陳祉璇 姜亞飛 華瑩奇 蔡鄭東

骨肉瘤多發(fā)于兒童和青少年，約占兒童癌癥的3%～5%和成人癌癥的1%，是最常見(jiàn)的骨骼系統(tǒng)原發(fā)性惡性腫瘤［1］。自20世紀(jì)70年代至今，手術(shù)切除和藥物化療一直是骨肉瘤的主要治療手段，患者總體生存率停滯于60%左右［2-3］。骨肉瘤的樣本量小和基因異質(zhì)性使骨肉瘤分子分型面臨很大挑戰(zhàn)［2］，而組學(xué)技術(shù)和大數(shù)據(jù)技術(shù)可有效解決這兩大困難。因此，將精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)應(yīng)用于骨肉瘤治療是值得探索的研究方向。本文對(duì)基于基因組學(xué)、源自患者的異種移植模型（patient derived xenograft，PDX）測(cè)序、腫瘤免疫治療的骨肉瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的研究進(jìn)展作一系統(tǒng)綜述。

1 精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的定義

精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)是根據(jù)患者在基因組、表型、生物標(biāo)志物和心理社會(huì)上的特征，為患者定制治療方案的醫(yī)療模式［4］。2015年1月美國(guó)建立通過(guò)共享信息-搭建知識(shí)網(wǎng)絡(luò)-重新定義疾病分類的方式提高診斷精確度和治療效果的重要目標(biāo)［5］。組學(xué)技術(shù)和大數(shù)據(jù)技術(shù)是精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)。綜合運(yùn)用基因組學(xué)、表觀蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等生物醫(yī)學(xué)分析技術(shù)可更全面、更準(zhǔn)確、更深入地反映疾病的本質(zhì)特征，有助于對(duì)腫瘤患者進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、類別診斷和治療策略制定［6-7］。另外，利用超級(jí)計(jì)算機(jī)解讀大量組學(xué)信息，有助于解決腫瘤的基因組異質(zhì)性、原因不明的耐藥性和藥物組合等難題［7-8］。

2 基于基因組學(xué)的骨肉瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的探索

2.1 基于純基因組測(cè)序的骨肉瘤精準(zhǔn)治療的探索

2.1.1 PI3K信號(hào)通路的突變 Perry等［3］利用全基因組測(cè)序（whole genome sequencing，WGS）、全外顯組測(cè)序（whole exome sequencing，WES）、RNA測(cè)序方法，在24%骨肉瘤樣本中發(fā)現(xiàn)了PI3K/mTOR通路的基因突變；又因人骨肉瘤（human osteosarcoma，HOS）細(xì)胞系普遍對(duì)PI3K/mTOR抑制劑高度敏感，研究者甚至認(rèn)為基因突變是PI3K/mTOR通路活化的唯一途徑。另外，PTEN、TSC2、NF1、PI3KCA、PDPK1、AKT1、EIF4B等PI3K/mTOR通路相關(guān)基因也常發(fā)生突變。將小鼠的TP53和RB1基因敲除后可得到小鼠原發(fā)骨肉瘤模型，此模型也存在PTEN和PI3KR1的突變［3］。骨肉瘤細(xì)胞系的全基因組表達(dá)譜和蛋白激酶譜進(jìn)一步證實(shí)了PI3K/Akt通路的過(guò)度激活［9］。PI3K/mTOR通路的活性可被藥物（如PI3K/mTOR雙重抑制劑BEZ235、PIK3CA選擇性抑制劑PIK75、雷帕霉素）或基因沉默抑制，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡［3，10］。

2.1.2 IGF 信號(hào)通路的突變 胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）是骨組織中最豐富的生長(zhǎng)因子。成骨細(xì)胞分泌的IGF-1 可促進(jìn)生長(zhǎng)激素的分泌和細(xì)胞增殖，在維持腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中起重要作用［11］。

