苗雨潤，賈杰，黎曉慧，袁園，宋慶凱，張志成，李娜，代解杰

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心，云南省眼科疾病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)樹鼩標(biāo)準(zhǔn)化與應(yīng)用研究省創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，昆明 650118)

真菌性角膜炎(fungal keratitis，F(xiàn)K)是由致病性真菌感染受損角膜所引發(fā)的、致盲率極高的感染性角膜病[1]。目前臨床缺乏低毒、高效的抗真菌感染藥物，手術(shù)后真菌感染復(fù)發(fā)率高。目前FK已經(jīng)成為所有類別感染性角膜炎中最為棘手的疾病，也是治療耗費(fèi)最昂貴的角膜感染疾病之一，F(xiàn)K已經(jīng)越來越受到全球眼科醫(yī)生的關(guān)注[2-4]。

樹鼩(tree shrew,Tupaiabelangeri)，屬哺乳綱攀鼩目。樹鼩類人的眼部結(jié)構(gòu)使其在眼科學(xué)方面得到了廣泛應(yīng)用[5-6]。樹鼩的角膜結(jié)構(gòu)與人類非常相似，從前向后分為角膜上皮層、前彈力層、基質(zhì)層、后彈力層和角膜內(nèi)皮層，且各層結(jié)構(gòu)占角膜厚度的比例與人類極為相似，嚙齒類動(dòng)物所不具備此特征[7]。這表明樹鼩角膜結(jié)構(gòu)比嚙齒類更易于建立角膜炎模型。此外，有研究發(fā)現(xiàn)樹鼩與恒河猴的角膜內(nèi)皮細(xì)胞具有相似的特征，即細(xì)胞面積較均衡、變異系數(shù)小和六邊形細(xì)胞比例高等特點(diǎn)，樹鼩與恒河猴被認(rèn)是研究人類角膜內(nèi)皮疾病的理想動(dòng)物[8]。與非人靈長類動(dòng)物相比，樹鼩來源廣泛、價(jià)格低廉，在角膜疾病相關(guān)研究中具有良好的應(yīng)用前景。本研究利用樹鼩建立與人類FK病癥接近的模型，探討FK病因形成的分子機(jī)制。

甘露糖受體(mannose receptor，MR)屬于C型凝集素超家族成員，可通過胞外區(qū)識別和結(jié)合特定的糖類分子，在識別病原體、遞呈抗原和保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮作用[9-10]。巨噬細(xì)胞(Mφ)可通過MR來吞噬許多非調(diào)理素化的微生物, 包括細(xì)菌、真菌和原生動(dòng)物(protozoa)等。Mφ MR識別病原體后, 可導(dǎo)致細(xì)胞活化，誘導(dǎo)炎癥因子等細(xì)胞因子的合成。Mφ膜在肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的介導(dǎo)下可發(fā)生變形運(yùn)動(dòng), 包繞病原體或病原體感染的靶細(xì)胞，形成吞噬小體，進(jìn)而消化、殺傷病原體[11-12]。Newman等[13]發(fā)現(xiàn), 人樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DC)可通過MR特異性地識別并吞噬白色念珠菌, 并在溶酶體水解酶的作用下殺傷病原體。MR是否參與FK的發(fā)生，目前尚不清楚。本研究利用樹鼩建立FK感染模型，檢測FK發(fā)病過程中MR、IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)變化，探討FK發(fā)病的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

55只成年滇緬樹鼩，雌雄不限，年齡2～3周歲，體重110～130 g，來自由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心【SCXK(滇)K2013-0001】，實(shí)驗(yàn)在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所進(jìn)行【SYXK(滇)K2013-0001】)。所有操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求(倫理審批號：DWSP201805016)。

1.1.2 試劑與儀器

茄病鐮刀菌兩株購自美國ATCC公司：茄病鐮刀霉菌生物檢定參照物ATCC90866，茄病鐮刀霉菌生物檢定參照物MYA-3636。馬鈴薯葡萄糖瓊脂糖培養(yǎng)基(PDA，Solarbio)，馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(PDB，Solarbio)。親水性角膜接觸鏡(海昌隱形眼鏡)，妥布霉素地塞米松滴眼液(s.a. ALCON-COUVREUR n.v.)，蘇木精染料，伊紅染液，青霉素(HyClone)，鏈霉素(HyClone)，顯微操作儀(Nikon，C-DSD230)，倒置顯微鏡(Nikon，ECLIPSE)，CO2孵育箱(Forma，CO2T/C)。

