侯敬雅，張冬梅

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院牙周科，沈陽(yáng) 110002）

牙周炎是由菌斑生物膜引發(fā)的發(fā)生于牙周支持組織的慢性炎癥性疾?。?］。動(dòng)脈粥樣硬化 （atherosclerosis，AS） 是大多數(shù)心血管疾病的基礎(chǔ)，近年來我國(guó)因心血管疾病死亡的人數(shù)迅猛增加，AS的預(yù)防和診治成為人們研究的重點(diǎn)。流行病學(xué)調(diào)查［2］顯示牙周炎可以增加患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)，1990年有研究［3］提出了牙周炎動(dòng)脈粥樣硬化綜合征 （periodontitis-atherosclerosis syndrome，PAS） 的說法，近年來關(guān)于PAS研究逐年增加，牙周炎及AS機(jī)制研究需采用一些體外或體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來完成。與體外實(shí)驗(yàn)比較，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)M人體內(nèi)環(huán)境，所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)真實(shí)、可靠。因此建立牙周炎和AS動(dòng)物模型顯得尤為重要。本文就牙周炎和動(dòng)脈粥樣硬化鼠類模型建立的進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 AS鼠類模型的建立

AS模型動(dòng)物有大型動(dòng)物 （猴、豬等） 和小型動(dòng)物（兔、小鼠和大鼠等［4-5］） 2種。目前還沒有一種AS動(dòng)物模型能全面、準(zhǔn)確模擬人AS病變特征。鼠類具有成本低、易于繁殖、基因操作方便以及能夠定期檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，是應(yīng)用最多的動(dòng)物［6］。目前AS模型鼠類包括普通大鼠、小鼠。小鼠為以c57BL/6小鼠為基因背景的基因敲除鼠，包括載脂蛋白E基因敲除 （ApoE-/-）小鼠和低密度脂蛋白受體敲除 （LDLr-/-） 小鼠） 等。

1.1 普通大鼠AS模型

鼠類有抗AS的特性，很難自發(fā)形成AS病變。高脂飲食可使血脂升高，導(dǎo)致其形成AS早期改變。AUBIN等［7］給大鼠喂飼高脂飲食，持續(xù)8周，高脂飲食組出現(xiàn)AS斑塊樣病變。高脂飲食建立的AS模型操作簡(jiǎn)單、成本低廉，是建立AS模型常用方法，但高脂飲食造模時(shí)間較長(zhǎng)，而且高脂飲食有肝臟毒性，會(huì)使動(dòng)物消瘦，期間有可能發(fā)生繼發(fā)感染，從而影響實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性。因此目前常采用高脂飼養(yǎng)聯(lián)合其他方法加速AS模型建立。常用高脂飲食聯(lián)合其他方法包括高脂飲食聯(lián)合腹腔注射維生素D3、高脂飲食聯(lián)合腹腔注射維生素D3聯(lián)合內(nèi)皮損傷法、高脂飲食聯(lián)合腹腔注射脂多糖［8-10］。

1.2 小鼠AS模型

最常用AS基因敲除小鼠模型有2種：ApoE-/-小鼠模型和LDLr-/-小鼠模型。

1.2.1 ApoE-/-小鼠AS模型：ApoE是血漿載脂蛋白的重要組成部分，在清除血漿脂質(zhì)方面發(fā)揮著重要作用。ApoE-/-小鼠在高脂飼料喂養(yǎng)后能快速形成AS病變［11］。ZHANG等［12］用高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠16周，組織病理學(xué)顯示動(dòng)脈壁有粥樣斑塊形成及巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)等，證明AS模型建立成功。ApoE-/-小鼠模型不足之處：（1） 模型與人類脂質(zhì)譜不同，人類血漿脂蛋白主要為低密度脂蛋白，而小鼠模型為極低密度脂蛋白［13-14］；（2） ApoE蛋白除了介導(dǎo)脂質(zhì)清除以外，本身也具有抗炎、抗氧化、抗增殖作用，ApoE基因敲除影響AS形成過程，這使AS形成機(jī)制的研究更加復(fù)雜［5］。

1.2.2 LDLr-/-小鼠AS模型：低密度脂蛋白受體能夠結(jié)合ApoE蛋白從而清除血中脂蛋白顆粒，同時(shí)低密度脂蛋白受體也能通過與低密度脂蛋白顆粒上的脂蛋白B （apolipoprotein B，ApoB） 相互作用，從而清除血中低密度脂蛋白。LDLr-/-小鼠表現(xiàn)為血清膽固醇、甘油三酯水平升高，經(jīng)過高脂飲食喂養(yǎng)后可以加快AS斑塊形成［15］。THOMAS等［16］用高脂飲食喂養(yǎng)LDLr-/-小鼠16周，動(dòng)脈壁可見AS形成。LDLr-/-小鼠模型不足之處：中間密度脂蛋白和低密度脂蛋白比值較高，這種情況更接近于人的血脂紊亂狀態(tài)。