IGF1R 信號(hào)通路突變是約27%骨肉瘤的驅(qū)動(dòng)基因突變；通路中IGF 突變存在于7%的骨肉瘤中，IGF1R 擴(kuò)增存在于14%的骨肉瘤中。IGF1R 的胞內(nèi)定位是骨肉瘤分子分型的有效診斷工具，限于核內(nèi)的IGF1R 可提示此類骨肉瘤患者能獲益于IGF1R 抑制劑［11-12］。據(jù)此可推測(cè)，IGF-1R 單克隆抗體R1507、robatumumab、阻斷IGF-1 信號(hào)通路的chimaphilin、leptocarpin等藥物對(duì)此部分患者有更好的療效［13-16］。

2.1.3 BRCA 缺失樣突變 BRCA1 和BRCA2 是重要的抑癌基因，參與DNA雙鏈的斷裂修復(fù)；其突變易導(dǎo)致染色體的不穩(wěn)定性，在乳腺癌等癌癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［17］。

31個(gè)骨肉瘤的WES結(jié)果顯示，通過(guò)堿基突變、雜合性丟失等機(jī)制，80%以上骨肉瘤存在BRCA1/2缺失樣突變、平均1 個(gè)骨肉瘤發(fā)生17 個(gè)BRCA 基因突變，提示不同的單基因突變（如TP53、RB1、MUTYH 等）可能使骨肉瘤分化為不同亞群，進(jìn)而隨機(jī)激活BRCA1/2 的體細(xì)胞拷貝數(shù)突變（somatic copy number alterations，SCNAs）［18］。多個(gè)骨肉瘤細(xì)胞系對(duì)乳腺癌治療藥物talazoparib 敏感，敏感度與其BRCA 特征突變呈正相關(guān)。發(fā)生BRCA1/2 雙突變的細(xì)胞系（如MG63、ZK-58、SaOS-2 和MNNG/HOS）對(duì)talazoparib敏感；而發(fā)生BRCA2單突變的細(xì)胞系（如U2OS）則對(duì)talazoparib 抵抗［19］。以上結(jié)果表明，BRCA 缺失樣突變對(duì)骨肉瘤的分子分型和藥物選擇具有重要意義。

2.1.4 其他突變 VEGF 是血管發(fā)生和形成的重要信號(hào)蛋白［20］。VEGF 的過(guò)表達(dá)和VEGFR1 自分泌、VEGF-A 基因擴(kuò)增等有關(guān)，對(duì)骨質(zhì)溶解、血管生成和骨肉瘤的增殖轉(zhuǎn)移至關(guān)重要［21］?；驕y(cè)序結(jié)果顯示，約23%的骨肉瘤存在VEGF-A 基因擴(kuò)增，VEGFA/VEGFR2抑制劑對(duì)此類患者療效顯著［22］。

RANKL 是調(diào)控骨新陳代謝的重要膜蛋白。RANKL/RANK的過(guò)度激活可促進(jìn)破骨細(xì)胞對(duì)骨質(zhì)的破壞，激活骨改建和骨肉瘤增殖的惡性病理循環(huán)。阻斷RANK/RANKL信號(hào)通路不僅可以抑制骨肉瘤的增殖和轉(zhuǎn)移［23］，甚至可以預(yù)防過(guò)表達(dá)RANKL 小鼠的骨肉瘤的發(fā)生［24］。

RECQL4 是DNA 同源重組修復(fù)中的重要解旋酶［25］。雖然RECQL4 的缺失和突變均可造成基因組的不穩(wěn)定性和細(xì)胞衰老［26］，但僅RECQL4突變的小鼠易發(fā)生骨肉瘤，而RECQL4完全缺失的小鼠僅存在骨骼發(fā)育不良或骨質(zhì)疏松［27］。進(jìn)一步研究表明，REC?QL4調(diào)節(jié)骨骼發(fā)育的機(jī)制與p53的活性有關(guān)，但目前其具體分子機(jī)制尚不明確［28］。

細(xì)胞周期調(diào)控基因的突變?cè)诠侨饬鲋衅毡榇嬖?，?5%骨肉瘤存在TP53 突變［3］，61%骨肉瘤存在RB1 突變［3］，56%骨肉瘤存在TP53 和RB1 的雙重失活［29］。其常作為骨肉瘤的驅(qū)動(dòng)基因突變，在骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮不同的作用。其中，p53、Notch、Myc突變可引起GEMM骨肉瘤發(fā)生，Rb1和Pten突變則加速腫瘤的發(fā)生和增殖。骨肉瘤的染色體重組模式、潛伏期長(zhǎng)短、轉(zhuǎn)移速度、預(yù)后情況等和驅(qū)動(dòng)基因突變的種類和數(shù)量密切相關(guān)，然而驅(qū)動(dòng)基因突變與骨肉瘤的分化方向之間未見(jiàn)相關(guān)性，靶向p53的藥物也需要進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)［29］。

