孟莉

（重慶三峽職業(yè)學(xué)院 重慶 404001）

1 前言

豬瘟是目前危害養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)的一種主要傳染病，也是給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重威脅的一種疾病，健康豬在感染了豬瘟病毒（CSFV）后臨床表現(xiàn)多為發(fā)熱、食欲減退、精神不振、咳嗽、結(jié)膜炎以及圍產(chǎn)期死亡、流產(chǎn)等[1]。

豬瘟的病原體是CSFV，它屬黃病毒科瘟病毒屬，是一種有囊膜的正鏈核糖核酸（RNA）病毒[2，3]。 目前，CSFV診斷研究已深入到分子水平，用RT-PCR方法能快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出豬瘟病毒。CSFV基因組長(zhǎng)約12.5 kb，含有一個(gè)開(kāi)放性閱讀框架（ORF），這個(gè)ORF翻譯成含3 898個(gè)氨基酸殘基的蛋白。蛋白的順序?yàn)?Npro、C、Erns（E0）、E1、E2、P7、NS2-3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B，其中，C、E0、E1 和 E2 為結(jié)構(gòu)蛋白，其余為非結(jié)構(gòu)蛋白，E0和E2最具有免疫防制研究?jī)r(jià)值。E2是CSFV的主要免疫原，它與羊邊界病毒（BDV）、牛病毒性腹瀉（BVDV）都存在較強(qiáng)的交叉免疫反應(yīng)。

2 材料和方法

2.1 豬瘟病料和標(biāo)準(zhǔn)毒株

2.1.1 豬瘟病料

取疑似豬瘟的淋巴結(jié)病料13份，病料來(lái)自重慶萬(wàn)州、開(kāi)縣、梁平、云陽(yáng)、城口等地豬場(chǎng)。

2.1.2 細(xì)胞和豬瘟標(biāo)準(zhǔn)毒株

豬腎細(xì)胞（PK-15）系、猴腎上皮細(xì)胞（Marc-145）、乳倉(cāng)鼠腎細(xì)胞（BHK-21）（西南大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）；CSFV標(biāo)準(zhǔn)株（中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所）；豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）疫苗、口蹄疫病毒（FMDV）疫苗、豬細(xì)小病毒（PPV）（中牧實(shí)業(yè)有限公司）；偽狂犬病毒（PRV）、牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）、圓環(huán)病毒2型（PCV2）（武漢科前動(dòng)物生物制品有限責(zé)任公司）。

2.2 儀器

凝膠成像系統(tǒng)（BIORAD，USA）；PCR 儀（C1000 Touch）；電泳槽（BIORAD，USA）；電泳儀（BIORAD，USA）；冷凍離心機(jī)（BIORAD，USA）。

2.3 主要試劑

RNA提取試劑Trizol（上海生工生物工程有限公司）；Ex Taq 酶（5 U/μL）、三磷酸脫氧核糖核苷 dN TP（2.5 mmol/L）、PCR Mix（2.5 mmol/L）、DNA Maker DL2000（分子量分別為 100bp、250bp、500bp、750bp、1 000 bp、2 000 bp）、二乙基焦碳酸酯（DEPC）處理水（大連寶生物工程有限公司）；凝膠電泳試劑Tris、乙二胺乙酸（EDTA）（上海生工）；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2.4 方法

本試驗(yàn)13份病料為試驗(yàn)材料，以接種了豬瘟毒株CSFV的PK-15豬腎細(xì)胞系為陽(yáng)性對(duì)照，以未接種豬瘟毒株CSFV的PK-15豬腎細(xì)胞系為陰性對(duì)照，設(shè)計(jì)試驗(yàn)。

2.4.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI公布的豬瘟病毒石門株的E2基因序列，設(shè)計(jì)合成1對(duì)檢測(cè)豬瘟病毒E2基因部分片段的RT-PCR引物。上游引物CSFV Pf：5’-ATCGACC AATGAGATAGGGCTACTC-3’，下游引物 CSFV Pr：5’-CACCTTGACAGTCCTGTTACCGATC-3’預(yù)期擴(kuò)增的片段大小756 bp，送上海生工合成，用二次蒸餾水稀釋，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.4.2 豬瘟病毒RNA提取

疑似豬瘟病料組織RNA的提?。海?）取淋巴結(jié)組織塊在液氮中將病料研磨成粉狀，將粉末轉(zhuǎn)移到2 mL離心管中。每100 mg組織加1.0 mL Trizol，室溫放置5 min，使其充分裂解。（2）12 000 r/min離心10 min，棄沉淀。 （3）加氯仿 200 μL，振蕩混勻，靜置15 min。（4）小心吸取上層液體于新的離心管中，加等量預(yù)冷異丙醇600 μL，混勻，冰上放置9 min。（5）12 000 r/min、4℃離心 10 min，棄上清，RNA 沉于管底。（6）用1 mL滅菌蒸餾水配制的75%乙醇溫和震蕩懸浮沉淀，10 000 r/min離心10 min，小心棄去乙醇，室溫干燥沉淀 5～8 min。 （7）加 50 μL 無(wú) RNA酶（RNase-free）水溶解沉淀，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4.3 RT-PCR擴(kuò)增豬瘟病毒

