張瀚丹，宋天章，楊柳萌，鄭永唐*

(1. 大理大學藥學與化學學院，云南大理 671000； 2. 中國科學院昆明動物研究所、云南省活性多肽研究與利用重點實驗室/中國科學院動物模型與人類疾病重點實驗室，國家昆明高等級生物安全靈長類動物實驗中心，昆明 650223)

人類免疫缺陷綜合征(acquirid immunodeficiency syndrome，AIDS)，簡稱艾滋病，是由人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染引起的一種嚴重致死性傳染病。目前，全球年均HIV新發(fā)感染者可達210萬人，且每年約有110萬人死于艾滋病引起的各種相關性疾病。根據艾滋病患者的臨床表現，可將整個病程分為3個時期：(1)急性感染期：通常出現在HIV初次感染后2～4周，患者常無特異性臨床表現，可表現為持續(xù)發(fā)熱、腹瀉、皮疹等癥狀；(2)無癥狀期：無明顯臨床表現，部分患者出現腹股溝等部位淋巴結腫大等癥狀，高效抗逆轉錄病毒治療(highly active antiretroviral therapy, HAART)可使患者長期停留于無癥狀期，從而有效延長艾滋病患者壽命；(3)艾滋病期：患者表現出典型的艾滋病相關消瘦綜合征，并且出現多種機會性感染及腫瘤，最終死亡。艾滋病患者體重下降是艾滋病疾病進展的重要表現，是艾滋病期的典型特征，與艾滋病患者的預后及死亡率變化密切相關。趙曉梅等[1]對HIV感染者的流行病學研究中顯示，HIV感染者的體重既有減低，也有升高。急性感染期HIV感染引起的體重變化及相關機制依然不明確且鮮見研究報道。

持續(xù)炎癥反應、脂類代謝異常及葡萄糖代謝異常是誘發(fā)體重變化的3大主要原因。首先，以TNF-α、IL-6為主的多種促炎細胞因子的持續(xù)存在，通過多種機制影響體重變化。TNF-α可以通過旁分泌或自分泌的方式作用于脂肪細胞，抑制脂肪細胞分化為成熟脂肪細胞，繼而促進脂肪細胞凋亡及分解[2]，減少機體脂肪蓄積。Hotamisligil等[3]研究發(fā)現：肥胖患者多伴有IL-6等多種促炎細胞因子誘導的全身持續(xù)性低度炎癥反應；Mohamed等[4]研究表明，脂肪組織分泌大量的IL-6，其含量與肥胖程度呈正相關。脂代謝異常是誘導體重變化的另一重要因素。脂代謝異常常見于肥胖患者，主要表現為血液中總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-CH)和甘油三酯(TG)升高，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-CH)降低[5]。高蛋白、高脂肪、高能量的“三高”飲食的過量攝入，會引起高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥以及低密度脂蛋白膽固醇升高，加速體重增加[6]。隨著肥胖程度的增加，血脂異常率也逐步遞增[7]，大量的內臟脂肪堆積產生脂解作用，使游離脂肪酸釋放增多或脂蛋白脂肪酶的活性改變，導致TG、TC及LDL-CH合成增加[8]。因此，TG等的升高可作為體重增加的預測因素。第三，以糖尿病患者為代表的糖代謝異常表現對體重變化的誘導也具有重要影響。胰島素抵抗現象導致血糖無法被有效利用，從而引起體重下降。同時，為了維持血糖的穩(wěn)定，II型糖尿病患者可代償性的分泌大量胰島素，過多的胰島素從血漿轉運到中樞神經系統(tǒng)，作為調節(jié)肥胖的負反饋信號，減少食物攝取并使體重減輕[9]。

本實驗室首先建立了艾滋病北平頂猴實驗動物模型[10]，在SIVmac239感染后可有效地模擬人HIV感染相關的臨床表現，模型感染急性期病毒載量及CD4+T細胞數量變化與HIV感染者急性期變化基本一致。因此，本實驗選用SIVmac239感染的北平頂猴為研究對象，探討急性期體重變化的原因及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

雄性北平頂猴購于中國科學院昆明動物研究所靈長類研究中心【SCXK(滇)K2017-0003】。實驗動物飼養(yǎng)于中國科學院昆明動物研究所靈長類研究中心【SYXK(滇)K2017-0008】，單獸籠飼養(yǎng)，保證標準光照周期(12 h光明，12 h黑暗)，給予標準飼料及蘋果等瓜果類喂養(yǎng)。根據北平頂猴感染后17周內體重變化，分別挑選出3只體重變化最明顯的北平頂猴作為體重增加組與體重減少組。本研究中所涉及的一切實驗規(guī)程均獲得中國科學院昆明動物研究所倫理委員會的批準(批準號：2015SYDW-2015021)。

