王 婷，趙帥林，楊關(guān)印，高寶山，徐志強

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 泌尿外二科，吉林 長春130021；2.通遼市醫(yī)院 泌尿外科，內(nèi)蒙古 通遼028000)

腎移植是終末期腎功衰竭患者的最佳治療方法。由于強效免疫抑制劑的應(yīng)用，移植術(shù)后短期急性排斥反應(yīng)明顯減少，然而移植腎長期存活率仍有待提高。人類白細(xì)胞抗原(HLA)的免疫致敏被認(rèn)為是影響移植腎存活的主要原因。因此充分了解實驗室如何評估HLA的致敏作用，對于判斷器官移植潛在受者是否可接受供者的器官、圍手術(shù)期決策制定、預(yù)測手術(shù)風(fēng)險及遠(yuǎn)期影響至關(guān)重要。本文以HLA抗原和抗體為中心，闡述移植術(shù)前HLA實驗室檢測在免疫學(xué)風(fēng)險評估中的作用、檢測HLA致敏的方法、結(jié)果解讀及其局限性，為準(zhǔn)確評估腎移植免疫風(fēng)險、提高移植物遠(yuǎn)期存活提供依據(jù)。

1 致敏的定義

器官移植前的評估中，致敏是在潛在受者中檢測是否存在對一種或多種HLA抗原具有反應(yīng)性的抗體。由于其在移植免疫中的重要性，HLA基因及相應(yīng)的抗原得到了廣泛的研究，且越來越多的等位基因被發(fā)現(xiàn)[1]。受早期檢測技術(shù)的限制，僅HLA A、B和DR抗原及相應(yīng)抗體得到了較深入的研究。然而通過研究已逐漸認(rèn)識到所有HLA基因的差異均可能導(dǎo)致同種異體識別及免疫損傷[2]。

抗原應(yīng)答的產(chǎn)生需要向T細(xì)胞和B細(xì)胞提呈抗原，并產(chǎn)生促進(jìn)T細(xì)胞及B細(xì)胞活化的信號。因此致敏的產(chǎn)生需要兩個關(guān)鍵因素—抗原的暴露及能夠?qū)乖龀龇磻?yīng)的免疫系統(tǒng)。典型的致敏過程包括妊娠、輸血及既往器官移植。在這些過程中均存在非自身組織的引入，且非自身抗原可能提呈給T細(xì)胞和B細(xì)胞[3]。如果宿主識別了與自身HLA抗原不同的抗原，并且除T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥途徑之外，B細(xì)胞途徑也可被激活，就可在外周血中產(chǎn)生和檢測出抗HLA抗體。此外記憶性B細(xì)胞途徑可被激活，如循環(huán)抗體減弱，記憶性抗體應(yīng)答仍可在再刺激時快速產(chǎn)生。如果循環(huán)HLA抗體對移植物表達(dá)的抗原具有特異性且具有足夠高的滴度，則免疫系統(tǒng)可完全激活并破壞移植物內(nèi)皮，此經(jīng)典過程稱為超急性排斥。介導(dǎo)損傷的抗體常常會緩慢出現(xiàn)，隨著檢測技術(shù)的進(jìn)步，研究人員逐漸認(rèn)識到，可檢測出的抗體直接導(dǎo)致的臨床后果并非是絕對的，而且在檢測中可能得到非特異性結(jié)果[4]。此時需要臨床醫(yī)生及HLA實驗室共同解讀，而不是接受簡單的陽性或陰性結(jié)果。

2 HLA實驗室檢測和移植前風(fēng)險評估

在臨床HLA實驗室中檢測免疫致敏的平臺主要有HLA分型，HLA抗體檢測和交叉匹配。腎移植候補名單面臨的主要問題是為移植受者找到HLA匹配的供體，這就需要了解潛在受體中HLA抗體的特異性和強度以及潛在供體中HLA抗原出現(xiàn)的頻率。目前移植前需要著重了解的是受者體內(nèi)是否存在供體特異性抗體(donor specific antibody，DSA)[5,6]，從而避免高風(fēng)險移植或移植后加強免疫抑制治療以降低移植物排斥的風(fēng)險。器官移植后記憶性同種異體免疫的形成或新生HLA抗體意味著移植物發(fā)生急性和慢性抗體介導(dǎo)損傷的風(fēng)險更高。

