)，曲面稍下降或趨于平緩.由圖6可知，曲面陡峭，說明加酶量和酶解pH之間交互作用明顯，與方差分析結(jié)果一致.

圖6 兩因素的交互作用對(duì)淀粉酶解率的響應(yīng)面圖

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

考慮到實(shí)際操作條件，將黑豆酶解工藝調(diào)整為：加酶量33μL、酶解溫度69 ℃、酶解pH6.0、酶解時(shí)間3 h.由表4驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得：黑豆在最佳糊化溫度108 ℃下糊化，用最佳酶解工藝酶解淀粉酶解率達(dá)53.10±2.3%，與預(yù)測(cè)值誤差為3.20±0.04%.相比黑豆在78℃下糊化，黑豆在108 ℃下糊化淀粉酶解率提高了20.20±1.1%.

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

3 結(jié)論

由以上實(shí)驗(yàn)可知，黑豆淀粉糊化溫度為108 ℃時(shí)，最益于α-淀粉酶酶解.在108 ℃下糊化后，通過響應(yīng)面法優(yōu)化α-淀粉酶酶解工藝，得最佳酶解工藝：加酶量33μL，酶解溫度69 ℃，酶解pH6.0，酶解時(shí)間3 h.通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得黑豆108 ℃下糊化，與78 ℃下糊化相比,淀粉酶解率提高了20.20±1.1%.通過本實(shí)驗(yàn)獲得了較高酶解程度的黑豆淀粉酶解液，提高黑豆利用率，避免了資源浪費(fèi).