1.1.2 實驗儀器

ELX-800酶標儀(BioTek，美國)；37℃恒溫箱(上海齊欣，中國)；Cobas 8000全自動生化免疫分析儀(Roche，瑞士)；定量PCR儀(ABI ViiATM7 Real-Time PCR System, 美國)；超低溫冰箱(Haire, 中國)。

1.1.3 實驗試劑

鹽酸氯胺酮注射液(江蘇中牧)；氯化鈉注射液(昆明南疆)；猴IL-6、TNF-α、胰島素ELISA檢測試劑盒(江蘇雨桐，F4483B、F4490B、F6249A)；Diethylpyrocarbonate(AMRESCO，E174)；High Pure Viral RNA Kit(Roche, 11858882001)；RNA-directTMRealtime PCR Master Mix(toyobo, QRT101)。

1.2 方法

1.2.1 SIVmac239病毒接種

0.2 mL/kg鹽酸氯胺酮注射液肌肉注射麻醉，待動物徹底麻醉后，0.9%氯化鈉注射液將病毒稀釋為2000 TCID50/mL，下肢脛后靜脈接種2 mL。

1.2.2 動物血漿分離及體重稱量

北平頂猴夜間禁食，12 h后于次日清晨采血。0.2 mL/kg鹽酸氯胺酮注射液肌肉注射麻醉，待動物徹底麻醉后，進行體重稱量，下肢脛后靜脈抽取靜脈血至含EDTAK2的真空管，1500 r/min離心15 min，吸取上層血漿，分裝后于-80℃凍存。抽血后2 h內完成血漿分離及樣品凍存。

1.2.3 ELISA方法檢測IL-6、TNF-α、胰島素

分別采用猴IL-6、TNF-α、胰島素ELISA 檢測試劑盒測定血漿中IL-6、TNF-α、胰島素含量。按照試劑盒說明書操作，酶標儀于波長450 nm 處檢測樣品的吸光度值，根據標準曲線計算樣品的IL-6、TNF-α及胰島素濃度。

1.2.4 血脂四項、血糖檢測及胰島素抵抗

采用Cobas 8000全自動生化免疫分析儀檢測血漿總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇和血糖。穩(wěn)態(tài)模型評估胰島素抵抗指數(HOMA-IR)是目前使用最廣泛的用于評價胰島素敏感性、胰島素抵抗水平的指標，用于評價感染前后北平頂猴胰島素抵抗水平。HOMA-IR=空腹血糖(mmol/L)×空腹胰島素(mU/L)/22.5。

1.2.5 Real-time PCR檢測血漿中病毒載量

按High Pure Viral RNA Kit中的實驗步驟提取血漿中總RNA：向1.5 mL RNase free Eppendorf管中加入400 μL binding buffer，2 μL poly (A) carrier RNA，再加入200 μL血漿，震蕩混勻，室溫下保持10 min；轉移到過濾柱內，9342 r/min離心20 s；棄去收集管及其中的液體，換上新收集管，加入500 μL inhibitor removal buffer, 9342 r/min 離心1 min；棄去收集管及其中的液體，換上新收集管，加入450 μL洗滌緩沖液，9342 r/min 離心1 min，重復1次；棄去收集管，將過濾柱放到新收集管，11 908 r/min 離心10 s；棄去收集管，換上1.5 mL RNase free Eppendorf管，開口在生物安全柜放置10 min；加入50 μL Elution Buffer，9342 r/min 離心1 min，得到RNA。利用RNA-directTMRealtime PCR Master Mix進行Real-time PCR。SIV引物參照本實驗室以往研究[11]，引物序列為：5′-TCGGTCTTAGCTCCATT AGTGCC-3′ (上游)， 5′-GCTTCCTCAGTGTG TTTCACTTTC-3′ (下游)和5′-CTTCTGCGTG AATGCACCAGATGACGC-3′ (探針)，由寶生物工程(大連)有限公司合成。利用美國ABI公司ViiATM7實時熒光定量PCR儀完成檢測，反應條件為：90℃，30 s；61℃，21 min；95℃，30 s；95℃，15 s，60℃，1 min，進行 45個循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計學方法

所得數據采用GraphPad Prism 6.02軟件處理，組間比較采用t檢驗，P< 0.05時認為差異具有統(tǒng)計學意義，運用Pearson分析進行線性相關分析。

