李冬宏，郭玉佳，林晨，陳杏婷

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，福州 350005)

1992年，Palermo等[1]成功應(yīng)用卵細(xì)胞漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection, ICSI)治療嚴(yán)重少弱精子癥病人以來(lái)，ICSI在治療男性嚴(yán)重少弱精子癥取得了重大治療進(jìn)展。隨后，Devrogy等[2]發(fā)現(xiàn)有些無(wú)精子癥患者的睪丸中存在少量精子，將這些精子應(yīng)用于ICSI，獲得臨床妊娠成功。然而，仍有部分無(wú)精子癥患者無(wú)法產(chǎn)生正常的成熟精子，但可以從患者精液或睪丸活檢標(biāo)本中收集到單倍體圓形精子細(xì)胞(round spermatid, ROS)。1994年，Ogura等[3]報(bào)道了首例ROS受精的小鼠出生，驗(yàn)證了ROS與成熟精子具有同樣的受精和發(fā)育潛能。1995年，Tesarik等[4]從無(wú)精子癥患者的精液中獲得圓形精子細(xì)胞，將其注入卵子后，成功出生了2名正常的嬰兒。圓形精子細(xì)胞注射(round spermatid injection, ROSI)獲得了成功，預(yù)示著無(wú)精子癥且無(wú)法產(chǎn)生正常成熟精子的患者也能擁有自己的遺傳學(xué)后代。ROSI技術(shù)得以迅速發(fā)展，并且獲得了一些成功案例的報(bào)道[5-7]。但ROSI的受精率、妊娠率極低，其影響主要為：圓形精子細(xì)胞、卵母細(xì)胞激活及遺傳學(xué)等因素。因此，本研究將采用磷酸酯酶Cζ(phospholipase C zeta, PLCζ)作為ROSI后小鼠卵母細(xì)胞激活的激活劑，探討PLCζ作為激活劑的可行性及對(duì)ROSI后卵母細(xì)胞受精及胚胎發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)KM小鼠，雄鼠10只，雌鼠30只，鼠齡6～8周，體重25～30 g，購(gòu)自于閩侯縣吳氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物貿(mào)易有限公司【SCXK(閩)2017-0002】，飼養(yǎng)于福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SYXK(閩)2017-0014】，飼養(yǎng)環(huán)境濕度恒定，溫度(24±2)℃，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后用于實(shí)驗(yàn)。本研究通過(guò)福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)審批(2016038)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

表達(dá)質(zhì)粒pCRII-TOPO(見(jiàn)圖1)和人胚腎293T細(xì)胞(human embryonic kidney 293T cells，HEK293T)均購(gòu)自BioVector質(zhì)粒載體菌種細(xì)胞基因保藏中心；瓊脂糖、質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購(gòu)自天根生化科技有限公司；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ、TaKaRa LA Taq酶、1 Kbp DNA Ladder Marker、T4DNA連接酶均購(gòu)自TaKaRa公司；QIAamp DNA Mini kit購(gòu)自QIAGEN公司；jetPEI轉(zhuǎn)染試劑試劑盒、胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)CS)、培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM)、10% NuPAGE Bis-Tris Pre-cast Gel試劑盒(Invitrogen, UK)均購(gòu)自諾斯蒂克(上海)醫(yī)療器械有限公司。

圖1 真核表達(dá)質(zhì)粒pCRII-TOPO DNA圖譜Figure 1 The DNA map of eukaryotic expression vector pCRII-TOPO

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒pCRII-TOPO- PLCζ的構(gòu)建、體外表達(dá)與鑒定

