秦波音，王超，任曉楠，譚丹，陳麗香，方鐘，李順，周曉輝

(復(fù)旦大學(xué)附屬公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508)

隨著每年的流感流行，流感已成為人類面臨的主要公共衛(wèi)生問題之一。每年約15%的全球人口因流感病毒感染而導(dǎo)致嚴重的發(fā)病率和死亡率[1-2]。從1918年西班牙大流感(H1N1亞型)引起約5000萬人的死亡，到1968年香港流感(H3N2型)造成約100萬人的死亡，直至2009年首次出現(xiàn)在墨西哥(甲型H1N1型)后在多國迅速流行，造成約1萬人死亡[3-4]。甲型流感病毒的感染已對人類健康產(chǎn)生極大的威脅并造成了巨大的經(jīng)濟損失。深入探究甲型流感病毒感染致病機制，對抗流感病毒疫苗和藥物的研發(fā)具有重要意義。

甲型流感病毒的感染可引起嚴重的急性肺炎，這種原發(fā)性病毒性肺炎可能會導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)，這是一種高死亡風(fēng)險的呼吸綜合征。許多宿主因素與流感感染引起的ARDS有關(guān)，其中“細胞因子風(fēng)暴”是機體天然免疫反應(yīng)失調(diào)而引起ARDS的一個關(guān)鍵因素[5-7]。近期的研究表明，細胞死亡特別是細胞壞死可導(dǎo)致肺支氣管上皮的嚴重退化，雖然在一定程度上控制了病毒的復(fù)制，但如引發(fā)起過度炎癥反應(yīng)則是嚴重的病理病變和高死亡率發(fā)生的重要原因[8-10]。

細胞程序性壞死關(guān)鍵調(diào)控分子RIP3參與流感感染后的確切作用還有待探討。本研究通過H1N1 PR8流感病毒分別感染RIP3-/-小鼠和C57BL/6小鼠，結(jié)果顯示RIP3-/-組小鼠生存率顯著提高，兩組小鼠病毒學(xué)方面雖無明顯差異，但RIP3-/-組小鼠的病理改變和炎癥應(yīng)答較對照組減輕。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒

H1N1病毒株A/ Puerto Rico/8/34 (簡稱PR8)，由中國科學(xué)院上海巴斯德研究所孟廣勛教授惠贈。流感病毒通過雞胚和MDCK細胞培養(yǎng)滴定后，-80℃放置備用，病毒感染實驗均在上海市公共衛(wèi)生臨床中心內(nèi)的動物生物安全二級實驗室(ABSL-2)中開展。

1.1.2 實驗動物及分組

SPF級6～7月齡C57BL/6小鼠和RIP3-/-(C57BL/6背景)小鼠共44只，雌雄各半。C57BL/6小鼠來源于上海市(復(fù)旦大學(xué)附屬)公共衛(wèi)生臨床中心實驗動物部【SCXK(滬)2015-0002】，RIP3-/-小鼠由北京生命科學(xué)研究所王曉東院士惠贈，兩品系小鼠均飼養(yǎng)于上海市(復(fù)旦大學(xué)附屬)公共衛(wèi)生臨床中心實驗動物部SPF區(qū)域【SYXK(滬)2015-0008】中。病毒感染前一天將小鼠轉(zhuǎn)移到ABSL-2。實驗共分為4組：RIP3-/-小鼠解剖組(A組)12只、RIP3-/-小鼠生存曲線組(B組)10只、C57BL/6小鼠解剖組(C組)12只和C57BL/6小鼠生存曲線組(D組)10只。所有操作均符合實驗動物倫理學(xué)要求(倫理審批號：IACUC2018-A044-02)。

1.1.3 實驗試劑

DMEM培養(yǎng)液(Gibco，1868707)，異氟烷(上海雅培制藥有限公司，B506)，多聚甲醛固定液(武漢谷歌生物科技有限公司，163307)，Total RNA抽提試劑盒 (QIAGEN GmbH，52906)，One-Step SYBR PrimeScriptPLUS RT-PCR kit (Perfect Real Time，RR096A)，MS INFLAMMATION CBA KIT(BD，552364)。

1.1.4 實驗儀器

CO2培養(yǎng)箱(3111，Thermo，美國)，勻漿機分散機(607EUR，Biospec，美國)，冷凍離心機(Micro 17R，Thermo，美國)，精密高溫干燥箱(DHG-9070C，上海之信儀器有限公司，中國)，熒光定量PCR儀(ViiA7，ABI，美國)，超微量分光光度計(K5600，北京凱奧科技發(fā)展有限公司，中國)，流式細胞儀(LSR Fortessa，BD公司，美國)。