1.2 方法

1.2.1 真菌孢子菌絲懸液制備

茄病鐮刀菌菌液涂布于PDA培養(yǎng)基表面，37℃培養(yǎng)3 d后置于28℃培養(yǎng)，培養(yǎng)7 d后取出，用無菌生理鹽水反復(fù)沖洗培養(yǎng)皿菌落表面，收集真菌菌絲體孢子混懸液，利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并調(diào)整至孢子數(shù)量為2×108CFU/mL(Colony Forming Unit)。

1.2.2 FK樹鼩模型的建立

55只樹鼩隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組25只，藥物對照組20只，陰性對照組10只(實(shí)驗(yàn)眼均為右眼，左眼均作為空白對照)。實(shí)驗(yàn)組樹鼩腹腔注射0.2 mL 2%戊巴比妥鈉溶液麻醉，碘伏溶液消毒眼周，無菌生理鹽水沖洗術(shù)眼眼球。用手術(shù)刀片輕輕劃傷術(shù)眼角膜表面，滴加茄病鐮刀菌菌絲孢子懸液，加蓋角膜接觸鏡后縫合。感染48 h后拆線，慶大霉素滴眼液滴眼每日1次。藥物實(shí)驗(yàn)組在此基礎(chǔ)上每隔24 h在術(shù)眼滴加妥布霉素地塞米松滴眼液。陰性對照組僅做劃傷處理，不滴加茄病鐮刀菌菌絲孢子懸液，48 h后拆線。隔日觀察動(dòng)物臨床表現(xiàn)。

1.2.3 樹鼩FK模型的評價(jià)

手術(shù)后隔日觀察角膜炎形態(tài)變化，包括①水腫大小、②感染灶大小、③有無潰瘍和新生血管、④球結(jié)膜充血程度、⑤前房炎癥反應(yīng)、⑥瞳孔大小、⑦對光反射，判斷炎癥反應(yīng)的嚴(yán)重情況。取感染不同時(shí)間段(感染3、5、7、10、14 d)的樹鼩角膜，用蘇木精-伊紅(HE)染色，制作病理切片，觀察角膜炎細(xì)胞浸潤和組織壞死情況。使用共聚焦顯微鏡觀察感染不同時(shí)間點(diǎn)的樹鼩角膜組織的炎癥病灶范圍大小及嚴(yán)重程度。

1.2.4 C型凝集素受體及炎癥因子在樹鼩FK模型中的表達(dá)變化情況

RT-qPCR法檢測感染后3、5、7、10、14 d的實(shí)驗(yàn)組和藥物組樹鼩角膜MR、dectin-1、IL-1β、IL-6、TNF-α的相對表達(dá)量。根據(jù)NCBI中樹鼩基因組序列，采用primer 5設(shè)計(jì)引物，引物序列、擴(kuò)增片段長度見表1。

1.2.5 細(xì)胞體外感染實(shí)驗(yàn)

樹鼩角膜內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)、純化并鑒定參見文獻(xiàn)[14-15]。

2×108CFU/mL茄病鐮刀菌菌絲孢子液滅活后加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)3 d，RT-qPCR檢測角膜內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞的MR、dectin-1及IL-1β相對表達(dá)量。

表1 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)所用引物序列Table 1 RT-qPCR primer sequences

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，連續(xù)變量統(tǒng)計(jì)推斷分析C型凝集素受體與炎性因子表達(dá)量，Wilcoxon配對秩和檢驗(yàn)進(jìn)行兩個(gè)配對樣本非參數(shù)檢驗(yàn)。用Mann-Whitney U檢驗(yàn)進(jìn)行兩個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)組間差異性。當(dāng)P< 0.05時(shí)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 樹鼩真菌感染角膜癥狀