2.2 基于PDX測(cè)序的骨肉瘤精準(zhǔn)治療的探索

源自患者的PDX是將患者的腫瘤細(xì)胞植入免疫缺陷的小鼠從而建立腫瘤模型。PDX 較體外細(xì)胞系具有大量?jī)?yōu)勢(shì)，如體外細(xì)胞系無(wú)法展現(xiàn)腫瘤、基質(zhì)、其他細(xì)胞的相互作用；PDX 能更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)異質(zhì)性骨肉瘤對(duì)藥物的反應(yīng)；體外細(xì)胞系僅篩選出有效殺死腫瘤細(xì)胞的藥物，而PDX 能篩選出有效殺死或抑制腫瘤生長(zhǎng)的藥物［30］。因此，PDX 對(duì)骨肉瘤的治療和研究具有重要意義。

2.2.1 PDX 保持原發(fā)腫瘤的遺傳特性和異質(zhì)性 由于PDX可重現(xiàn)人體內(nèi)的腫瘤微環(huán)境，且其基因突變、基因表達(dá)和治療反應(yīng)與原發(fā)腫瘤高度一致［31］，因此PDX 能更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)異質(zhì)性骨肉瘤對(duì)藥物的反應(yīng)，是高通量藥物篩選的重要工具［32］。

在分子層面上，PDX 與原發(fā)腫瘤均上調(diào)擴(kuò)增基因和核糖體蛋白基因的表達(dá)［22］，表達(dá)相同的特征性組織學(xué)亞型mRNA［33］，表達(dá)一些相同的胞外分子。如PDX 的血液中存在人類的DKK-1，其濃度和骨肉瘤的增殖速率呈正相關(guān)，其抗體BHQ800可抑制骨肉瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移［34］。

在細(xì)胞層面上，PDX 與原發(fā)骨肉瘤的細(xì)胞特征一致：如粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（rough endoplasmic reticulum，RER）肥大，絨毛狀細(xì)胞表面，相同的生長(zhǎng)、侵略、轉(zhuǎn)移模式，相似的去分化程度和藥物反應(yīng)［32，35］。PDX的體外高通量藥物篩選結(jié)果顯示，骨肉瘤細(xì)胞對(duì)HDAC抑制劑、蛋白酶體抑制劑、PI3K/mTOR 組合抑制劑、PI3K/MEK 組合抑制劑較敏感，而對(duì)RAF1、MAPK、MAP2K 抑制劑較不敏感［32］。Igarashi 等［36］在順鉑抗藥性PDX 上進(jìn)行藥物篩選，結(jié)果顯示聯(lián)合使用替莫唑胺和曲貝替定也許可以抑制抗順鉑骨肉瘤的增殖。此外，PDX 的細(xì)胞同樣存在基因異質(zhì)性。同一骨肉瘤患者的PDX 和源自患者的細(xì)胞系（patient de?rived cell-line，PDC）單核苷酸多態(tài)性陣列（single nu?cleotide polymorphism array，SNP array）結(jié)果顯示，雖然PDX 和PDC 的染色體均發(fā)生大面積重復(fù)和缺失，但兩者染色體異常情況并不完全相同。因此，PDX中可能存在不同的細(xì)胞亞群，而PDC 僅反映其中一個(gè)亞群的基因組情況［33］。

2.2.2 PDX 和原發(fā)腫瘤基因拷貝數(shù)對(duì)比 鑒于PDX和原發(fā)腫瘤的一致性是PDX 臨床轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)，而基因拷貝數(shù)是驗(yàn)證兩者一致性的重要方面，因此結(jié)合基因組學(xué)數(shù)據(jù)和PDX實(shí)驗(yàn)結(jié)果很可能有助于個(gè)體化藥物的篩選。

