■邵彩梅 劉 燕 王玉璘* 孫穎雪

（1.遼寧禾豐牧業(yè)股份有限公司,遼寧沈陽110164；2.沈陽豐美生物技術(shù)有限公司，遼寧沈陽110100）

葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase，EC1.1.34，簡(jiǎn)稱 為GOD），國(guó)際生物化學(xué)協(xié)會(huì)酶學(xué)委員會(huì)將GOD系統(tǒng)命名，把它叫做β-D-葡萄糖氧化還原酶。葡萄糖氧化酶（GOD）作為一種我國(guó)農(nóng)業(yè)部新批準(zhǔn)的新型、綠色添加劑，反應(yīng)產(chǎn)物有抑制有害菌生長(zhǎng)、促進(jìn)有益菌繁殖的作用。丹麥種豬對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需求較高，母豬在妊娠期及泌乳期飼喂過程中應(yīng)用抗生素較少，限位欄的使用使母豬運(yùn)動(dòng)受限，導(dǎo)致母豬圍產(chǎn)期便秘、免疫力降低及霉菌毒素在體內(nèi)積存等問題。母豬便秘會(huì)嚴(yán)重影響母豬健康、降低初乳品質(zhì)、產(chǎn)死胎等嚴(yán)重制約母豬繁殖性能和豬場(chǎng)效益[1-2]。GOD作為一種新型功能性飼用酶制劑，通過非藥物的機(jī)制提供胃腸道酸性環(huán)境，維持腸道內(nèi)微生物菌群的平衡、為腸道上皮細(xì)胞供能并保護(hù)其完整性[3-5]。有報(bào)道顯示，GOD的作用類似酸化劑[6]，酸化劑在母豬生產(chǎn)上，可能具有改善母豬無乳的作用。本研究旨在通過飼養(yǎng)試驗(yàn)，在丹系大白母豬妊娠后期及泌乳期飼糧中添加不同梯度的GOD，討論其對(duì)母豬圍產(chǎn)期便秘以及腸道健康的影響，進(jìn)而影響母豬初乳品質(zhì)。為葡萄糖氧化酶在丹系大白母豬生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

葡萄糖氧化酶（GOD）是由北京盛拓達(dá)生物技術(shù)有限公司提供，酶活力為200 U/g，顆粒袋裝。母豬妊娠后期和泌乳期飼糧均由北京三元禾豐牧業(yè)股份有限公司提供。試驗(yàn)地點(diǎn)在河北張家口佳和農(nóng)牧有限公司進(jìn)行，試驗(yàn)選用胎次（2、3胎）、預(yù)產(chǎn)期、體況相近、健康狀態(tài)良好的丹系純種大白妊娠后期（85 d）母豬80頭。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用單因素完全隨機(jī)化設(shè)計(jì)，將80頭丹系大白母豬隨機(jī)分為4組，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)4頭母豬。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)Ⅰ組：基礎(chǔ)飼糧+0.5 g/kg GOD，試驗(yàn)Ⅱ組：基礎(chǔ)飼糧+1 g/kg GOD，試驗(yàn)Ⅲ組：基礎(chǔ)飼糧+1.5 g/kg GOD。試驗(yàn)期為58 d（產(chǎn)前30 d，產(chǎn)后28 d）。飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

1.3 飼養(yǎng)管理

妊娠期母豬飼養(yǎng)于同一豬舍，水槽自由飲水，自動(dòng)料線飼喂，每天飼喂兩次；哺乳母豬分為3個(gè)圈舍，鴨嘴式飲水器，碗狀料槽，每天飼喂四次。

試驗(yàn)期間所有試驗(yàn)?zāi)肛i均按照張家口佳和農(nóng)牧有限公司管理規(guī)程及免疫程序進(jìn)行管理，母豬分娩前6 d由妊娠舍轉(zhuǎn)入產(chǎn)房。試驗(yàn)期間記錄實(shí)驗(yàn)對(duì)象異常、疾病及相應(yīng)治療方案。

1.4 樣品采集

1.4.1 糞樣采集

于母豬分娩后第20、21 d，選取每個(gè)處理中體況相近、生長(zhǎng)狀況良好的哺乳母豬各5頭，于6：00～8：00間收集糞樣（避免沙石和豬毛等雜質(zhì)的混入），每天每頭母豬采集糞樣約50 g，放入自封袋，密封置于-20℃冰箱冷凍，待測(cè)。

1.4.2 初乳采集

于母豬分娩當(dāng)日，選取每個(gè)處理中體況相近、奶水充足、健康狀況良好的母豬各5頭，用0.1%的高錳酸鉀溶液對(duì)乳房進(jìn)行消毒清潔處理，帶好一次性醫(yī)用手套，用50 ml離心管取母豬乳房的前、中、后3個(gè)部位的乳頭各采集乳樣15 ml，標(biāo)記后密封。置于-20℃冰箱保存，待測(cè)。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