實(shí)驗(yàn)組樹鼩在感染3 d后角膜水腫，結(jié)膜充血，潰瘍灶不明顯。感染5 d后，結(jié)膜充血，潰瘍灶呈異常白色。感染7 d后，潰瘍灶明顯，病情趨于轉(zhuǎn)歸。感染10 d后，樹鼩角膜局部灰白色渾濁，感染灶繼續(xù)變小，潰瘍灶不明顯。在感染14 d后，潰瘍灶已不可見(圖1)。

藥物組樹鼩比實(shí)驗(yàn)組病情更為嚴(yán)重(圖1)，平均病程時(shí)間比實(shí)驗(yàn)組樹鼩的病程長5～7 d。少數(shù)動(dòng)物在感染后感染5 d后角膜內(nèi)皮充血(圖2A)，第7天炎癥反應(yīng)加劇，全眼化膿，病癥累及基質(zhì)層(圖2B)。

2.2 角膜組織病理學(xué)檢查結(jié)果

茄病鐮刀菌感染后，樹鼩角膜結(jié)構(gòu)明顯改變。實(shí)驗(yàn)組感染后3 d，角膜細(xì)胞壞死上皮層及前彈力層內(nèi)有大量炎細(xì)胞浸潤；感染后5 d，角膜上皮組織缺損，細(xì)胞排列不規(guī)則并向角膜基質(zhì)深層蔓延，可見大量炎性細(xì)胞。感染后7 d，炎性細(xì)胞浸潤相對減少，角膜上皮有重構(gòu)趨勢，前彈力層仍有缺損。感染后14 d，上皮細(xì)胞層完成重構(gòu)，但仍存在少量炎性細(xì)胞及壞死組織，前彈力層與上皮層界限恢復(fù)周圍上皮細(xì)胞基本恢復(fù)重排。陰性對照組樹鼩角膜未見潰瘍灶，角膜結(jié)構(gòu)未發(fā)生改變。

圖1 樹鼩FK模型前段Figure 1 Photograph of the anterior segment of tree shrew fungal keratitis

圖2 樹鼩FK角膜組織前段Figure 2 Fungal keratitis in the corneal tissue anterior of tree shrew

藥物組樹鼩的角膜組織結(jié)構(gòu)改變較實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物更為明顯。藥物組動(dòng)物角膜在感染后5 d病理特征與實(shí)驗(yàn)組感染后3 d相似，前彈力層部分消失或折疊。感染后7 d角膜上皮組織缺損，可見大量多核巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞。感染后10 d角膜上皮開始重構(gòu)，前彈力層再次出現(xiàn)，炎細(xì)胞浸潤相對減少。感染后14 d，前彈力層與上皮層界限恢復(fù)。感染后18 d，上皮細(xì)胞基本恢復(fù)重排，有部分炎性細(xì)胞殘留。對照組角膜上皮和前彈力層結(jié)構(gòu)完整、細(xì)胞形態(tài)正常(圖3)。活體共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示，感染后5 d病灶已連接成塊狀區(qū)域；感染后7 d，病灶已局部由塊狀變?yōu)辄c(diǎn)狀；感染后14 d，僅可見部分炎性細(xì)胞形成的反光區(qū)域(圖4)。

2.3 茄病鐮刀菌感染樹鼩角膜組織過程中MR、dectin-1與炎癥因子表達(dá)變化

圖3 樹鼩FK病理切片F(xiàn)igure 3 Pathological section of fungal keratitis of tree shrew

IL-1β與IL-6在感染初期呈現(xiàn)較高的表達(dá)量，在感染后7 d表達(dá)量到達(dá)峰值，感染后14 d回歸正常水平；TNF-α在感染后3 d出現(xiàn)峰值表達(dá)，之后表達(dá)量逐漸降低，在感染后14 d 恢復(fù)正常水平。MR在感染后3 d、5 d有陽性表達(dá)，dectin-1在感染后5 d、7 d有陽性表達(dá)(圖5)。