2 結果

2.1 北平頂猴體重變化及分組

納入實驗的北平頂猴基本信息如表1。12只北平頂猴均為雄性，年齡8～10歲，感染前進行3個月的適應性飼養(yǎng)，期間無明顯體重變化。部分實驗動物偶爾出現腹瀉癥狀，但是對于實驗動物體重，進食等并無影響。根據實驗動物個體感染前體重，進行感染后體重變化比率的分析。如圖1所示，感染第17周體重變化大于4%的個體分別納入體重增加組(weight increase group)和體重減少組(weight decrease group)。體重增加組北平頂猴編號為：08267、08327、09219；體重減少組北平頂猴編號為：08275、09221、09239。

表1 雄性北平頂猴信息Table 1 Information on the male northern pig-tailed macaques

圖1 體重增加組及體重減少組北平頂猴SIVmac239感染急性期體重變化Figure 1 Weight changes in the weight increase group and the weight decrease group in the northern pig-tailed macaques in acute stage of SIVmac239 infection

圖2 SIVmac239感染北平頂猴急性期血漿TNF-α (A)和IL-6 (B)變化Figure 2 Changes of plasma TNF-α (A) and IL-6 (B) in the northern pig-tailed macaques in acute stage of SIVmac239 infection

2.2 血漿IL-6和TNF-α變化

血漿IL-6和TNF-α是評價急性全身性炎癥反應的重要指標，也是引起脂肪代謝變化繼而引起體重變化的關鍵因子。如圖2所示，SIVmac239感染前后，兩組實驗動物IL-6及TNF-α水平基本保持一致。血漿TNF-α感染后似乎有上升趨勢，但并無統(tǒng)計學差異。此外，體重增加組與體重減少組相比，血漿IL-6及TNF-α水平在各時間點均無統(tǒng)計學差異。

2.3 血漿TC、TG、HDL-CH和LDL-CH變化

血脂四項是評價機體脂類代謝的重要指標。如圖3所示，SIVmac239感染急性期，體重增加組與體重減少組實驗動物血漿TC、TG、HDL-CH和LDL-CH均未出現明顯變化。兩組相比，血漿TC、TG、HDL-CH、LDL-CH也無明顯差異。但是，感染前體重減少組LDL-CH水平明顯低于體重增加組，具體原因尚不明確。

注：A. 膽固醇；B. 三酰甘油；C. 低密度脂蛋白膽固醇；D. 高密度脂蛋白膽固醇。圖3 SIVmac239感染北平頂猴急性期的血漿血脂變化Note. A. cholesterol; B. triglyceride; C. low-density-lipoprotein cholesterol; D. high-density-lipoprotein cholesterol.Figure 3 Changes of plasma lipid level in the northern pig-tailed macaques in acute stage of SIVmac239 infection

注：A. 胰島素濃度變化；B. 胰島素抵抗指數(HOMA-IR)變化。圖4 SIVmac239感染北平頂猴急性期的葡萄糖代謝變化Note. A. Changes of insulin concentration; B. Changes of insulin resistance index (HOMA-IR).Figure 4 Changes of glucose metabolism in the northern pig-tailed macaques in acute stage of SIVmac239 infection

2.4 葡萄糖代謝變化

與感染前相比，SIVmac239感染后，體重增加組及體重減少組均出現明顯的血漿胰島素水平變化。體重減少組感染后第1.5、5及11周血漿胰島素水平明顯升高，第17周血漿胰島素水平恢復正常(圖4A)。與之相比，體重增加組感染后血漿胰島素水平明顯下降。通過HOMA-IR指數分析顯示(圖4B)，體重減少組在感染后第1.5、5及11周胰島素抵抗指數明顯增加，感染后體重增加組胰島素抵抗指數無明顯增加。

2.5 北平頂猴血漿病毒載量

對北平頂猴血漿病毒載量進行長期監(jiān)測發(fā)現(圖5)：感染后病毒載量持續(xù)升高，并于第2～3周達到峰值，兩組之間無明顯差異。隨后體重增加組血漿病毒載量持續(xù)下降，并于感染后第11周，血漿病毒載量小于103copies/mL。與之相比，體重減少組感染后第3～5周，血漿病毒載量出現明顯下降；第5周后，血漿病毒載量較為穩(wěn)定，感染后第11周，體重減少組病毒載量大于5×103copies/mL。

圖5 SIVmac239感染北平頂猴急性期的病毒載量Figure 5 Plasma viral load in the northern pig-tailed macaques in acute stage of SIVmac239 infection

2.6 病毒載量與胰島素抵抗相關性分析

通過對SIVmac239感染后第5周和第11周的北平頂猴血漿胰島素抵抗水平與血漿病毒載量的相關性分析發(fā)現：北平頂猴感染第5周、第11周時，其胰島素抵抗水平與病毒載量呈正相關(r值分別為0.8571、0.8426；P值分別為0.0081、0.0098)，胰島素抵抗現象隨著血漿病毒載量的增加而增強(圖6)。