1.2 方法

1.2.1 感染方法和樣本采集

將4組實驗小鼠分別標記稱重，小鼠經(jīng)異氟烷麻醉后，用40 μL含5.25×103TCID50PR8的DMEM病毒液滴鼻感染，將流感病毒液通過小鼠的一個鼻孔緩慢滴入，至完全吸收，滴鼻動作過程需輕柔。感染完成后將小鼠放回獨立送風(fēng)隔離籠具(IVC)中正常飼養(yǎng)。感染后14 d內(nèi)，每天觀察小鼠狀態(tài)并進行體重稱量,記錄小鼠生存情況(若體重下降大于等于25%則記為倫理死亡)，在感染后第3、7天分別處死A組和C組小鼠各6只(3雄/3雌)。取整個肺組織稱重并拍照，左葉肺4%多聚甲醛固定，剩下肺分裝后速凍于液氮，轉(zhuǎn)移保存于-80℃冰箱待用。小鼠體重變化計算：根據(jù)每日體重變化，計算體重變化率=(感染后當(dāng)天體重-0 d體重)/0 d體重×100%，小鼠肺指數(shù)計算：根據(jù)處死小鼠的肺濕重和體重計算肺指數(shù),肺指數(shù)=小鼠的肺重/小鼠的體重×100%[11]。

1.2.2 qRT-PCR 檢測肺病毒載量

取右葉部分肺組織，以0.05 g肺組織/500 μL PBS 的比例勻漿。使用Total RNA抽提試劑盒抽提肺組織中的總RNA，抽提產(chǎn)物用超微量分光光度計測定核酸濃度和吸光度值(A260/280為1.90～2.25)。將抽提好的RNA用One-Step SYBR RT-PCR kit進行肺病毒載量檢測。采用實驗室建立的檢測方案[11]，擴增體系為25 μL: TaqMan PCR基礎(chǔ)液12.5 μL，引物10 μmol/ L，RNA模板2.5 μL。按照以上體系加樣后，通過熒光定量PCR儀進行擴增。擴增程序為：42℃ 10 min；95℃ 1 min；95℃ 15 s，60℃ 45 s，45個循環(huán)。管家基因3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)的上游引物:(5′-AGGTCGGTGAACGGATTTG-3′);下游引物: (5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′)。流感病毒的上游引物: (5′-AAGACCAATCCTGTCACCTCTGA-3′); 下游引物: (5′-CAAAGCGTCTACGCTGC AGTCC-3′)。根據(jù)2-ΔΔCt的方法計算組織總RNA中的相對病毒載量。

1.2.3 CBA檢測細胞因子

相關(guān)炎性細胞因子的檢測均嚴格參照流式微珠陣列術(shù)(BD CBA Mouse Inflammation Kit，美國)說明書進行操作。

1.2.4 肺組織病理檢測

取實驗小鼠肺左葉，置于4%多聚甲醛溶液中進行固定，石蠟包埋，常規(guī)HE染色后，光鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 RIP3缺失對小鼠體重和死亡率的影響

流感病毒感染后，每日稱重，觀察小鼠狀態(tài)并記錄小鼠死亡情況。WT組和RIP3-/-組小鼠分別在攻毒后第2天和第3天起活動開始減少，反應(yīng)遲鈍。第3天后，兩組小鼠均出現(xiàn)豎毛蜷縮、厭食和體重迅速下降。第7天后WT組小鼠出現(xiàn)弓背死亡，兩組小鼠體重下降至第8～9天開始逐漸恢復(fù)。第3天后，兩組小鼠的體重降低比率為：WT組> RIP3-/-組，但兩組小鼠體重總體改變趨勢差異無顯著性，均為感染后前8天體重逐漸降低，第8天后體重開始逐漸恢復(fù)(圖1)。WT組小鼠第7天出現(xiàn)死亡，至第14天時，其死亡率為87.5%，RIP3-/-組小鼠第9天出現(xiàn)死亡，至第14天時，其死亡率為50%，故RIP3-/-組小鼠死亡率顯著低于WT組(P< 0.05，圖2)。提示RIP3的缺失可降低小鼠死亡率。

圖1 攻毒后小鼠體重變化百分率Figure 1 The body weight change ratio of the mice after virus inoculation

注：WT組與RIP3-/-組相比差異有顯著性，*P< 0.05。圖2 攻毒后小鼠生存率Note. Significant difference between the groups of WT and RIP3-/- mice, *P< 0.05.Figure 2 Survival rates of the mice after virus inoculation

2.2 RIP3缺失對病毒載量和肺指數(shù)的影響

在感染后第3、7天分別對兩組小鼠進行解剖取材。取整個肺組織測得肺指數(shù)，用肺勻漿上清進行病毒載量分析。結(jié)果顯示兩組小鼠病毒載量在第3天和第7天無明顯差異。而從肺指數(shù)上看，兩組小鼠第7天比第3天肺炎癥都嚴重，但差異均無顯著性(圖3)?？梢?，流感病毒PR8感染后，RIP3的缺失對病毒載量和肺指數(shù)基本無影響。

