趙家榮，劉歡，張濤，王令，路宏朝，杜偉立

(陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中 723000)

維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)是一種核轉(zhuǎn)錄因子，屬于類固醇激素/甲狀腺激素受體超家族成員[1]，廣泛存在于人體多種組織和細(xì)胞[2-3]。1,25-二羥基維生素D3(1,25(OH)2D3)激素信號分子與VDR結(jié)合形成激素-受體復(fù)合物并作用于靶基因上的特定DNA序列，調(diào)節(jié)下游基因表達(dá)，同時影響相關(guān)代謝通路[4-6]。VDR的生理功能是調(diào)節(jié)人體內(nèi)鈣和礦物質(zhì)平衡，參與皮膚、免疫系統(tǒng)、結(jié)腸、乳腺和前列腺等多種器官的生長發(fā)育過程[7-10]。當(dāng)VDR缺乏后，可能會導(dǎo)致心血管疾病、炎癥、糖尿病和毛囊發(fā)育障礙等疾病的發(fā)生[11-12]。由于生物體的復(fù)雜多樣性，在不同物種、不同組織和機(jī)體發(fā)育的不同階段，VDR的生理功能目前仍存在較大爭議，特別是在糖脂代謝過程、骨骼肌生長發(fā)育、生殖機(jī)能等方面，VDR的功能并未完全揭示。因此，構(gòu)建穩(wěn)定遺傳的VDR敲除鼠品系，將為后續(xù)其功能的解析提供良好的動物模型。

基于實驗室前期構(gòu)建的F0代VDR敲除鼠模型[13]，本實驗將首先測定小鼠的繁殖性能，選擇具有生殖能力的敲除鼠與野生鼠進(jìn)行交配，建立能夠?qū)DR敲除基因穩(wěn)定遺傳的雜合群體，進(jìn)而對繁育小鼠的基因型和VDR表達(dá)水平進(jìn)行鑒定分析，為揭示VDR的生物學(xué)功能提供實驗材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

4月齡SPF級C57BL/6 J小鼠12只，雌、雄各6只，體重20～25 g，購于成都達(dá)碩實驗動物有限公司【SCXK(川)2015-030】，實驗室采用胚胎顯微注射和CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建成VDR-/-基因敲除鼠，飼養(yǎng)于陜西理工大學(xué)生物學(xué)實驗中心【SYXK(陜)2016-0012】。所有小鼠均飼養(yǎng)于12/12 h光照/黑暗條件下，自由采食和飲水，所有操作均符合實驗動物倫理學(xué)要求(倫理審查備案號：SLGQD2017-10-IACUC2017-0004)。

T7E1核酸內(nèi)切酶，總RNA提取試劑盒，SYBR Premix Ex Taq(大連寶生物工程有限公司，中國)；Trizol(西安熱默爾生物公司，中國)；一抗(兔抗VDR單抗抗體)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗，內(nèi)參抗體(辣根過氧化物酶標(biāo)記鼠β-actin抗體)(Cell Signaling Technology，美國)；裂解液RIPA和ECL曝光液(武漢博士德生物工程有限公司，中國)；DNA純化試劑盒、PVDF膜(Fluxion Biosciences，美國)；基因序列測序，Real-time qPCR引物合成由北京奧科生物技術(shù)有限公司完成。

1.1.3 實驗儀器

實時熒光定量PCR儀(Step OnePlusTM，Applied Biosystems，美國)，數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-2，常州潤華電器有限公司，中國)，PCR擴(kuò)增儀(PTC-200，MJResearch，美國)，常溫離心機(jī)(Centrifuge5424，Eppendorf，德國)，低溫離心機(jī)(Centrifuge5415R，Eppendorf，德國)，立式壓力蒸汽滅菌器(YXQ-Ls-75G，上海博訊實業(yè)有限公司，中國)，電泳儀(DYY-6C，北京市六一儀器廠，中國)，渦旋儀(VDP7EX-6，海門市其林貝爾儀器制造有限公司，中國)，紫外可見光光度計(UV-4802，尤尼柯(上海)儀器有限公司，中國)，凝膠成像系統(tǒng)(Gel Doc，BIO-RAD，美國)，蛋白曝光儀(GeneGnome，Syngene，美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物設(shè)計