圖6 SIVmac239感染北平頂猴后第5周(A)和第11周(B)病毒載量與胰島素抵抗相關性分析Figure 6 Correlations between plasma viral load and insulin resistance at the 5th week (A) and 11th week (B) after SIVmac239 infection in the northern pig-tailed macaques

3 討論

本研究顯示，SIVmac239感染急性期，北平頂猴個體之間體重變化差異明顯，體重明顯增加及減少的實驗動物個體均存在。體重減少組與體重增加組血漿TNF-α、IL-6以及血脂四項無明顯變化。有趣的是，兩組實驗動物均出現明顯的葡萄糖代謝異常表現。體重增加組感染后胰島素水平下降；而體重減少組表現出明顯的血漿胰島素水平升高，并伴有顯著的胰島素抵抗現象。

Taylor等[12]研究發(fā)現進入艾滋病期的HIV感染者，其體重下降與IL-6水平升高明顯相關。Wig等[13]發(fā)現AIDS患者的血漿TNF-α濃度與艾滋病長期消瘦有重要聯系。HIV感染急性期，CD4+T細胞大量消耗及腸道黏膜損傷導致的微生物易位共同引起全身性的反應，誘導IL-6和TNF-α等炎癥因子的產生[14]。然而，在本研究中，北平頂猴SIVmac239感染急性期，體重增加組與體重減少組的血漿IL-6和TNF-α水平無明顯差異，表明它們不是導致SIV感染急性期北平頂猴體重變化的原因。此外，Willig等[15]發(fā)現AIDS患者體重受血脂異常的影響。HIV感染慢性期，患者出現TC、LDL-CH和HDL-CH的降低并伴有TG的升高[16]。長期HAART治療也會引起脂類代謝異常及再分布的現象。本研究中，SIVmac239急性感染期北平頂猴血漿TC、TG、HDL-CH及LDL-CH與感染前相比均無明顯差異。因此，SIVmac239感染急性期，北平頂猴脂類代謝并不對其體重變化造成影響。

胰島素是由胰島β細胞分泌的一種多肽類激素，是誘導血糖下降的唯一激素，與體重控制之間存在著直接聯系。SIVmac239感染急性期，體重增加組與體重減少組北平頂猴胰島素出現不同的變化趨勢。體重增加組的胰島素明顯減少，這與Noumegni等[17]發(fā)現AIDS患者胰島素水平降低導致體重增加相一致，但具體原因尚不明確。此外，Guillen等[18]在對秘魯感染HIV的成年人研究中發(fā)現，AIDS患者的HOMA-IR指數與體重指數之間存在相關性。本研究也同樣發(fā)現，體重減少組血漿胰島素水平明顯升高，HOMA-IR指數明顯增加，出現胰島素抵抗表現。因此，葡萄糖代謝異常是SIVmac239感染北平頂猴急性期導致體重變化的主要因素。

胰島素的信號轉導主要通過磷脂酰肌醇-3-激酶(PI-3K)途徑?；罨倪^氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPAR-γ)能夠促進PI-3K亞單位p85的表達，并在轉錄水平增加c-Cb1相關蛋白(CAP)，從而促進信號轉導，改善胰島素抵抗[19]。然而，HIV復制過程中輔助蛋白Vpr可通過抑制PPAR-γ活性而影響胰島素信號轉導，從而導致胰島素抵抗和胰島β細胞功能異常[20]，致使AIDS患者胰島素抵抗發(fā)生率大于非AIDS患者[21]。同時，蘭麗娟等[22]發(fā)現，HIV病毒載量是HOMA-IR的獨立影響因素，高病毒載量對AIDS患者的胰島素抵抗及胰島β細胞功能產生負面影響。在本研究中，北平頂猴SIVmac239感染后5周，兩組北平頂猴的血漿病毒載量開始出現不同的變化，到第11周時，兩組間的血漿病毒載量相差最大。我們通過對第5周和第11周的HOMA-IR指數變化與病毒載量的相關性分析發(fā)現，病毒載量與胰島素抵抗具有相關性。SIVmac239感染急性期，體重減少組實驗動物病毒載量明顯高于體重增加組，高病毒載量的存在嚴重影響胰島β細胞的功能，進而出現明顯的胰島素抵抗及體重下降表現。

本研究發(fā)現，SIV急性感染期，葡萄糖代謝異常是導致體重明顯下降的主要原因。峰值后持續(xù)存在的高病毒載量損傷胰島β細胞，導致胰島素抵抗，進而誘導體重下降。相比之下，急性期胰島素水平下降可能是體重增加的主要原因，但機制尚不明確。因此，HIV感染急性期對于葡萄糖代謝相關指標的監(jiān)測有助于及時判斷胰島功能的損傷，有利于疾病進展程度的預測及相應治療策略的實施。