3 HLA分型

受檢測試劑及檢測方法的限制，傳統(tǒng)的腎移植HLA分型主要包括HLA-A、HLA-B及HLA-DR。傳統(tǒng)檢測方法是將受體細(xì)胞與已知抗HLA抗體血清共孵育，通過觀察細(xì)胞死亡來確定分型。這種檢測方法已被基于反向序列特異性寡核苷酸引物(R-SSO)或序列特異性引物(SSP)的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)所取代。此檢測中，由于使用的是給定的HLA基因相關(guān)引物，因此受者DNA通過PCR僅以給定的類型發(fā)生擴(kuò)增，通過分析哪種引物導(dǎo)致擴(kuò)增即可鑒定HLA的基因型。R-SSO和SSP技術(shù)可在數(shù)小時內(nèi)提供結(jié)果，且可以檢測任何人的HLA蛋白分型，即 A、B、Cw、DR、DRw、DQ、DP。以往0/6錯配被認(rèn)為是最佳匹配，而6/6錯配為最差匹配(由HLA-A、B、DR各2個抗原之間的差異所定義)。供受者之間的錯配程度對移植物長期存活有顯著影響[7,8]。研究發(fā)現(xiàn)，包括HLA-Cw、HLA-DP和HLA-DQ在內(nèi)的所有HLA蛋白都是可導(dǎo)致抗體形成的抗原性靶標(biāo)，并對移植物存活產(chǎn)生影響[9-11]。目前已知的抗HLA-II類抗體大多數(shù)為抗HLA-DQ抗體[12]。

從血清學(xué)分型到基于PCR分子分型的轉(zhuǎn)變使得HLA分型更為精細(xì)和準(zhǔn)確。由于血清學(xué)方法依賴于完整的抗原—抗體反應(yīng)，因此并不能輕易區(qū)分那些編碼蛋白質(zhì)大體相同但免疫原性具有微小差異的等位基因。而特定的分子引物能夠?qū)Φ任换蜃儺悮w類分型，可檢測到僅有單個氨基酸不同的等位基因變異，因此目前標(biāo)準(zhǔn)化的HLA分型已被廣泛應(yīng)用。“*”用于表示該結(jié)果通過分子學(xué)方法獲得，在第一個區(qū)域中所報告的基因位點，與第二個區(qū)域中與之相關(guān)的等位基因由“:”加以分隔，例如HLA-A * 02：01格式，該分子分型所對應(yīng)的血清學(xué)結(jié)果為HLA-A2。分子分型目前不僅可以區(qū)分等位基因，還可以區(qū)分特定的蛋白質(zhì)、DNA變異和非編碼區(qū)域內(nèi)的變化。因此，一個“完整”的分型格式可以具有多達(dá)四個標(biāo)識符，例如 HLA-A * 03：01：01：02 N[13]。因為機(jī)體可能會針對具有微小的但具有免疫原性的等位基因差異(例如HLA A * 02:01與A * 02:03)的相同抗原組(例如HLA-A2)的蛋白質(zhì)而產(chǎn)生抗體，通常在實體器官移植中僅考慮前兩個區(qū)域中的差異(代表抗原的蛋白質(zhì)整體結(jié)構(gòu)中的氨基酸差異)。