根據(jù)Genbank公布的小鼠VDR基因序列(CT010294.1)，設(shè)計檢測鼠VDR基因打靶位點引物及其定量引物(見表1)。

表1 引物名稱及序列Table 1 Primer names and sequences

注：qVDR-F和qVDR-R為定量引物；VDRTPF和VDRTPR為擴(kuò)增打靶位點引物。

Note. qVDR-F and qVDR-R are quantitative primers; VDRTPF and VDRTPR are amplified target site primers.

1.2.2 VDR敲除鼠品系構(gòu)建

施工單位在對該公路使用強(qiáng)夯技術(shù)之前，必須派專業(yè)人員對所要進(jìn)行施工的路段進(jìn)行詳細(xì)勘測，勘測其地質(zhì)條件、施工地周圍環(huán)境以及如何有效進(jìn)行該技術(shù)的應(yīng)用，都必須通過前期的勘測做出詳細(xì)規(guī)劃。從而提高工程的建設(shè)質(zhì)量和效率。在強(qiáng)夯技術(shù)的應(yīng)用時，重錘自由落體的強(qiáng)烈震動會對周圍的建筑物造成直接的影響，為了避免此現(xiàn)象的發(fā)生，施工單位就需要對施工周圍的環(huán)境進(jìn)行詳細(xì)的監(jiān)測，可以通過挖掘減震溝等辦法來減少重錘下落帶來強(qiáng)烈震動對周圍建筑物的影響。由于在施工過程中，會造成路基水分的流失，在情況比較嚴(yán)重的時候，直接影響工程的建設(shè)進(jìn)程。所以工程建設(shè)公司要加強(qiáng)臨時排水設(shè)施的建設(shè)，從而確保工程建設(shè)的順利進(jìn)行。

先將F0代雌、雄性VDR基因敲除純合子(VDR-/-)小鼠互交，分析繁殖能力，后將VDR-/-小鼠與野生型(VDR+/+)小鼠互交，獲得F1代；F1代雌、雄性VDR基因敲除雜合子(VDR+/-)小鼠互交或VDR+/-小鼠與VDR+/+小鼠互交獲得F2代；F2代雌、雄性VDR+/-小鼠互交獲得F3代。

1.2.3 VDR敲除鼠鑒定

(1)VDR敲除鼠表型分析

每周定期觀察小鼠體型以及被毛和皮膚形態(tài)的變化，詳細(xì)記錄。

(2)VDR敲除鼠基因型鑒定

剪取鼠尾組織樣，蛋白酶K法提取小鼠基因組DNA，PCR擴(kuò)增CRISPR/Cas9打靶基因片段，PCR擴(kuò)增體系為50 μL：5 μLTaq酶緩沖液，6 μL Mg2+，5 μL dNTP，上下游引物各2 μL，模板1 μL，Taq酶0.5 μL，水28.5 μL；PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共34個循環(huán)，72℃延伸10 min，12℃保存，擴(kuò)增結(jié)束后，用DNA純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物，從而獲得VDR敲除打靶基因片段。T7E1核酸內(nèi)切酶檢測VDR基因是否敲除，同時將VDR敲除打靶基因片段測序，進(jìn)一步確認(rèn)VDR基因敲除類型。

1.2.4 VDR敲除鼠不同組織中VDR表達(dá)水平分析

利用實時熒光定量PCR(qPCR)檢測敲除鼠多種組織中VDR基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。TRIZOL法提取VDR敲除鼠肺、腎、皮膚、小腸、睪丸和胸腺等組織RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)為cDNA，以cDNA為模板，在轉(zhuǎn)錄水平檢測VDR敲除鼠各個組織中VDR基因的表達(dá)情況。25 μL qPCR反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq TM(2x)12.5 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL；qPCR反應(yīng)程序：95℃，10 min；95℃，15 s；60℃，1 min；溶解曲線收集信號程序：95℃，15 s；60℃，1 min；95℃，15 s；共40個循環(huán)；采用2-ΔΔCt法分析qPCR結(jié)果。