WGS結(jié)果顯示，可靶向的SCNAs存在于93%的骨肉瘤中，且在PDX中穩(wěn)定存在。PDX的體內(nèi)藥物靶向?qū)嶒?yàn)表明，特異性靶向患者SCNAs的藥物療效較好，而非靶向SCNAs的藥物療效較差。其中，MYC擴(kuò)增的PDX（39%）對(duì)CDK抑制劑AT7519敏感，F(xiàn)OXM1擴(kuò)增的PDX（11%）對(duì)哌柏西利敏感，AURKB擴(kuò)增的PDX（13%）對(duì)AURKB抑制劑AZD1152敏感，CCNE1（33%）擴(kuò)增的PDX對(duì)CDK抑制劑dinaciclib敏感［22］。

2.3 免疫治療在骨肉瘤精準(zhǔn)治療中的應(yīng)用

腫瘤免疫治療指通過(guò)激活免疫系統(tǒng)、提高抗癌能力來(lái)治療癌癥，具有特異性和持久性等特點(diǎn)［37］。由于腫瘤具有高度遺傳異質(zhì)性、腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞復(fù)雜的相互作用，腫瘤免疫療法需要綜合分析宿主和腫瘤因素，需要明確腫瘤的分子特征和免疫細(xì)胞亞群的功能［38］。

2.3.1 免疫檢查點(diǎn)在骨肉瘤中的應(yīng)用 免疫檢查點(diǎn)是抑制免疫應(yīng)答的信號(hào)通路，PD-1/PD-L1和CTLA-4/CD80、CTLA-4/CD86，在正常機(jī)體中維持自身耐受、調(diào)節(jié)免疫強(qiáng)度。然而，免疫檢查點(diǎn)與腫瘤的免疫逃逸密切相關(guān)；阻斷免疫檢查點(diǎn)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可有效增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答［39］。T 細(xì)胞上的主要抑制性受體是CTLA-4和PD-1，是腫瘤免疫逃逸的重要途徑，成為治療許多晚期腫瘤的新有效靶點(diǎn)［40］。

骨肉瘤的免疫檢查點(diǎn)突變同樣呈基因異質(zhì)性。PDL1/PD-L2、B7-H3和IDO1的基因擴(kuò)增頻率在患者間差異顯著，且僅部分原發(fā)腫瘤（13%）、復(fù)發(fā)腫瘤（25%）和轉(zhuǎn)移腫瘤（48%）表達(dá)PD-L1［41］，表達(dá)程度從從陰性至高度表達(dá)不等［42］；然而，PD-L1和PD-L2的擴(kuò)增頻率在患者個(gè)體內(nèi)高度相關(guān)［43］。進(jìn)一步研究顯示，PD-1與免疫通路的活化、腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)信號(hào)、多西他賽的耐藥性呈正相關(guān)；PD-L1與免疫通路的活化、RAS通路的活化、腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)信號(hào)、順鉑的抗藥性呈正相關(guān)；PD-L2與免疫通路的活化、促凋亡信號(hào)呈正相關(guān)，但與干細(xì)胞、DNA修復(fù)、多柔比星抗藥性呈負(fù)相關(guān)［44］。

同一患者的原發(fā)病灶和轉(zhuǎn)移病灶中PD-L1表達(dá)差異顯著。PD-L1一般僅在轉(zhuǎn)移病灶中表達(dá)而不在原發(fā)病灶中表達(dá)；相似地，細(xì)胞毒性T細(xì)胞（cytotoxic T cell，CTL）僅在轉(zhuǎn)移病灶中表達(dá)PD-1，而不在原發(fā)病灶中表達(dá)PD-1［45］。靶向藥物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PD-1的單克隆抗體可提高肺部CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)和毒性［44］。然而，有研究發(fā)現(xiàn)PD-L1單克隆抗體單一用藥無(wú)長(zhǎng)期療效，α-CTLA-4 mAb和α-PD-L1 mAb聯(lián)合用藥有長(zhǎng)期療效，可能與用藥過(guò)程中腫瘤細(xì)胞下調(diào)PD-L1的表達(dá)并上調(diào)CD80/CD86的表達(dá)，CD8+腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TIL）下調(diào)PD-1的表達(dá)并上調(diào)CTLA-4的表達(dá)有關(guān)［46］。另外，鑒于PD-L1的表達(dá)與T細(xì)胞的高度浸潤(rùn)有關(guān)，推測(cè)轉(zhuǎn)移性骨肉瘤患者更可能獲益于基于T細(xì)胞的免疫治療［41-42］。