采集新鮮的小鼠睪丸組織，用Trizol法提取總RNA備用。根據(jù)GenBank(NCBI Reference Sequence: NM_054066.4)中PLCζ的基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列如下：上游引物ATGGATCCATGGAAAGCCAAC TTCATGA；下游引物CGCTCGAGAGTGAGAGACTT CATGGTTTG。上下游引物分別加入的酶切位點(diǎn)為BamHⅠ、XhoⅠ。其聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃ 8 min、變性95℃ 45 s、退火55℃ 45 s、延伸72℃ 90 s、終延伸72℃ 5 min，30個(gè)循環(huán)。①采用基因重組技術(shù)構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pCRII-TOPO- PLCζ。②采用jetPEI轉(zhuǎn)染試劑試劑盒將構(gòu)建好的真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK293T細(xì)胞。③將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后的HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)入含有FCS的DMEM中，并添加4 mmol谷氨酰胺，100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素，置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，將培養(yǎng)液改換成不含F(xiàn)CS的DMEM。④培養(yǎng)56 h后，收集HEK293T細(xì)胞；采用裂解液裂解細(xì)胞，10% NuPAGE Bis-Tris Pre-cast Gel試劑盒(Invitrogen, UK)純化重組PLCζ蛋白。重組PLCζ蛋白經(jīng)飛行質(zhì)譜蛋白質(zhì)組分析系統(tǒng)鑒定，并用免疫印跡法(Western blot)評(píng)價(jià)其抗原性，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 小鼠圓形精子細(xì)胞顯微注射

(1)小鼠圓形精子細(xì)胞收集

取清潔級(jí)6～8周齡雄性KM小鼠雙側(cè)睪丸，剪碎后采用兩步酶消化法制備細(xì)胞懸液，將處理好的細(xì)胞懸液用PBS液洗滌三次，每次670 r/min離心10 min，洗滌完后棄上清，用睪丸細(xì)胞培養(yǎng)液混懸后待用。非連續(xù)性Percoll梯度法：將Percoll梯度液配成濃度分別為45%、60%、90%濃度梯度；吸取1 mL 45% Percoll梯度液加入15 mL錐形離心管中，然后再依次吸取1 mL 60%和90%的Percoll梯度液深入離心管管底后分次緩慢加入；最后將制好的單細(xì)胞懸液加入到密度梯度液層的最上面；室溫下，2184 r/min離心20 min；取最佳的梯度層用buffer液(1∶2)混勻；室溫下，335 r/min離心8 min，棄上清混懸后待用。

(2)顯微注射液的制備

將收集的小鼠圓形精子細(xì)胞與上述制備的重組PLCζ蛋白混合，配制成終濃度為10×10-3ng/L的混合液為實(shí)驗(yàn)組；另將小鼠圓形精子細(xì)胞與HEPES混合為空白組。將處理好的PLCζ激活劑與圓形精子細(xì)胞混合液在ROSI操作皿中制成微滴，其上方位置制作HEPES微滴，置于37℃培養(yǎng)箱加熱預(yù)平衡1 h。

(3)小鼠卵母細(xì)胞獲取

選取清潔級(jí)6～8周齡KM雌性小鼠，至少控光(光照7：00 - 19：00，黑暗19：00 - 7：00)飼養(yǎng)一周后進(jìn)行促排處理；于17：00對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射PMSG 15 IU/只，48 h后注射HCG 10 IU/L；注射HCG 15 h后，利用頸椎脫臼法處死小鼠，在腹部下側(cè)呈“V”字型打開(kāi)腹腔，找到子宮與卵巢，剪下兩者之間的輸卵管放入盛有卵子處理液(HEPES)含5%胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)CS)的培養(yǎng)皿中；在體視鏡下用針刺破明顯腫脹的輸卵管壺腹部，將有液體流出，取出其中的卵丘卵母復(fù)合體(cumulus-oocyte complexes，COCs)；將取出的COCs在受精液(Fertilization，10% FCS)中清洗2～3次后放入盛有Fertilization液(含5% FCS)的培養(yǎng)皿中置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1～2 h；將收集的COCs用HEPES液(5% FCS)中清洗2～3次后放入含有0.1%透明質(zhì)酸酶的HEPES液中處理1 min，然后用于卵母細(xì)胞直徑相似的玻璃吸管反復(fù)吹吸去掉卵丘顆粒細(xì)胞，獲得裸卵(deruded oocytes，DOs)；將洗凈的DOs放入Fertilization液(10% FCS)，挑選出含有第一極體且形態(tài)正常的MⅡ期卵母細(xì)胞置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