取VDR敲除鼠肺、腎、皮膚、小腸和睪丸等組織各50 mg于研缽，加入液氮研磨后加入150 μL RIPA裂解液。轉(zhuǎn)移細(xì)胞裂解混合物至離心管，然后加入SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)上樣緩沖液，混勻后置于沸水浴10 min，然后于4℃，10 000 r/min，冷凍離心10 min。取上清液進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜，洗脫后用封閉液封閉，加入一抗、洗脫、加二抗，ECL曝光。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 F0代VDR敲除鼠繁殖性能測定

實驗室前期構(gòu)建F0代VDR敲除鼠12只，均為雙等位基因敲除，其中8只VDR-/-小鼠等位基因敲除片段大小與位置一致，4只VDR-/-小鼠等位基因敲除片段存在差異。采用12只雌、雄性VDR-/-小鼠隨機(jī)互交和VDR-/-小鼠與VDR+/+小鼠互交兩種交配方式進(jìn)行VDR敲除鼠的繁育，結(jié)果只有VDR-/-10#(♂)和VDR-/-32#(♀)可以產(chǎn)生子代，且VDR-/-10#(♂)與VDR-/-32#(♀)交配也可以產(chǎn)生VDR-/-子代。VDR-/-10#(♂)和VDR-/-32#(♀)交配產(chǎn)生的VDR-/-小鼠及VDR-/-32#與VDR+/+小鼠繁育的子代沒有繁育能力，因此本實驗的研究對象都是VDR-/-10#與VDR+/+小鼠產(chǎn)生的后代，突變型VDR的保存與遺傳都是以VDR+/-雜合體形式進(jìn)行，本研究中VDR敲除鼠品系的建立均是通過VDR+/-與VDR+/+和VDR+/-與VDR+/-兩種交配方式進(jìn)行。

2.2 VDR基因敲除鼠鑒定

2.2.1 敲除鼠表型分析

本研究借助于前期獲得F0代敲除鼠，建立了可穩(wěn)定遺傳的VDR敲除鼠品系，實驗室保存的敲除鼠分別有VDR+/-和VDR-/-兩種。通過觀察，VDR+/-小鼠和VDR+/+小鼠在表型、骨骼發(fā)育及活動能力上無顯著差異，隨著月齡增大也沒有發(fā)生明顯變化，而VDR-/-小鼠和VDR+/+小鼠具有顯著差異，3月齡時眼眶周圍開始脫毛，并隨著月齡增加，四肢及背部脫毛現(xiàn)象逐漸明顯，直到12月齡時幾乎完全脫毛，且骨骼發(fā)育緩慢，體型小，皮膚皺縮，活動能力降低(圖1)。

2.2.2 敲除鼠基因型鑒定

以F2代小鼠基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增靶點片段，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示：均能擴(kuò)增大小約470 bp的條帶，與預(yù)期的VDR靶基因片段大小一致(圖2)；純化的PCR產(chǎn)物在T7E1核酸內(nèi)切酶作用下檢測F2代VDR敲除鼠，如圖3所示，本實驗從F2代小鼠中隨機(jī)挑選3只小鼠進(jìn)行檢測分析，結(jié)果顯示3號泳道樣本為野生型小鼠，2號和4號泳道的樣本為VDR+/-小鼠。T7E1檢測后再經(jīng)測序確認(rèn)，發(fā)現(xiàn)2號和4號樣本的敲除類型一致，有5 bp的小片段刪除，導(dǎo)致VDR發(fā)生無義突變，這一測序結(jié)果與F0代VDR-/-10#小鼠的一個等位基因的突變一致，說明本實驗已經(jīng)通過F0代VDR-/-10#小鼠繁育了VDR+/-小鼠，為后續(xù)VDR敲除鼠品系奠定了基礎(chǔ)。(見圖4)。