2.3 RIP3缺失對小鼠肺組織病理學(xué)損傷

圖4 RIP3-/-和WT小鼠肺大體病理改變(肉眼觀察)Figure 4 Gross appearance of the lungs of RIP3-/- and WT mice (unaided viewing)

在感染后第3、7天分別對兩組小鼠肺組織取材發(fā)現(xiàn)，肉眼可見兩組小鼠均出現(xiàn)不同程度的肺病理改變并伴有充血現(xiàn)象。感染后第3天，WT組小鼠肺病變范圍達10%～20%，RIP3-/-組小鼠未見顯著病變；感染后第7天，兩組小鼠均較第3天充血嚴重，但WT組小鼠肺病變范圍達70%～80%，而RIP3-/-組只有30%～40%(圖4)。HE染色鏡下觀察(圖5)：兩組小鼠感染后第7天病理損傷均比第3天嚴重：肺泡間隔增寬，肺炎癥細胞浸潤增加。而同一時間點，RIP3-/-組小鼠較WT組小鼠病理損傷較輕，在感染后第3天，RIP3-/-組較WT組肺泡結(jié)構(gòu)完整，炎癥細胞浸潤較少；感染后第7天，WT組肺間隔增寬顯著，肺泡結(jié)構(gòu)明顯破壞, 肺實變明顯，肺泡壁毛細血管擴張充血出血，而RIP3-/-組小鼠則相比損傷較輕。表明流感病毒PR8感染后, RIP3-/-的缺失可減少小鼠肺組織病理損傷。

2.4 RIP3缺失對炎癥因子釋放的影響

為研究RIP3信號通路在小鼠感染PR8后，在誘導(dǎo)機體產(chǎn)生炎癥細胞因子中發(fā)揮的作用。用CBA實驗對感染后第3、7天的WT和RIP3-/-小鼠肺組織勻漿中相關(guān)細胞因子進行檢測。發(fā)現(xiàn)感染后第3天，TNF-α在RIP3-/-小鼠中顯著減少(P< 0.05)，感染后第7天，IFN-γ在RIP3-/-組小鼠中顯著增多(P< 0.05)，而IL-6、MCP-1水平在兩個時間點則均未達到統(tǒng)計學(xué)差異(圖6)。

圖3 攻毒后小鼠肺病毒載量和肺指數(shù)Figure 3 Viral loads and lung weight body weight ratios in the WT and RIP3-/- mice after virus inoculation

注：B箭頭表示肺泡間隔顯著增厚，有大量血細胞滲出；F箭頭表示肺泡結(jié)構(gòu)完全破環(huán)，炎性細胞大量浸潤。圖5 WT和RIP3-/-小鼠肺的病理改變(HE染色)Note. B. Arrow indicates significant thickening of the alveolar septum with numerous blood cells. F. Arrow represents complete breakdown of the alveolar structure with infiltration of a large number of inflammatory cells.Figure 5 Histopathological changes in the lung tissues of WT and RIP3-/- mice (HE staining)

注：WT組與RIP3-/-組相比差異有顯著性，*P< 0.05。圖6 PR8攻毒后小鼠細胞因子應(yīng)答Note. Significant difference in cytokines of the groups of WT and RIP3-/- mice, *P< 0.05.Figure 6 Levels of different cytokines in the WT and RIP3-/- mice after infection of PR8 influenza virus

3 討論

甲型流感病毒(IAV)是一種帶有負股、單鏈、分節(jié)的RNA基因組的包膜病毒，它是禽類和哺乳動物中流感病毒的主要病原體。急性IAV感染伴隨著被感染的肺原發(fā)性上皮細胞和成纖維細胞的溶解，以及在體內(nèi)呼吸道上皮細胞的破壞。在病毒復(fù)制的生命周期或?qū)υ摬《镜拿庖邞?yīng)答中，宿主細胞起到重要的作用[10,12]。有報道指出，細胞死亡例如細胞凋亡，可能是一種宿主防御機制，限制病毒在感染早期的傳播和宿主的免疫病理[13]。