(4)圓形精子細(xì)胞注射

將獲取的卵母細(xì)胞放入HEPES微滴中，調(diào)整卵母細(xì)胞，使其第一極體位于12點(diǎn)或6點(diǎn)，持卵針于9點(diǎn)位置固定卵母細(xì)胞；顯微折射針挑選圓形精子細(xì)胞并回吸3個(gè)刻度(操作臂上刻度)，于3點(diǎn)位置刺入卵母細(xì)胞中，然后開(kāi)始回吸胞質(zhì)，直至破膜后立刻停止回吸，然后將圓形精子細(xì)胞緩慢注入卵母細(xì)胞胞質(zhì)中，抽出注射針，固定針釋放卵母細(xì)胞；

(5)胚胎觀察

將圓形精子細(xì)胞注射后并激活的卵母細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，ROSI后16～18 h(D1)觀察每個(gè)卵母細(xì)胞原核出現(xiàn)情況；ROSI后44～46 h(D2)觀察每個(gè)卵母細(xì)胞分裂并分級(jí)；68～70 h(D3)觀察卵裂并分級(jí)，隨即立刻轉(zhuǎn)入囊胚培養(yǎng)液(含5% FCS)中培養(yǎng)，116～118 h(D5)觀察培養(yǎng)成囊情況及分級(jí)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究項(xiàng)目數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用率[n(%)]表示，行方差分析，其P< 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒pCRII-TOPO- PLCζ的構(gòu)建結(jié)果

以小鼠基因組為模板進(jìn)行目的基因PLCζ的擴(kuò)增(見(jiàn)圖2)。1%瓊脂糖凝膠電泳顯示目的條帶大小約為1960 bp，與目的基因大小相符。

注：Lane1：陰性對(duì)照；Lane2：PCR擴(kuò)增PLCζ產(chǎn)物；Lane3∶1 Kbp DNA Ladder Marker。圖2 PCR產(chǎn)物凝膠電泳分析Note. Lane 1: negative control. Lane 2: PCR amplification of PLCζ products. Lane 3: 1 Kbp DNA ladder markers.Figure 2 Analysis of PCR product by gel electrophoresis

將重組質(zhì)粒pCRII-TOPO- PLCζ進(jìn)行雙酶切鑒定(見(jiàn)圖3)。雙酶切后1%瓊脂糖凝膠電泳顯示目的條帶大小分別為4000 bp和1960 bp，于原質(zhì)粒pCRII-TOPO和目的基因大小相符。且經(jīng)過(guò)測(cè)序，目的基因序列未發(fā)生突變。

注：Lane1：重組質(zhì)粒pCRII-TOPO- PLCζ雙酶切樣品；Lane2：重組質(zhì)粒pCRII-TOPO- PLCζ樣品；Lane3∶1 Kbp DNA Ladder Marker。圖3 重組質(zhì)粒pCRII-TOPO- PLCζ雙酶切電泳圖Note. Lane 1: recombinant plasmid pCRII-TOPO-PLCζ double digestion sample. Lane 2: recombinant plasmid pCRII-TOPO-PLCζ sample. Lane 3: 1 Kbp DNA ladder markers.Figure 3 Recombinant plasmid pCRII-TOPO-PLCζ double enzyme digestion electropherogram

2.2 重組PLCζ蛋白體外表達(dá)與鑒定結(jié)果

重組PLCζ蛋白經(jīng)體外誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行SDS-PAGE(見(jiàn)圖4)。在90 kDa附近出現(xiàn)大量表達(dá)蛋白條帶，與重組蛋白預(yù)計(jì)大小74×103Da相比略大。但切下該目的條帶后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，為小鼠PLCζ蛋白。

注：Lane1：蛋白Marker；Lane2：重組質(zhì)粒pCRII-TOPO- PLCζ誘導(dǎo)樣品；Lane3：空質(zhì)粒pCRII-TOPO誘導(dǎo)樣品。圖4 體外誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白SDS-PAGE圖Note. Lane 1: protein markers. Lane 2: recombinant plasmid pCRII-TOPO-PLCζ-induced sample. Lane 3: empty plasmid pCRII-TOPO-induced sample.Figure 4 SDS-PAGE analysis of recombinant protein expression in vitro