HLA分型的命名法進(jìn)一步發(fā)展以更好地描述II類HLA-DP和DQ蛋白的結(jié)構(gòu)和作用。HLA II類蛋白的結(jié)構(gòu)具有更復(fù)雜的抗原性潛力。任何HLA分子(Ⅰ類和Ⅱ類)的關(guān)鍵抗原區(qū)域是肽結(jié)合凹槽(圍繞β折疊的兩個α螺旋)，在此區(qū)域發(fā)生的抗原提呈是HLA分子的天然生物學(xué)功能。在HLA I類分子中，凹槽完全位于單個α蛋白鏈中，所有表位的多態(tài)性都位于其中，β鏈或恒定鏈在個體之間是高度保守和單態(tài)的，因此不會產(chǎn)生抗體反應(yīng)。相反，HLA II類分子的α和β肽鏈均具有抗原潛力，并可能具有獨立的免疫原性。進(jìn)一步認(rèn)識移植受體可能產(chǎn)生針對α鏈表位、β鏈表位及α鏈與β鏈交界面的抗體，需要HLA分型完整性和抗體檢測報告的發(fā)展[14,15]。HLA II類抗原傳統(tǒng)上僅根據(jù)β鏈命名，但如果要充分描述供體和受體之間潛在的免疫原性，則須清楚地區(qū)分及鑒定α等位基因，并將不同的α-β組合抗原識別為潛在的免疫靶標(biāo)[16]。而針對DQ抗原形成的抗體大約四分之一以DQA和DQB混合的形式存在，這種形式很難被單抗體包被的微球檢測所識別[16]。

4 抗體的檢測及鑒定

通過輸血、妊娠及既往移植而接觸到非自身HLA抗原可導(dǎo)致抗HLA抗體的產(chǎn)生[17,18]。移植前準(zhǔn)確鑒別這些抗體有助于器官移植受者避免表達(dá)供體抗原的移植物的免疫刺激。臨床上檢測到的器官移植受體預(yù)存的相關(guān)抗體是在供體抗原刺激下產(chǎn)生的，此類抗體會導(dǎo)致急性或慢性移植物排斥反應(yīng)。

早期HLA抗體的檢測是利用補體依賴的細(xì)胞毒(CDC)的方法。如果受體預(yù)先生成DSA，受體血清與供體細(xì)胞共同培養(yǎng)后將導(dǎo)致抗原-抗體復(fù)合物的形成。向培養(yǎng)物中加入外源性補體，形成的抗原-抗體復(fù)合物將激活補體途徑，隨后可出現(xiàn)細(xì)胞毒性作用及細(xì)胞死亡。供體死亡淋巴細(xì)胞比例>20%通常表示受體血清中存在DSA。此方法為定性診斷，結(jié)果受操作流程影響較大，同時細(xì)胞死亡也可能受培養(yǎng)條件及樣品處理的影響，因此精準(zhǔn)度具有一定局限性。而且同時須進(jìn)行陽性(具有已知HLA抗體的血清)和陰性(已知缺乏特定HLA抗體的血清)對照。要激活補體途徑則需要高滴度的DSA，如抗體滴度不足以導(dǎo)致細(xì)胞死亡，則檢測結(jié)果可能是假陰性，但同等滴度的抗體含量仍可能導(dǎo)致同種異體移植物損傷。此檢測中可添加抗人球蛋白(AHG)來改善CDC方法的靈敏度。AHG可促進(jìn)補體活化并因此在DSA存在的條件下發(fā)生更強的陽性反應(yīng)，將供體淋巴細(xì)胞分為T細(xì)胞或B細(xì)胞共同培養(yǎng)，進(jìn)而分別鑒定HLA Ⅰ類和/或Ⅱ類抗體。

CDC方法可通過檢測群體反應(yīng)抗體(PRA)來估測移植受者血清對特定人群HLA抗原的反應(yīng)概率。用于檢測的淋巴細(xì)胞組合通常來自當(dāng)?shù)厝巳?通常50-60人)，此方法可粗略估算移植受者對人群中HLA抗原具有反應(yīng)性的百分比(死亡淋巴細(xì)胞的百分比)，從而估算對于該群體而言免疫學(xué)上不能進(jìn)行移植的供體的百分比。應(yīng)用此檢測方法也可發(fā)現(xiàn)滴度最強的HLA抗體及最常見的陽性HLA抗體，但該方法可能因淋巴細(xì)胞組合的不同出現(xiàn)檢測偏差，譬如所選擇的淋巴細(xì)胞組合中不包括罕見的HLA抗原，或組合中包含過多重復(fù)抗原，檢測結(jié)果將會出現(xiàn)較大的差異。有研究發(fā)現(xiàn)，部分非HLA抗體如內(nèi)皮細(xì)胞抗體和血管緊張素抗體均可影響腎移植預(yù)后，此類抗體對移植物的影響越來越受到關(guān)注[19,20]，但這類抗體并不能被PRA檢測所發(fā)現(xiàn)。