圖1 小鼠表型特征Figure 1 Phenotypic characteristics of mice

圖4 VDR敲除鼠靶點測序圖Figure 4 Target sequencing chart of VDR knockout mice

注：M. DNA標(biāo)準(zhǔn)Marker DL2000；1-6.不同個體VDR靶點基因擴(kuò)增產(chǎn)物。圖2 VDR靶點基因擴(kuò)增Note. M. DNA Standard Marker DL2000; 1-6. Amplified products of VDR target gene in different individuals.Figure 2 Amplification of VDR target gene

注：M. DNA標(biāo)準(zhǔn)Marker DL2000；1.T7E1未切VDR靶點基因；2-4.T7E1酶切不同個體VDR靶點基因。圖3 T7E1核酸內(nèi)切酶鑒定VDR敲除鼠Note. M. DNA Standard Marker DL2000; 1. T7E1 uncut VDR target gene; 2-4. T7E1 digests VDR target gene in different individuals.Figure 3 T7E1 endonuclease to identify VDR knockout mice

2.2.3 VDR基因敲除小鼠的繁育及鑒定情況

前期通過F0代12只VDR-/-敲除鼠繁育性能的檢測分析，發(fā)現(xiàn)只有VDR-/-10#小鼠具有較好的、穩(wěn)定的繁殖能力，因此本研究所有小鼠都是VDR-/-10#小鼠繁育的后代，每一代的繁殖性能和基因型鑒定情況見表2，這些數(shù)據(jù)表明不同繁育方式所產(chǎn)子代小鼠的基因型分布基本符合孟德爾遺傳定律，在VDR敲除鼠品系構(gòu)建過程中，本研究建立了詳細(xì)、系統(tǒng)的遺傳系譜圖，其中部分遺傳系譜圖見圖5。

表2 VDR基因敲除小鼠不同繁育方式繁育結(jié)果Table 2 Breeding results of different breeding methods in VDR knockout mice

圖5 VDR敲除鼠遺傳系譜圖Figure 5 Genetic lineage of VDR knockout mice

2.3 敲除鼠不同組織中VDR基因表達(dá)水平分析

采用qPCR檢測F0代和F1代VDR-/-小鼠的肺、腎、皮膚、小腸、睪丸和胸腺等組織中VDR的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，與VDR+/+小鼠相比，F(xiàn)0代VDR-/-小鼠小腸和胸腺組織中VDR轉(zhuǎn)錄水平升高，且差異有極顯著性(P< 0.01)，肺組織中呈顯著升高(P< 0.05)，睪丸組織中也呈現(xiàn)升高趨勢，但差異無顯著性，腎和皮膚組織中VDR轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量呈降低趨勢，且差異不顯著，如圖6(a)所示。F1代VDR-/-小鼠各組織中VDR轉(zhuǎn)錄水平均呈升高趨勢，其中肺、皮膚、小腸和睪丸組織中差異極顯著(P< 0.01)，胸腺組織中差異有顯著性(P< 0.05)，但腎組織中差異不顯著，如圖6(b)所示。

Western blot檢測F0代VDR-/-小鼠和VDR+/+小鼠皮膚、小腸、腎、睪丸、肺等組織蛋白表達(dá)水平，如圖7所示，VDR+/+小鼠中各組織均有VDR表達(dá)，而VDR-/-小鼠中都未檢測到VDR蛋白水平表達(dá)，說明VDR敲除成功。

注：(a) F0代VDR-/-小鼠與VDR+/+小鼠不同組織VDR基因表達(dá)水平；(b) F1代VDR-/-小鼠與VDR+/+小鼠不同組織VDR基因表達(dá)水平；*P< 0.05，**P< 0.01。圖6 F0代、F1代VDR-/-小鼠與VDR+/+小鼠不同組織中VDR轉(zhuǎn)錄水平分析Note. (a) VDR gene expression levels in different tissues of F0 generation VDR-/- mice and VDR+/+ mice. (b) VDR gene expression levels in different tissues of F1 generation VDR-/- mice and VDR+/+ mice; *P< 0.05, **P< 0.01.Figure 6 Analysis of VDR transcriptome levels in different tissues of F0 and F1 generations VDR-/- mice and VDR+/+mice