對(duì)該重組PLCζ蛋白用Western blot評(píng)價(jià)其抗原性(見(jiàn)圖5)。在90×103Da以下出現(xiàn)了一條特異性條帶，大小符合重組蛋白預(yù)計(jì)大小。

注：Lane 1：蛋白Marker；Lane2：重組質(zhì)粒pCRII-TOPO- PLCζ誘導(dǎo)樣品；Lane 3：空質(zhì)粒pCRII-TOPO誘導(dǎo)樣品。圖5 體外誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白Western blot圖Note. Lane 1: protein markers. Lane 2: recombinant plasmid pCRII-TOPO-PLCζ-induced sample. Lane 3: empty plasmid pCRII-TOPO-induced sample.Figure 5 Western blot analysis of recombinant protein expression in vitro

2.3 小鼠ROSI后卵母細(xì)胞受精及胚胎發(fā)育結(jié)果

將小鼠圓形精子細(xì)胞與重組PLCζ蛋白混合為實(shí)驗(yàn)組，另將小鼠圓形精子細(xì)胞與HEPES混合為空白組。分別進(jìn)行RSOI后觀察小鼠卵母細(xì)胞的受精情況和胚胎發(fā)育情況(見(jiàn)圖6)。

將兩組小鼠卵母細(xì)胞的受精情況和胚胎發(fā)育情況統(tǒng)計(jì)其結(jié)果如下表1所示。實(shí)驗(yàn)組的受精率高于空白組，兩者之間的差異無(wú)顯著性(P>0.05)。但實(shí)驗(yàn)組的2-4細(xì)胞率、8細(xì)胞率及成囊率均要略低于空白組，兩者之間的差異無(wú)顯著性(P>0.05)。

注：a：小鼠卵母細(xì)胞受精圖；b：小鼠胚胎2-4細(xì)胞分裂圖；c：小鼠胚胎8細(xì)胞及桑椹胚圖；d：小鼠胚胎囊胚圖。圖6 小鼠ROSI后卵母細(xì)胞受精及不同時(shí)期胚胎發(fā)育圖Note. a: mouse oocyte fertilization map after ROSI. b: mouse embryo two- to four-cell division graph. c: mouse embryo eight-cell stage and mulberry embryo graph. d: mouse embryo blastocyst graph.Figure 6 The fertilization map of mouse oocytes after ROSI and the embryo development map in different period

組別Groups受精率%(受精數(shù)/卵母細(xì)胞數(shù))Fertilization rate%(No. Fertilization/No. MⅡ)2-4細(xì)胞率%(2-4細(xì)胞數(shù)/受精數(shù))2-4 cell rate%(No. 2-4 cell/No. Fertilization)8細(xì)胞率%(8細(xì)胞數(shù)/受精數(shù))8 cell rate%(No. 8 cell/No. Fertilization)成囊率%(囊胚數(shù)/受精數(shù))Blastocyst formation rate%(No. blastocyst/No. Fertilization)空白組Blank group39.33(59/150)69.49(41/59)67.80(40/59)40.68(24/59)實(shí)驗(yàn)組Test group42.00(63/150)68.25(43/63)63.49(40/63)34.92(22/63)χ2/P值χ2/P value0.221/0.6380.022/0.8830.250/0.6170.619/0.432

