王影 李慧 藺經(jīng) 楊青松 常有宏

摘要：CBL互作蛋白激酶（CIPK，CBL-interacting protein kinases）是與鈣調(diào)磷酸酶B類(lèi)蛋白（CBL，calcineurin B-like protein）特異結(jié)合的蛋白激酶，廣泛參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育以及生物和非生物脅迫響應(yīng)。克隆和鑒定杜梨響應(yīng)鹽脅迫的CIPK基因，對(duì)杜梨抗逆分子機(jī)制和抗逆性研究具有重要意義。選取了一個(gè)特殊的基因PbCIPK01做進(jìn)一步的研究，通過(guò)生物信息學(xué)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析該基因的序列特征以及在鹽脅迫下的表達(dá)模式。該基因全長(zhǎng)為1 368 bp，含有1 365 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼455個(gè)氨基酸，DNA序列為5 051 bp，包含12個(gè)外顯子和11個(gè)內(nèi)含子。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果表明，該基因在杜梨的葉片中表達(dá)量最高，且受鹽脅迫誘導(dǎo)下調(diào)表達(dá)。

關(guān)鍵詞：杜梨;鹽脅迫;CIPK基因;序列分析;基因表達(dá);抗逆基因;抗逆機(jī)制

中圖分類(lèi)號(hào)： S661.201文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）21-0115-05

收稿日期：2018-08-03

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31372051、31772287）;江蘇省自然科學(xué)基金（編號(hào)：BK20151361）。

作者簡(jiǎn)介：王影（1993—），女，安徽宿州人，碩士研究生，主要從事果樹(shù)種質(zhì)資源與分子育種研究。E-mail：1759068060@qq.com。

通信作者：常有宏，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事果樹(shù)種質(zhì)資源和栽培技術(shù)等研究。E-mail：cyh@jaas.ac.cn。

Ca2+是植物中普遍存在的第二信使，與Ca2+傳感器結(jié)合進(jìn)行信號(hào)傳遞，在植物抗低溫、抗旱、抗鹽等脅迫中發(fā)揮重要作用。鈣調(diào)磷酸酶B類(lèi)蛋白（CBLs，calcineurin B-like proteins）作為植物體內(nèi)特異的Ca2+傳感器必須與下游的靶蛋白CBL互作蛋白激酶（CIPK，CBL-interacting protein kinases）相互結(jié)合才能共同發(fā)揮作用[1]。CIPK是植物特有的一類(lèi)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，該蛋白在植物響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮重要作用，尤其與非生物脅迫（高鹽、ABA、干旱等）的信號(hào)傳導(dǎo)密切相關(guān)[2]。在模式植物擬南芥中，所有的CIPK蛋白含有C-端的調(diào)節(jié)域和N-端的激酶蛋白域，CIPK蛋白C-端的調(diào)節(jié)區(qū)有2個(gè)明顯功能域，是NAF結(jié)構(gòu)域和PPI結(jié)構(gòu)域，NAF結(jié)構(gòu)域能與CBL特異結(jié)合[3]，PPI結(jié)構(gòu)域[4]是CIPK與蛋白磷酸酶的作用位點(diǎn)，這2個(gè)結(jié)構(gòu)域的特性使得CIPK成為一個(gè)連接CBL傳導(dǎo)信號(hào)途徑的重要分子開(kāi)關(guān)，使其能更好地發(fā)揮信號(hào)調(diào)控作用[5]。

截至目前，已有越來(lái)越多的CIPK基因被克隆，在模式植物擬南芥中發(fā)現(xiàn)有25個(gè)[6]，玉米中有43個(gè)[7]，葡萄[8]和油菜[9]中分別有23個(gè)。關(guān)于CIPK基因的研究目前主要集中在擬南芥[6]、玉米[7]、水稻[10]和甘蔗[11]上，水稻OsCIPKs基因受不同程度的生物脅迫和非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá);甘蔗ScCIPKs基因在應(yīng)對(duì)非生物脅迫逆境中協(xié)同發(fā)揮作用，同時(shí)在生物脅迫（接種花葉病毒）下表現(xiàn)出差異表達(dá)水平。由此推測(cè)，杜梨CIPK基因可能也受非生物脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)。

杜梨作為中國(guó)梨樹(shù)栽培中普遍應(yīng)用的一種砧木，具備耐澇、抗寒、耐鹽堿、抗旱等綜合抗性，是梨屬植物中重要的抗性種質(zhì)資源[12]。本研究首先采用同源克隆技術(shù)從杜梨中克隆CIPK基因，然后利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析該基因在鹽脅迫下不同組織和不同時(shí)間（0、12、24、48、72 h）的表達(dá)模式，以期為杜梨抗逆基因的發(fā)掘和抗逆機(jī)制的解析提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與脅迫處理

單株來(lái)源的杜梨組培苗保存于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所仁果研究室。經(jīng)分生根培養(yǎng)30 d后，選擇生長(zhǎng)一致的植株，移栽到溫室營(yíng)養(yǎng)土穴盤(pán)中繼續(xù)培養(yǎng)，待幼苗長(zhǎng)至10 cm左右，選取生長(zhǎng)良好、發(fā)育一致的杜梨苗流水沖洗干凈，用紙浸干，然后分別置于去離子水和NaCl溶液中處理，于0、12、24、48、72 h分別取根、莖和葉片，用液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.2總RNA的提取及cDNA的合成

采用RNA Simple Total RNA Kit[天根生化科技（北京）有限公司]提取杜梨總RNA，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性，采用PrimeScript RT-PCR Kit試劑盒（TaKaRa）合成第一鏈cDNA。

1.3杜梨CIPK基因的cDNA和基因組DNA全長(zhǎng)序列的克隆

以中國(guó)白梨（Pyrus×bretschneideri）基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的CBL-interacting serine/threonine- protein kinases 5這個(gè)基因（XM_018648989.1）作為電子探針，搜索杜梨鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)[13]，獲得候選基因，設(shè)計(jì)特異引物（P1：5′-ATGGTGATCGTGAGAAAAG-3′，P2：5′-ACTAGTCAGCAACTCTTGG-3′），以未處理和經(jīng)過(guò)NaCl處理的杜梨葉片的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：cDNA 1.0 μL，引物各1.0 μL，10× PCR Buffer 2.0 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）3.2 μL，MgCl2（25 mmol/L）2.0 μL，LA Taq（5 U/μL）0.2 μL，ddH2O 9.6 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 4 min;95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳回收;同時(shí)，提取杜梨植株總DNA（TaKaRa MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit，TaKaRa）和設(shè)計(jì)引物（P1′：5′-AAATACAAGACTCCTCCAATTA-3′，P2′：5′-TTTTTCTTGCATTCTGAATCATA-3′），以杜梨總DNA為模板擴(kuò)增該基因的基因組序列。分別連接pMD18-T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒經(jīng)菌液PCR鑒定后測(cè)序。引物合成和測(cè)序都委托上海皓嘉生物技術(shù)有限公司完成。

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