在血清學(xué)HLA分型方法被基于分子DNA檢測平臺取代的同時，抗HLA抗體的血清學(xué)鑒定也逐漸被更靈敏和特異的基于流式細(xì)胞術(shù)的各類固相檢測方法所取代。這些固相檢測法使用包被HLA抗原的微球[21]。如果檢測到抗原，可以使用單抗原微球(SAB)進(jìn)一步精確的鑒定其特異性，其原理為每個單抗原微球表面包被一種來自患者細(xì)胞系的Ⅰ類或Ⅱ類抗原，因此除了罕見表型以外，所有常見的HLA抗原都可以用此方法檢測[22]。將包被抗原的微球與待檢測抗體共孵育，并加入與熒光染料相結(jié)合的抗人球蛋白抗體，如果血清內(nèi)抗體與HLA抗原上的表位相結(jié)合，則可通過流式細(xì)胞術(shù)檢測出熒光染料包被的抗球蛋白抗體-微球復(fù)合物。由于此檢測方法靈敏度較高，因此血清內(nèi)可能導(dǎo)致移植物損傷的低濃度抗體也可檢測出來[22,23]。

5 交叉匹配

移植受體對目標(biāo)供體反應(yīng)性的最后一種評估方法是交叉匹配。傳統(tǒng)的基于細(xì)胞反應(yīng)的交叉配型使用上文提及的相同的CDC方法。但與前者的關(guān)鍵區(qū)別在于，此檢測所有供體的HLA抗原都將被用到，無論其在人群中的總體普遍性如何。但此檢測仍然存在敏感性及特異性問題(例如存在非HLA抗體、自身抗體或低濃度的DSA)，因此正確解讀檢測結(jié)果對于有效規(guī)避高風(fēng)險移植但不會因誤判而舍棄適合移植的器官來說至關(guān)重要。

流式細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展及抗人球蛋白的應(yīng)用，改善了交叉配型檢測的靈敏度[24]，與基于流式細(xì)胞術(shù)的固相抗體檢測相似，當(dāng)受者血清與供體細(xì)胞共同培養(yǎng)時，可通過熒光標(biāo)記的抗人IgG檢測受者血清中低滴度的DSA。研究發(fā)現(xiàn)通過此方法檢測出的更低滴度的抗體，仍與器官移植后移植物短期及長期的排斥反應(yīng)有關(guān)[25]，而此滴度下的抗體應(yīng)用基于補體反應(yīng)的交叉配型檢測則是陰性的。

交叉配型應(yīng)包括T淋巴細(xì)胞(表達(dá)Ⅰ類HLA抗原)和B淋巴細(xì)胞(表達(dá)Ⅰ類和Ⅱ類HLA抗原)，以及自身交叉配型用以控制與自身抗體相關(guān)的假陽性結(jié)果。為了確保陽性交叉配型結(jié)果具有免疫學(xué)相關(guān)性，所有交叉配型檢測最好通過SAB完成[26,27]。相反，如果T細(xì)胞及B細(xì)胞交叉匹配均為陽性，而自身交叉匹配結(jié)果也為陽性，但檢測不到DSA，則可能是由于免疫學(xué)上無關(guān)的自身抗體所導(dǎo)致的，不應(yīng)排除移植的可能性。

6 HLA實驗室檢測在移植前臨床實踐和決策中所起的作用

6.1等待名單或移植前候選人由于個體內(nèi)的循環(huán)抗體含量可隨著時間的推移增多或減少，因此在等待移植的同時應(yīng)定期檢測HLA抗體以確保最準(zhǔn)確反映個體的免疫潛能。再次免疫暴露時可能發(fā)生劇烈的抗體反應(yīng)，因此應(yīng)在致敏事件4-6周后重復(fù)檢測HLA抗體。然后可將抗體特異性列表與已知群體內(nèi)的供體HLA頻率進(jìn)行比較[28,29]，以生成計算的PRA(cPRA)。cPRA的準(zhǔn)確性取決于組織配型庫中多個位點的供體分型的完整性，HLA分型數(shù)據(jù)越完整，得到的cPRA值越準(zhǔn)確[30]。并可利用這些cPRA值來管理等待移植名單上高度致敏的潛在受者從而對其進(jìn)行優(yōu)先排序，為患者提供移植機(jī)會的參考[31,32]。然而cPRA值并不能單獨用于量化排斥反應(yīng)的免疫風(fēng)險。