藥物組感染后的MR與IL-1β表達(dá)量變化趨勢與實(shí)驗(yàn)組一致，但兩者的同期表達(dá)量顯著低于實(shí)驗(yàn)組(圖6)。

注：A.感染后3 d樹鼩角膜活體共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果；B. 感染后5 d樹鼩角膜活體共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果；C. 感染后7 d樹鼩角膜活體共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果；D. 感染后10 d樹鼩角膜活體共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果；E. 感染后14 d樹鼩角膜活體共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果；F. 空白對照組樹鼩角膜活體共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果。圖4 樹鼩FK活體共聚焦顯微鏡檢查Note. A-E. The results of tree shrew corneal confocal microscopy observations after 3, 5, 7, 10, and 14 days after infection, respectively. F. The results of confocal microscopy observation of tree shrew cornea in the blank control group.Figure 4 Tree shrew fungal keratitis observed by confocal microscopy in vivo

圖5 實(shí)驗(yàn)組樹鼩角膜組織中MR、dectin-1與炎癥因子表達(dá)變化Figure 5 Changes in expression of MR, dectin-1, and inflammatory factors in corneal tissue of experimental tree shrew

圖6 藥物組樹鼩角膜組織中MR與IL-1β的表達(dá)Figure 6 Expression of MR and IL-1β in the corneal tissue of drug group tree shrew

2.4 體外細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)

體外培養(yǎng)樹鼩角膜細(xì)胞結(jié)果見圖7，三種細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞活力未見明顯變化，三種細(xì)胞內(nèi)的MR、dectin-1與對照組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖8)。

3 討論

FK是由于真菌感染引起的一種全球性致盲性眼病，近年來我國FK患者不斷增多，在某些地區(qū)嚴(yán)重化膿性角膜炎中真菌已經(jīng)取代細(xì)菌成為首要的致病病原體[16-17]。常用的FK建模接種方法包括：角膜基質(zhì)注射法[18]、針刺法[19]、感染角膜植片法[20]、角膜劃痕法[21]、仿準(zhǔn)分子激光角膜上皮磨鑲術(shù)(LASEK)法[22]與角膜接觸鏡法[23-24]。本研究發(fā)現(xiàn)，利用角膜接觸鏡輔助法可以成功建立樹鼩FK模型。相對于豚鼠、兔及小鼠等嚙齒類模型，樹鼩FK模型有更接近于人類FK的病理表現(xiàn)及免疫特征。

注：A. 體外培養(yǎng)的樹鼩角膜內(nèi)皮細(xì)胞; B. 體外培養(yǎng)的樹鼩角膜上皮細(xì)胞; C. 體外培養(yǎng)的樹鼩角膜基質(zhì)層細(xì)胞。圖7 樹鼩角膜各層細(xì)胞的體外培養(yǎng)Note. A. In vitro-cultured tree shrew corneal endothelial cells. B. Cultured tree shrew corneal epithelial cells. C. Cultured tree shrew corneal stromal cells.Figure 7 In vitro culture of corneal cells in tree shrew

角膜接觸鏡輔助法建立的樹鼩FK模型后24～36 h出現(xiàn)癥狀，3～4 d即可發(fā)生非特異性改變，4～6 d即可出現(xiàn)典型癥狀，此時(shí)病癥表現(xiàn)最為嚴(yán)重，而在第7～10天病情開始轉(zhuǎn)歸；典型的病癥表現(xiàn)為角膜浸潤灶呈灰白色或灰色，致密，外觀干燥而表面欠光澤，呈牙膏樣或苔垢樣外觀，表面由菌絲和壞死組織形成邊界清楚的灰白色隆起病灶(菌絲苔被)，有時(shí)在角膜病灶旁可見偽足或衛(wèi)星樣浸潤灶。潰瘍周圍有膠原溶解形成的淺溝，或抗原抗體反應(yīng)形成的免疫環(huán)，為機(jī)體對真菌的抗原、抗體反應(yīng)，菌絲灶后的角膜內(nèi)皮面水腫皺折，可見灰白斑塊狀沉著物(內(nèi)皮斑)。前房積膿，呈灰白色，黏稠或呈糊狀。這與人類FK感染后發(fā)病時(shí)間與典型臨床表現(xiàn)基本是一致的[25]。病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，樹鼩建模感染后第3天可見中性粒細(xì)胞浸潤及多核巨噬細(xì)胞，第5天潰瘍層浸潤最深，說明病情在第5天最為嚴(yán)重，且病灶是由角膜上皮層純質(zhì)延伸逐漸累及前彈力層，病程發(fā)展過程中除個(gè)別病情極重的動(dòng)物，病灶基本不會(huì)擴(kuò)散累及到基質(zhì)層，這與人類外傷型FK的臨床表現(xiàn)是極為相似的。以往FK模型多利用兔及豚鼠來建立，但至今仍沒有可靠證據(jù)證明兔和豚鼠具有前彈力層，所以在真菌外傷感染形成病灶的浸潤過程在這兩種動(dòng)物模型上尚未得到與人類FK相似的證據(jù)[26]。感染第7天中性粒細(xì)胞及多核巨噬細(xì)胞聚集最多、說明樹鼩鐮刀菌性角膜炎急性炎癥高峰期在第7天，同時(shí)可見單核細(xì)胞，這與李妍等[27]報(bào)道的情況相似。