2 鼠類牙周炎模型建立

牙周炎模型動(dòng)物主要有大型動(dòng)物 （靈長(zhǎng)類動(dòng)物、小型豬、狗等） 和小型動(dòng)物 （大鼠、倉(cāng)鼠［17］等） 2種。鼠類牙周組織結(jié)構(gòu)、病理與人類相似，且價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)便，所以目前鼠類是研究牙周炎發(fā)病機(jī)制應(yīng)用最廣泛的嚙齒類動(dòng)物［18］。常用的牙周炎鼠類模型建立方法有4種：磨牙結(jié)扎法、牙齦局部注射脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、高糖飲食和牙齦局部接種牙周致病菌。

2.1 磨牙結(jié)扎法建立牙周炎模型

磨牙結(jié)扎法是目前建立牙周炎動(dòng)物模型較常用的方法［19］。結(jié)扎線容易造成食物殘?jiān)鼫?、菌斑積聚，從而造成牙齦組織紅腫出血和牙槽骨喪失［20］。常用的結(jié)扎材料有絲線、棉線、尼龍線、正畸用鋼絲及彈性橡皮圈等。VARGAS-SANCHEZ等［18］將棉線結(jié)扎于大鼠的下頜第一磨牙，結(jié)扎后0、3、7、15、30、60 d處死大鼠，發(fā)現(xiàn)第3天即出現(xiàn)明顯牙槽骨吸收，從第3天到第15天牙槽骨出現(xiàn)持續(xù)穩(wěn)定吸收，第30天到第60天牙槽骨吸收保持穩(wěn)定，不再有明顯骨喪失。磨牙結(jié)扎法建立大鼠牙周炎模型不足之處：（1） 引起的是急性牙周炎病變，與人牙周炎病變過程不同；（2） 結(jié)扎過程可能造成牙周組織創(chuàng)傷。但因?yàn)榫哂谐杀据^低、操作簡(jiǎn)單、疾病開始時(shí)間明確、結(jié)果可預(yù)測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，磨牙結(jié)扎法成為目前建立牙周炎模型首選的方法［21］。

2.2 牙齦局部注射LPS建立牙周炎模型

LPS是革蘭陰性菌細(xì)胞壁外膜中的成分，是革蘭陰性菌具有的一種致病物質(zhì)，具有很高的毒性和抗原性。LPS可以進(jìn)入牙周組織導(dǎo)致炎癥和牙槽骨吸收。DUMITRESCU等［22］將鼠傷寒沙門桿菌的LPS溶于生理鹽水 （10 μg/μL），取0.1 μL注入大鼠上頜第二磨牙頰側(cè)近中的牙齦里，10 d后處死大鼠，病理組織學(xué)顯示上頜頰腭側(cè)均有明顯的骨喪失。牙齦局部注射LPS建立牙周炎模型優(yōu)點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)可控性好、節(jié)省時(shí)間、具有可重復(fù)性。不足之處是LPS純化過程較復(fù)雜，而且LPS生物化學(xué)功能不穩(wěn)定。

2.3 高糖飲食建立牙周炎模型

高糖黏性飲食不利于牙齒的自潔，為鼠類口腔中細(xì)菌生長(zhǎng)、繁殖提供了較有利環(huán)境。AGUIRRE等［23］分別采用高蔗糖飲食和標(biāo)準(zhǔn)飲食飼養(yǎng)稻鼠，22周時(shí)發(fā)現(xiàn)高蔗糖飲食組稻鼠牙周袋深度、牙槽骨高度等臨床指標(biāo)均比標(biāo)準(zhǔn)飲食組差。高糖飲食建立牙周炎模型優(yōu)點(diǎn)是避免了結(jié)扎等造成的鼠牙周組織機(jī)械損傷，不足之處是只適用于倉(cāng)鼠、稻鼠這類牙根之間分叉較小，對(duì)牙周炎較敏感的鼠類［17，19］。