3 結(jié)論

PLCζ是存在于脊椎動(dòng)物精子中的一種特異性磷脂酶C，屬于磷脂酶C家族的一員，為可溶性的單鏈結(jié)構(gòu)，通過(guò)PLCζ介導(dǎo)磷脂酰肌醇信號(hào)通路[8]。PLCζ催化活性部分是高度保守的X區(qū)和Y區(qū)，該區(qū)酶蛋白經(jīng)折疊靠近后形成催化活性中心，具有PLC的典型結(jié)構(gòu)。XY結(jié)構(gòu)區(qū)域分別含有170個(gè)氨基酸殘疾和260個(gè)氨基酸殘基，若其中一個(gè)氨基酸殘基發(fā)生突變，PLCζ則會(huì)失去生物活性導(dǎo)致引發(fā)鈣振蕩的能力喪失[9-10]。Kashir等[11]利用人類(lèi)細(xì)胞系表達(dá)重組人類(lèi)PLCζ蛋白，將該蛋白注入小鼠卵子中，能夠產(chǎn)生與正常受精相同的Ca2+振蕩模式。再者Saunders等[8]將小鼠PLCζ mRNA注射入成熟卵子中也可引發(fā)與受精時(shí)相似的Ca2+振蕩，而去除了PLCζ則不能引發(fā)卵母細(xì)胞Ca2+振蕩。Joncs等[12]證實(shí)了精子中PLCζ活性要比其他組織高出2倍以上，單條精子的含量就可以引起Ca2+振蕩。雖然目前研究已證實(shí)PLCζ可以引發(fā)卵母細(xì)胞發(fā)生Ca2+振蕩，但PLCζ可否作為一種ROSI后卵母細(xì)胞的激活劑以及激活后對(duì)胚胎受精發(fā)育是否有影響，迄今為止研究甚少。因此，本研究將采用PLCζ作為ROSI后卵母細(xì)胞激活的激活劑，探討PLCζ作為激活劑的可行性及對(duì)ROSI后卵母細(xì)胞受精及胚胎發(fā)育的影響。

本研究中成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pCRII-TOPO-PLCζ，并在體外表達(dá)了重組PLCζ蛋白，且具有良好的抗原特性。但是將重組PLCζ蛋白作為小鼠ROSI后的卵母細(xì)胞激活劑，卵母細(xì)胞受精率略高于空白組，但不具有顯著差異。PLCζ是影響男性生殖與不育的關(guān)鍵因素，也是一種重要的激活卵母細(xì)胞的精子因子。研究發(fā)現(xiàn)不能引發(fā)Ca2+振蕩的都是因?yàn)榫拥腜LCζ出現(xiàn)異常[13]。但Swann等[14]研究表明沒(méi)有功能的PLCζ不會(huì)影響精子的發(fā)生及精子質(zhì)量參數(shù)，如精子活力、活動(dòng)率和頂體反應(yīng)能力。由于本研究沒(méi)有對(duì)重組的PLCζ進(jìn)行功能評(píng)價(jià)，可能是本研究中卵母細(xì)胞受精率沒(méi)有發(fā)生顯著變化這一陰性結(jié)果的原因之一，因此PLCζ對(duì)卵母細(xì)胞受精及胚胎發(fā)育無(wú)影響還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。另外研究結(jié)果還顯示2-4細(xì)胞率、8細(xì)胞率及成囊率卻略低于空白組，卻不具有顯著差異，分析其原因可能是提純的重組蛋白中含有其他種類(lèi)的蛋白，會(huì)對(duì)胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生某些輕微影響，但目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。

目前關(guān)于Ca2+振蕩對(duì)于卵子最佳激活和隨后胚胎發(fā)育的重要性已有相當(dāng)?shù)臓?zhēng)論。改變Ca2+的數(shù)量和瞬變的頻率可以微妙的影響胚胎基因的表達(dá)與發(fā)展?jié)摿15]，但也有研究結(jié)果顯示未檢測(cè)到任何形式的Ca2+會(huì)影響缺失PLCζ精子的ICSI結(jié)果[16]。正如Hachem等[17]學(xué)者所述，現(xiàn)今由于精子不能誘導(dǎo)活化卵子造成的男性不育現(xiàn)象可以通過(guò)人為的干預(yù)(如機(jī)械法、電子法或化學(xué)刺激法)來(lái)刺激誘導(dǎo)卵子活化的方法來(lái)處理此類(lèi)男性不育。但是這些處理誘導(dǎo)的Ca2+都是非生理性的，對(duì)人類(lèi)發(fā)育的長(zhǎng)期影響仍未明確，是值得廣大醫(yī)學(xué)工作者重點(diǎn)關(guān)注的問(wèn)題。綜上所述本研究中重組PLCζ蛋白對(duì)卵母細(xì)胞受精及胚胎發(fā)育無(wú)顯著影響，作為小鼠ROSI后的卵母細(xì)胞激活劑的可行性值得商榷。