真核細胞的死亡機制包括細胞凋亡(apoptosis)、自噬(autophagy)和壞死(necrosis)。凋亡一般不引起炎癥，而壞死與自噬則可能導(dǎo)致炎癥。壞死的形態(tài)學(xué)特點明顯異于前兩者，表現(xiàn)為細胞膜和細胞核溶解，細胞內(nèi)容物外溢，常伴隨炎癥的發(fā)生。而近些年的研究表明，在一定條件下細胞壞死也有信號通路參與調(diào)控，稱為程序性壞死(necroptosis或programmed necrosis)。2009年，Cho[14]和Zhang[15-16]等先后發(fā)表3篇報道，揭示了受體相互作用蛋白激酶(receptor-interacting proteins, RIPs)參與調(diào)控細胞壞死的分子機制。RIPs家族成員中RIP1和RIP3可通過RHIM基序(RIP homotypic interaction motif)相互作用，二者相互結(jié)合及相互磷酸化對程序性壞死起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。

近期研究表明，在體內(nèi)無節(jié)制的細胞壞死可導(dǎo)致肺支氣管上皮的嚴重退化，盡管一定程度上控制了流感病毒的復(fù)制，但還是增加了宿主的死亡率[17]。此外，一些高致病性的H1N1和H5N1型甲型流感病毒感染后，宿主對這些毒株的過度免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)是引起嚴重的病理病變和高死亡率的重要原因[8-10]。雖然有研究報道：Shoko Nogusa等[18]用4000 EID50(雞胚半數(shù)感染量)的H1N1 PR8對RIP3-/-和WT小鼠進行接種研究，該研究認為細胞程序性壞死關(guān)鍵分子RIP3在IAV感染后，RIP3驅(qū)動的細胞死亡和炎性小體激活并共同作用，可消除受感染細胞從而限制病毒傳播，提示RIP3在機體對抗IAV中起到保護作用。

但本研究中使用細胞培養(yǎng)擴增來源的H1N1 PR8(5.25×103TCID50)感染6～7月齡的RIP3-/-和WT組小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RIP3-/-組小鼠生存率顯著高于WT組小鼠，且WT組小鼠第8天出現(xiàn)死亡，而RIP3-/-組小鼠第9天才出現(xiàn)死亡。影響生存率因素主要為以下兩方面：病毒方面因素及宿主自身的免疫應(yīng)答方面。本研究對感染小鼠后第3天和第7天肺病毒載量、肺組織病理及肺炎癥應(yīng)答作了進一步檢測。結(jié)果顯示，兩組小鼠的病毒載量并無顯著性差異；但RIP3-/-組小鼠的肺組織大體病理表現(xiàn)明顯輕于WT組小鼠，而HE顯示炎癥病理也輕于WT組，這表明RIP3-/-組小鼠的肺炎癥及損傷較WT組顯著減輕。提示造成高死亡率及嚴重體重損失很可能與體內(nèi)的高炎癥應(yīng)答有關(guān)，而并非受病毒因素的影響。細胞因子檢測顯示，RIP3-/-組小鼠肺內(nèi)部分炎性細胞因子(TNF-α)產(chǎn)生的減少，與炎癥病理減輕表形一致；而第7天時RIP3-/-組分泌的IFN-γ顯著高于WT組，但具體機制尚不清楚。IFN-γ是一類具有免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)的細胞因子，它的產(chǎn)生在病毒入侵后可以限制病毒的復(fù)制，并增強宿主免疫對機體發(fā)揮保護作用。

有研究報道，在LPS誘導(dǎo)的細胞炎癥模型中，RIP3缺失的骨髓來源的巨噬細胞和樹突狀細胞均不能產(chǎn)生炎性細胞因子[19-20]，揭示了RIP3介導(dǎo)的程序性壞死在促炎細胞因子產(chǎn)生中的促進作用。但炎癥是一把雙刃劍。根據(jù)Shoko Nogusa等的研究及本文的實驗結(jié)果，我們推測由于在RIP3-/-組小鼠中，程序性壞死信號通路在關(guān)鍵分子RIP3敲除后，壞死通路被抑制，從而減少了促炎性細胞因子的產(chǎn)生，而擁有完整壞死通路的WT組則促發(fā)了大量炎性細胞因子的產(chǎn)生。炎癥可以限制病毒復(fù)制，起到一定保護作用；但炎癥過度的情況下也會導(dǎo)致宿主的炎癥病理損傷，從而引起高病死率。本研究報道了與Shoko Nogusa等不一致的結(jié)果，可能是由于病毒來源不同(雞胚來源或細胞培養(yǎng)來源)、病毒滴度高低不同(需用同一方法滴定才能比較)、小鼠月齡不同，導(dǎo)致炎癥處于不同的狀態(tài)，從而導(dǎo)致不同的結(jié)局。

總之，在本研究實驗條件下，觀察到RIP3介導(dǎo)的程序性壞死信號通路在流感病毒H1N1 PR8引起的急性感染中起到一定的炎癥病理作用。深入探討RIP3介導(dǎo)的程序性壞死信號通路在流感病毒中的作用有助于揭示其致病機制，從而可能為研發(fā)臨床治療流感病毒感染的新藥提供潛在的靶標。