對于高致敏的等待患者需要改變供體器官分配理念，以確保他們在等待名單中不會處于劣勢地位[33]。當(dāng)移植風(fēng)險較低時，可預(yù)先嘗試去抗體策略。此外，部分移植中心嘗試開展了腎臟配對交換方案，其中不適合其預(yù)期受者的活體供體可能是另一患者的合適供體，而這位患者的原始供體又可能依次與另一受者相匹配。該策略增加了移植成功的機(jī)率并有效縮短了等待移植的時間[34,35]。 對于cPRA值非常高(>95%)的個體也可通過脫敏方案來提高其獲得移植的機(jī)會[36]。通過血漿置換或免疫吸附去除預(yù)存的抗HLA抗體、使用靜脈內(nèi)免疫球蛋白調(diào)節(jié)抗體產(chǎn)生、使用利妥昔單抗或硼替佐米靶向清除B細(xì)胞以減少抗體產(chǎn)生及應(yīng)用依庫麗單抗阻斷補體激活等方案單獨應(yīng)用或聯(lián)合應(yīng)用均取得了不同程度的療效[37-39]。盡管抗體脫敏方案需密集治療，但與持續(xù)血液透析相比，其成本效益比仍具有優(yōu)勢[40,41]，已經(jīng)使美國[42]和加拿大[43]的器官分配模式發(fā)生了變化。

6.2 器官移植時HLA檢測的應(yīng)用在某一潛在供體被確定后且即將進(jìn)行移植時，需進(jìn)行HLA供體分型并與受體分型進(jìn)行比較，因為供體和受體之間的HLA錯配程度是刺激同種免疫應(yīng)答的基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，供受體間HLA錯配的數(shù)量與DSA形成及移植腎排斥反應(yīng)呈正相關(guān)性[44]。以往認(rèn)為，首次和再次移植發(fā)生HLA錯配會導(dǎo)致移植結(jié)果更差，然而最新數(shù)據(jù)顯示，這種風(fēng)險僅限于特定的亞組，包括HLA II類分子重復(fù)錯配的患者及腎切除的患者[45]。一些移植中心使用HLA流式檢測的平均熒光強度(MFI)來確定檢測的抗體是否應(yīng)包含在計算機(jī)虛擬交叉匹配中，然而MFI并非定量結(jié)果，修訂的SAB檢測法把檢測C1q片段用以衡量HLA抗體的補體結(jié)合能力，從而確定哪些抗體是有害的[46]。然而這些檢測結(jié)果均不是絕對的，移植前C1q陰性的DSA未必?zé)o害，在某些情況下仍可造成移植物失功及不良后果[47]。因此，任何陽性或陰性結(jié)果必須在組織相容性檢測結(jié)果的背景下解讀，以確保假陽性或假陰性結(jié)果對移植分配決策的影響降至最低。

7 結(jié)語

器官移植前的所有檢測都旨在為風(fēng)險評估提供依據(jù)，然而移植實踐中的臨床風(fēng)險評估與其他醫(yī)學(xué)領(lǐng)域一樣，并非絕對。目前尚無一個檢測結(jié)果是絕對禁止移植的依據(jù)，而是在確定的高風(fēng)險供者的前提下權(quán)衡可能的風(fēng)險與獲益。值得關(guān)注的是，基于HLA的同種免疫是高度動態(tài)的，且在短期內(nèi)可能因免疫刺激或免疫抑制的狀態(tài)而發(fā)生改變。鑒于HLA實驗室檢測結(jié)果的復(fù)雜性，建議應(yīng)用動態(tài)數(shù)據(jù)并結(jié)合其他臨床檢測結(jié)果為移植風(fēng)險評估提供依據(jù)。