1.5 測(cè)定指標(biāo)

1.5.1 圍產(chǎn)期母豬便秘

整個(gè)泌乳期內(nèi)，觀察母豬圍產(chǎn)期（分娩前后各一周）母豬糞便情況，每天8:00～9:00觀察并進(jìn)行評(píng)分記錄。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 糞便評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.5.2 糞便微生物菌群

1.5.2.1 測(cè)定方法

測(cè)定大腸桿菌、乳酸菌、雙歧桿菌的培養(yǎng)基均購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，結(jié)果均以每克糞便中含有的菌落總數(shù)的對(duì)數(shù)lg（CFU/g）表示（各微生物培養(yǎng)基見表3）。

表3 菌落培養(yǎng)

1.5.2.2 測(cè)定步驟

在無菌室超凈工作臺(tái)上，用分析天平稱取1 g解凍糞樣，放入裝有10顆左右玻璃珠的18×180 mm無菌試管中，加無菌水9 ml，然后用小型旋渦混合器震蕩混勻，形成1∶10稀釋液（既母液）。用1 ml移液器吸取母液0.1 ml，注入含有0.9 ml無菌水的2 ml無菌試管中，然后再用旋渦混合器震蕩30 s左右，成1∶100的稀釋液，這樣依次稀釋，并選取3個(gè)稀釋濃度：大腸桿菌（10-1、10-2、10-3），乳酸菌（10-3、10-4、10-5），雙歧桿菌（10-3、10-4、10-5）。用移液器吸取各菌落已選取的3個(gè)稀釋梯度的0.1 ml，滴到備好的培養(yǎng)基表面，各稀釋梯度重復(fù)做3個(gè)平行，用無菌涂布棒將菌液均勻的涂布開，倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，然后計(jì)數(shù)，菌液中每克糞樣含活菌數(shù)為lg(CFU/g)。

糖尿病病程＜12個(gè)月、12～24個(gè)月的胰腺癌患者在經(jīng)過治療后，腫瘤標(biāo)志物CA199、CEA水平持續(xù)下降，血糖水平也不斷降低，兩者之間為正相關(guān)關(guān)系（r=0.843、0.713，P=0.001、0.001）。 糖尿病病程 25～36 個(gè)月、＜36 個(gè)月的胰腺癌患者的血糖改善率同腫瘤標(biāo)志物CA199、CEA 水平的降低無關(guān)（r=0.281、0.187，P=1.754、1.896）。

1.6 初乳成分

將收集的奶樣低溫運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，每次試驗(yàn)按所取量將其等量混勻。

乳蛋白（Lactoprotein）、乳脂（Butterfat）、乳糖（Lactobiose）、非脂固形物（Solid non fat）用Milk-Scan 134A/B型乳成分紅外儀測(cè)定。

1.7 初乳中免疫球蛋白G

將收集的奶樣低溫運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，每次試驗(yàn)按所取量將其等量混勻。

采用生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定母豬初乳中免疫球蛋白G（IgG），用美國(guó)Thermo FC全自動(dòng)酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)測(cè)量吸光度（OD）值。

計(jì)算方法：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件的(one-way ANOVA)程序來進(jìn)行單因素方差分析，當(dāng)數(shù)據(jù)差異顯著時(shí)，再采用Duncan's法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果

2.1 葡萄糖氧化酶對(duì)母豬圍產(chǎn)期便秘的影響(見表4)

表4 葡萄糖氧化酶對(duì)母豬圍產(chǎn)期便秘的影響

如表4所示，試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，母豬在整個(gè)圍產(chǎn)期（包括產(chǎn)前一周、產(chǎn)后一周）的便秘情況差異不顯著（P＞0.05），可以看出在產(chǎn)前一周、以及整個(gè)圍產(chǎn)期的便秘情況，3個(gè)試驗(yàn)組的便秘情況均低于對(duì)照組。

2.2 葡萄糖氧化酶對(duì)哺乳母豬糞便菌群的影響（見表5）

如表5所示，與對(duì)照組相比，GOD各試驗(yàn)組極顯著增加了后腸中雙歧桿菌的數(shù)量（P＜0.01）。GOD對(duì)大腸桿菌和乳酸菌的數(shù)量無顯著影響（P＞0.05），但與對(duì)照組相比，1.5 g/kg GOD組的大腸桿菌數(shù)量降低了5.68%，GOD試驗(yàn)各組的乳酸桿菌數(shù)量分別提高了7.41%、3.38%、6.76%。

表5 葡萄糖氧化酶對(duì)哺乳母豬糞便菌群的影響(CFU/g)