2.4 牙齦局部接種牙周致病菌建立牙周炎模型

牙菌斑是牙周炎的始動(dòng)因子，在牙菌斑中常可分離出一種或幾種牙周致病菌，牙周致病菌具有顯著毒力或致病性，可造成牙周組織破壞。牙周致病菌主要有牙齦卟啉單胞菌 （porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）、伴放線聚集桿菌（aggregatibacter actinomycetemcomitans，A.actinomycetemcomitans）、具核梭桿菌（fusobacterium nucleatum，F(xiàn).nucleatum）、中間普氏菌（prevotella intermedia，P.intermedia）、福賽坦氏菌（tannerella forsythia，T.forsythia）、齒垢密螺旋體（treponema denticola，T.denticola）等。P.gingivalis已被確定為主要的牙周病原體之一，因此P.gingivalis最常用于牙周炎模型的建立。WANG等［24］向6周齡小鼠下頜磨牙的牙齦里接種P.gingivalis，2 d接種3次。12周后處死小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較，感染組小鼠出現(xiàn)明顯骨喪失。牙齦局部接種牙周致病菌建立牙周炎模型優(yōu)點(diǎn)是操作相對(duì)簡(jiǎn)單，建立小鼠牙周炎模型常采用此種方法，但單獨(dú)使用可能比接種細(xì)菌聯(lián)合結(jié)扎的方法效果略差［25］。

3 牙周炎和AS鼠類復(fù)合模型建立

目前研究顯示，牙周炎與AS復(fù)合模型多采用兩個(gè)及以上模型相結(jié)合的方法。

3.1 高脂飲食+腹腔注射維生素D3+磨牙結(jié)扎+口腔接種牙周致病菌復(fù)合模型

任秀云等［26］在SD大鼠腹腔注射維生素D3，并用高脂飼料喂養(yǎng)建立高脂血癥模型，同時(shí)在鼠的第一、二磨牙上“8”字結(jié)扎絲線并接種P.gingivalis建立牙周炎模型。15周后，取大鼠動(dòng)脈做病理檢測(cè)，觀察到動(dòng)脈壁有鈣鹽沉積及泡沫細(xì)胞。隨機(jī)檢查大鼠口腔，發(fā)現(xiàn)有牙齦紅腫、探診出血、深牙周袋、牙齒松動(dòng)等牙周炎表現(xiàn)。張?jiān)疵鞯龋?7］在Wistar大鼠腹腔一次性注射維生素D3（70萬IU/Kg），并用高脂飼料喂養(yǎng)建立AS模型，用3.0絲線結(jié)扎左右第二磨牙牙頸部，將密度為1×109CFU/mL的4種標(biāo)準(zhǔn)菌混懸液 （P.gingivalisATCC33277 菌株、A.actinomycetemcomitansATCC29523 菌株、F.nucleatumATCC25586 菌株、P.intermediaATCC25611 菌株） 接種于齦溝內(nèi)，每3周接種1次建立牙周炎模型。12周后檢查大鼠口腔可見牙齦紅腫，深牙周袋形成。病理檢查顯示結(jié)合上皮向根部增殖，牙周炎動(dòng)物模型建立成功。取大鼠動(dòng)脈做病理檢測(cè)，可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，泡沫細(xì)胞聚集斑塊形成，即AS模型建立成功。

3.2 基因敲除小鼠+口腔接種牙周致病菌復(fù)合模型

CHUKKAPALLI等［28］采用4種牙周致病菌 （P.gingivalis、T.denticola、T.forsythia和F.nucleatum，2.5×109/mL） 口腔灌洗ApoE-/-小鼠，24周時(shí)處死小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較牙槽骨吸收明顯，動(dòng)脈內(nèi)膜明顯斑塊形成。F.nucleatum既可與早期定植菌共聚，又可與晚期定植菌共聚，可作為早晚期定植菌的黏結(jié)橋。因此CHUKKAPALLI等［29］模擬人口腔細(xì)菌定植的順序，前12周在LDLr-/-小鼠口腔感染F.nucleatum（1×109/mL），后12周口腔感染P.gingivalis、T.denticola、T.forsythia混合菌 （5×109/mL）。每周4次，每3周1個(gè)感染周期，共持續(xù)8個(gè)感染周期。24周后處死小鼠，實(shí)驗(yàn)組可見牙槽骨明顯吸收，動(dòng)脈內(nèi)膜可見斑塊形成。

綜上所述，鼠類模型雖然不能完美地模擬牙周炎或AS發(fā)病過程，但它是一種經(jīng)濟(jì)、快速、實(shí)用的動(dòng)物模型。目前基因敲除小鼠已經(jīng)在AS模型建立中普遍使用，但因其體型較小，磨牙結(jié)扎建立牙周炎模型仍有一定操作難度，開發(fā)基因敲除大鼠建立牙周炎和AS模型具有重大的意義。牙周炎作為AS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其分子機(jī)制涉及較多炎性細(xì)胞因子和信號(hào)通路。希望今后能建立更有效的牙周炎和AS動(dòng)物模型，以便進(jìn)一步揭示牙周炎和AS之間作用的分子機(jī)制。