圖8 樹鼩角膜各細(xì)胞感染后MR、dectin-1與IL-1α表達(dá)情況Figure 8 The expression of MR, dectin-1, and IL-1β of corneal cells in tree shrew after infection

正常的角膜上皮具有識別病原體的能力，眼表模式識別受體(pattern recognition receptors, PRRs)主要在角膜上皮細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等細(xì)胞膜表面表達(dá)，例如MR、Dectin-1、Dectin-2、膠原凝集素和樹突細(xì)胞特異性細(xì)胞間黏附分子-3-結(jié)合非整合素(DC-SIGN)都參與抗真菌免疫過程[28]。其中MR是一種跨膜蛋白，屬于第VI組CLR，能夠識別暴露在真菌細(xì)胞壁的甘露糖殘基，激活 NF-κB，誘導(dǎo)IL-12、IL-8、IL-1β、IL-6和巨噬細(xì)胞-粒細(xì)胞集落刺激因子GM-CSF，同時(shí)可以促進(jìn)白色念珠菌感染中的抗真菌Th17型細(xì)胞免疫反應(yīng)[12]。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，MR與dectin-1在正常樹鼩角膜組織中沒有表達(dá)或僅有微量表達(dá)，但在受到真菌刺激后可以激活其表達(dá)，在感染3 d后，樹鼩角膜組織中MR有為期2～3 d的高拷貝數(shù)陽性表達(dá)，一般在感染后5 d時(shí)表達(dá)量到達(dá)峰值，dectin-1在感染后5～7 d也有高拷貝數(shù)的陽性表達(dá)，伴隨著IL-1β與IL-6的表達(dá)量達(dá)到峰值，推測MR與dectin-1在后續(xù)的固有免疫應(yīng)答階段行使抗原識別的作用上調(diào)Th1型細(xì)胞炎性因子的表達(dá)而參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。此外，TNF-α在感染初期即出現(xiàn)峰值表達(dá)，隨后表達(dá)量一直處于下調(diào)狀態(tài)，說明TNF-α可能在FK病程初期的非特異性免疫中起到重要作用，由病理切片結(jié)果可以推測，此時(shí)的TNF-α可能主要由角膜上皮病灶上的多核巨噬細(xì)胞分泌。

樹鼩角膜上皮與角膜內(nèi)皮經(jīng)真菌刺激后表達(dá)dectin-1與MR，但并不能產(chǎn)生IL-1β，提示FK的發(fā)生可能仍需要免疫系統(tǒng)的參與調(diào)節(jié)，這與有學(xué)者利用局部使用強(qiáng)效免疫抑制劑環(huán)孢素A的方法來治療FK一致[29]。免疫系統(tǒng)既可以參與FK的機(jī)體免疫防御，而其過表達(dá)又會(huì)引起過度的炎癥反應(yīng)而加重病情。尋找免疫反應(yīng)強(qiáng)度與炎癥控制之間的平衡點(diǎn)可能有助于FK的臨床治療。此外，調(diào)節(jié)病患自身的免疫能力與免疫相關(guān)分子表達(dá)水平也許能為FK的治療提供新的思路。