圖7 Western blot檢測F0代VDR-/-小鼠與VDR+/+小鼠不同組織中VDR蛋白表達(dá)Figure 7 Western blot detected VDR protein expression in different tissues of F0 generation VDR-/- mice and VDR+/+mice

3 討論

基因敲除是研究基因功能不可缺少的邏輯環(huán)節(jié)[14]，也是最直接的手段之一[15]，為疾病發(fā)生發(fā)展、藥物篩選以及活體和整體水平的研究提供了有力手段[16]。最近幾年來，該領(lǐng)域技術(shù)發(fā)展迅速，基因敲除模型被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。但是，敲除鼠品系建立又受敲除基因功能的限制，基因敲除小鼠的某些功能喪失，可能造成生長發(fā)育或生殖功能障礙[17]，因此不易獲得純合型后代。本研究發(fā)現(xiàn)VDR-/-小鼠互交后，大多數(shù)小鼠無子代產(chǎn)生，僅有兩只能夠產(chǎn)生子代。由此推斷，VDR基因缺失后可能影響雌雄小鼠的生殖能力，但目前機(jī)制尚不清楚，有待后期驗證。另外，采用VDR+/-互交方式，子代小鼠出現(xiàn)三種基因型：純合型(VDR-/-)、雜合型(VDR+/-)和野生型(VDR+/+)，其比例接近1∶2∶1，VDR-/-可以用于后續(xù)功能研究，VDR+/-則可用來保種。

對于VDR-/-小鼠，本研究通過qPCR技術(shù)檢測各組織中VDR基因的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)F0和F1代VDR-/-小鼠VDR轉(zhuǎn)錄水平均有明顯升高。同時，通過Western blot檢測不同組織中VDR蛋白表達(dá)情況，在各組織中未檢測到VDR表達(dá)，這一結(jié)果與本研究的預(yù)期結(jié)果一致。本研究的VDR敲除鼠品系是基于實驗室前期通過CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建的F0代VDR敲除鼠建立的，VDR敲除的機(jī)理是在VDR基因外顯子上5 bp的小片段刪除，導(dǎo)致VDR基因無義突變，無法產(chǎn)生完整有功能的VDR，因此Western blot檢測不到蛋白表達(dá)，說明VDR敲除是成功的。由于VDR敲除僅僅是5 bp小片段刪除，其轉(zhuǎn)錄機(jī)制沒有受到影響，僅僅是mRNA翻譯的提前終止，無法產(chǎn)生有功能的完整VDR，由于VDR是一個廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子，機(jī)體不同組織生理功能的發(fā)揮都需要VDR，因此生物體就會通過自身調(diào)控機(jī)制進(jìn)一步加強(qiáng)VDR基因轉(zhuǎn)錄水平，所以敲除鼠的VDR基因轉(zhuǎn)錄水平就會升高，這一結(jié)果符合生物體基因表達(dá)調(diào)控的基本原理。另外，由于不同組織對VDR的需求程度不同，不同組織之間會有差異，但具體調(diào)節(jié)機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究?；谇捌诘谋硇头治?、測序分析、qPCR和Western blot檢測結(jié)果，本研究篩選出以F0代VDR-/-10#為父本進(jìn)行VDR敲除鼠品系建立，VDR基因上5 bp的片段刪除導(dǎo)致了VDR發(fā)生無義突變，導(dǎo)致其功能的喪失，通過VDR-/-與VDR+/+，VDR+/-與VDR+/-及VDR+/-與VDR+/+不同交配模式最終建立VDR敲除鼠品系，為后續(xù)VDR功能研究提供了良好的實驗?zāi)Ｐ汀?/p>