2.3.2 腫瘤疫苗在骨肉瘤中的應(yīng)用 腫瘤疫苗是使免疫細(xì)胞識(shí)別腫瘤抗原（包括完整的腫瘤細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞裂解產(chǎn)物和腫瘤相關(guān)肽段等）和主要組織相容性復(fù)合物（major histocompatibility complex，MHC），從而激活免疫系統(tǒng)的免疫療法，是最早的腫瘤免疫療法之一［47］。

然而，腫瘤疫苗在骨肉瘤中效果較差。定制肽段疫苗（personalized peptide vaccination，PPV）臨床試驗(yàn)顯示，雖然疫苗提高了患者CTL、免疫球蛋白G（immu?noglobulin G，IgG）的濃度，但未提高患者的總生存率［48］?？紤]到腫瘤相關(guān)肽段激活的免疫應(yīng)答強(qiáng)度有限，有研究嘗試以病毒或細(xì)菌作為腫瘤疫苗的載體，如Mason等［49］使用HER2的李斯特菌疫苗（Listeria monocytogenes，Lm）和Domingo-Musibay等［50］使用的由CD46侵入細(xì)胞的麻疹病毒疫苗。雖然以細(xì)菌或病毒為載體的腫瘤疫苗的確能激活相對(duì)強(qiáng)烈、持續(xù)的腫瘤免疫反應(yīng)，但感染隱患使其始終停留在試驗(yàn)階段。

總體而言，大多數(shù)腫瘤疫苗療效輕微，可能與骨肉瘤細(xì)胞下調(diào)MHCⅠ分子的表達(dá)、缺少特定的基因轉(zhuǎn)位和融合模式有關(guān)；腫瘤疫苗可作為輔助療法，提高化療、放療、免疫檢查點(diǎn)抑制劑等的療效［47］。

2.3.3 免疫細(xì)胞改造在骨肉瘤中的應(yīng)用 嵌合抗原受體T細(xì)胞（chimeric antigen receptor T cell，CART）治療是將抗體的單鏈可變片段（single-chain variable fragment，scFV）和T 細(xì)胞受體（t cell receptor，TCR）胞內(nèi)信號(hào)域的嵌合蛋白表達(dá)于T細(xì)胞表面，使T細(xì)胞直接識(shí)別腫瘤抗原并產(chǎn)生免疫應(yīng)答［51］。為保證CAR-T治療的有效性和安全性，其靶向的抗原需在骨肉瘤中高表達(dá)，且在正常組織內(nèi)不表達(dá)［52］。如靶向IL-11Rα、HER2、IGF1R 和ROR1 的CAR-T 均可抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，且不造成嚴(yán)重的器官毒性［53-55］。然而，由于骨肉瘤的高度異質(zhì)性和其惡劣的腫瘤微環(huán)境等因素，骨肉瘤的CAR-T 治療仍需不斷探索和改進(jìn)，如聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療［56］。

3 結(jié)語(yǔ)

隨著組學(xué)和大數(shù)據(jù)技術(shù)的日趨成熟，惡性腫瘤的分子機(jī)制逐漸被揭示，腫瘤的分子分型被不斷細(xì)化和完善。最新的研究揭示，對(duì)于高度基因異質(zhì)性的骨肉瘤，藥物的療效和其靶向突變基因的特異性高度相關(guān)，這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證實(shí)了精準(zhǔn)定位基因缺陷、精準(zhǔn)靶向用藥的重要性，有望彌補(bǔ)傳統(tǒng)治療手段靶向性不足的缺陷，提高患者的生存率和生存質(zhì)量。陸續(xù)開(kāi)展的骨肉瘤基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組研究篩選出許多骨肉瘤相關(guān)突變，為開(kāi)發(fā)相應(yīng)的靶向治療藥物指明了方向，推動(dòng)了骨肉瘤的精準(zhǔn)治療的發(fā)展，具有可觀的臨床轉(zhuǎn)化前景。