2.3 葡萄糖氧化酶對(duì)母豬初乳成分及IgG含量的影響（見表6）

表6 葡萄糖氧化酶對(duì)母豬初乳成分及IgG的影響

3 討論

3.1 葡萄糖氧化酶對(duì)母豬圍產(chǎn)期便秘情況的影響

葡萄糖氧化酶的催化產(chǎn)物葡萄糖酸被利用后生成丁酸，丁酸作為短鏈脂肪酸（SCFA）的一員，具有抗菌的特性，可以阻止有害菌如大腸桿菌的生長(zhǎng)繁殖，同時(shí)抑制其分布范圍，還可以促進(jìn)有益菌如乳酸桿菌和雙歧桿菌的生長(zhǎng)[7]。另外，SCFA可以為腸道提供能量，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化，還有利于其代謝過程[8-9]。另外，有研究表明，雙歧桿菌和乳酸桿菌等有益菌數(shù)量的增加，可維持腸道微生態(tài)平衡，還可以緩解便秘[10]。而且人類醫(yī)學(xué)的研究曾證實(shí)，將菊糖和瓊脂混合物加入到女性便秘患者的膳食中，可通過減少梭菌屬致病菌的數(shù)量來緩解便秘的效果[7]。從本試驗(yàn)研究看，母豬妊娠后期和泌乳期添加GOD并沒有明顯改善母豬圍產(chǎn)期的便秘情況，這可能與夏季母豬整體采食量偏低有關(guān)。但是可以看出，在整個(gè)圍產(chǎn)期里，試驗(yàn)組的便秘情況均低于對(duì)照組，這可能與增加母豬腸道中雙歧桿菌數(shù)量有關(guān)。GOD對(duì)改善母豬圍產(chǎn)期的便秘情況還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

3.2 葡萄糖氧化酶對(duì)母豬糞便微生物菌群的影響

消化道菌群數(shù)量的變化反映了母豬消化道內(nèi)環(huán)境。GOD在消化道的作用可以分為兩個(gè)方面。一是GOD通過與飼糧中的葡萄糖作用生成葡萄糖酸發(fā)揮作用；二是GOD在反應(yīng)時(shí)消耗腸道中的氧氣，使其產(chǎn)生厭氧環(huán)境。葡萄糖酸產(chǎn)生的酸性環(huán)境有利于乳酸桿菌、雙歧桿菌的生長(zhǎng)繁殖，抑制大腸桿菌等有害菌的生長(zhǎng)，而大多數(shù)有益菌都是厭氧菌，有害菌是需氧菌，厭氧環(huán)境有利于改善動(dòng)物腸道微生態(tài)的平衡。有報(bào)道研究，在斷奶仔豬飼糧中添加二甲酸鉀可降低斷奶仔豬新鮮糞樣中大腸桿菌的數(shù)量[11]。離體培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果表明，葡萄糖酸促進(jìn)胃腸道食糜產(chǎn)生更多的SCFA，而SCFA是腸道微生物的主要能量來源[12]。本試驗(yàn)中添加GOD試驗(yàn)組顯著增加了泌乳母豬糞便中雙歧桿菌的數(shù)量，對(duì)大腸桿菌數(shù)量的影響差異不大，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組泌乳母豬糞便中的乳酸桿菌偏高一些。進(jìn)一步說明了GOD可以改善泌乳母豬的腸道微生態(tài)環(huán)境。

3.3 葡萄糖氧化酶對(duì)母豬初乳品質(zhì)的影響

乳汁中的免疫球蛋白是由母體的血液中轉(zhuǎn)移而來的，母豬胎盤為上皮絨毛膜型，這就造成了母源的免疫球蛋白G只能在泌乳啟動(dòng)期間通過乳腺屏障進(jìn)入初乳，而不能通過胎盤傳遞給胎兒。新生仔豬也只能通過采食吸收初乳中的免疫球蛋白增加對(duì)疾病的抵抗力，有研究表明，將15 g/kg檸檬酸添加到母豬飼糧中，可以顯著提高初乳和常乳中總蛋白和免疫球蛋白的含量[13]。

本試驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)各組在乳蛋白率、乳脂率、非脂固形物指標(biāo)均有一定程度的升高，這與測(cè)定初乳中的IgG水平的升高的結(jié)果趨勢(shì)相一致，可能是因?yàn)镚OD在反應(yīng)作用時(shí)可能起到了類酸化劑的作用，通過改善母豬腸道健康，提高母豬營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝入量，進(jìn)而提高初乳中的IgG的水平從而提高了乳品質(zhì)，但GOD對(duì)母豬的初乳成分及IgG含量無明顯差異，可能是母豬個(gè)體之間差異較大，掩蓋了產(chǎn)品本身的飼用效果。

4 結(jié)論

①飼糧中添加GOD對(duì)整個(gè)圍產(chǎn)期便秘的情況差異不顯著；

②飼糧中添加1.0 g/kg GOD可極顯著增加糞便中雙歧桿菌的含量；

③飼糧中GOD對(duì)初乳中乳蛋白、乳糖、乳脂、非脂固形物含量無顯著影響；

④飼糧中GOD對(duì)初乳中免疫球蛋白G的含量無顯著影響。