以下游引物CSFV Pr為引物，從提取的病毒總RNA中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)基因（cDNA）。反應(yīng)在PCR儀上進(jìn)行，最佳反應(yīng)條件為：反轉(zhuǎn)錄56℃、50min；預(yù)變性 94℃、10 min；變性 94℃、40 s，復(fù)性 55℃、35 s，延伸 72℃、35 s（25個(gè)循環(huán)）；終延伸 72℃、10 min。

2.4.4 凝膠電泳和結(jié)果觀察

配制1.0%的瓊脂糖凝膠，將凝膠放入1×TBE電泳緩沖液的電泳槽中，取10 μL的PCR產(chǎn)物同2 μL的 6×Loading buffer（1 mL 6×Loading buffer混有25 μL的花青素）混勻上樣，所用Marker為2kplus。上樣后，凝膠于1×TAE緩沖液中，120V電泳40 min。電泳結(jié)束后使用BIORAD凝膠成像分析系統(tǒng)拍照分析。

3 結(jié)果

3.1 接種CSFV的PK-15細(xì)胞RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

從接種CSFV的PK-15細(xì)胞中提取總RNA，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，結(jié)果只擴(kuò)增出一條大小約為756 bp的片段，與預(yù)計(jì)的目的片段一致，通過(guò)對(duì)各種反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，最終確定反應(yīng)條件。

3.2 豬瘟RT-PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果

特異性試驗(yàn)的電泳結(jié)果顯示，不能從BVDV、PRRSV、PRV、PPV、PCV2和 PK-15 基因組中擴(kuò)增出相應(yīng)片段，只能特異性地?cái)U(kuò)增出CSFV相應(yīng)的目的片段，與預(yù)期結(jié)果完全一致，表明該引物及方法具有比較好的特異性。

3.3 豬瘟RT-PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果

將CSFV總RNA稀釋，再按以上方法進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。結(jié)果表明，可檢測(cè)到的RNA最低量為20 ng。

3.4 豬瘟RT-PCR重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，多次重復(fù)進(jìn)行RT-PCR試驗(yàn)都能擴(kuò)增出目標(biāo)片段，說(shuō)明該試驗(yàn)建立的方法具有較好的重復(fù)性。

3.5 豬瘟RT-PCR產(chǎn)物的序列測(cè)定與比對(duì)

將上海生工生物有限公司的測(cè)序結(jié)果利用NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）網(wǎng)站上提供的核酸比對(duì)軟件Blastn對(duì)測(cè)得的序列進(jìn)行比較。結(jié)果表明，測(cè)得序列與GenBank上登錄的核酸序列比對(duì)，同源性達(dá)到97%，說(shuō)明擴(kuò)增得到的基因序列就是目標(biāo)CSFV的部分基因序列片段，即本試驗(yàn)方法有較好的特異性。

3.6 臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果

對(duì)13份疑似豬瘟病料進(jìn)行RT-PCR分析，RTPCR檢出陽(yáng)性病料12份，擴(kuò)增特異性條帶大小為756 bp，與目標(biāo)條帶近似，陽(yáng)性檢出率為92.3%。陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增條帶與目標(biāo)條帶相似，約為756 bp，陰性對(duì)照沒(méi)有擴(kuò)增出片段。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了1對(duì)檢測(cè)豬瘟病毒E2基因的RTPCR引物，建立了1例新的豬瘟病毒CSFV RT-PCR檢測(cè)的方法。試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法檢測(cè)豬瘟病毒較準(zhǔn)確有效。本文設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增的目標(biāo)片段為756bp，降低了非特異性片段出現(xiàn)的概率，從而降低了假陽(yáng)性出現(xiàn)的概率，使試驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確。

5 討論

（1）由于豬瘟為RNA病毒，而RNA又容易受環(huán)境中RNA酶降解，本試驗(yàn)所用的一步法RT-PCR有助于減少殘余污染，可以得到更高的靈敏度。同時(shí)，一步法簡(jiǎn)化了試驗(yàn)操作步驟，縮短了檢測(cè)時(shí)間。因此，本試驗(yàn)建立的一步法RT-PCR為豬瘟病原檢測(cè)和診斷提供了一種簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、快速的手段。

（2）本試驗(yàn)結(jié)果中RT-PCR結(jié)果片段未在同一條水平線上，可能是電泳時(shí)電壓不穩(wěn)定或電泳液不均勻造成的，可進(jìn)一步改進(jìn)電泳條件。

（3）目前已經(jīng)報(bào)道的豬瘟一步法RT-PCR檢測(cè)的目標(biāo)片段偏小。吳鑫[4]對(duì)豬瘟病毒5’端非編碼區(qū)保守序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)267 bp。向智龍等[5]根據(jù)豬瘟病毒石門毒株的E2基因序列，設(shè)計(jì)并合成了1對(duì)檢測(cè)豬瘟病毒E2基因的RT-PCR引物，擴(kuò)增的片段大小267 bp。已經(jīng)報(bào)道的目標(biāo)片段一般為200～300 bp左右，擴(kuò)增片段太小導(dǎo)致RT-PCR結(jié)果容易出現(xiàn)假陽(yáng)性[6]。本文設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增的目標(biāo)片段較長(zhǎng)，為756 bp，降低了非特異性片段出現(xiàn)的概率，從而降低了假陽(yáng)性出現(xiàn)的概率，使試驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確。本試驗(yàn)結(jié)果可為豬瘟病毒的鑒定[7]、病料的檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查提供一定的技術(shù)依據(jù)。