吉祖進(jìn) 張志云 雷新益 楊勇 蔣學(xué)軍 庹磊

(國(guó)藥東風(fēng)總醫(yī)院，湖北 十堰 442008)

腸缺血再灌注損傷(intestinal ischemia reperfusion，IIRI)是臨床上比較常見的病理生理過(guò)程，可由急性腸系膜缺血、嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷性休克和外科手術(shù)引起，它進(jìn)一步導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征( systemic inflammatory response syndrome，SIRS)和多器官功能障礙(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)的發(fā)生[1-2]。腸缺血后，雖然恢復(fù)血流灌注和復(fù)氧過(guò)程至關(guān)重要，矛盾的是，再灌注過(guò)程同時(shí)也會(huì)造成額外的細(xì)胞損傷，其病理機(jī)制可能與氧化應(yīng)激、炎癥因子釋放和細(xì)胞凋亡等多種因素相關(guān)[3-4]。黑種夏草是原產(chǎn)于地中海和中東地區(qū)常用的生物藥材，一直被廣泛用于支氣管哮喘、糖尿病、高血壓等疾病的治療[5]。百里醌( thymoquinone)是黑種夏草種子提取物中的主要活性成分。研究顯示，在多種器官的IIRI過(guò)程中, 百里醌發(fā)揮了抗氧化、抗凋亡及抗炎等作用[6-7]。本研究通過(guò)建立大鼠腸IIRI模型，觀察百里醌在大鼠腸IIRI過(guò)程中的保護(hù)作用，為腸IIRI的防治提供新的手段。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及器材 百里醌，上海哈森公司產(chǎn)品；無(wú)水乙醇，美國(guó) Sigma 公司；丙二醛(MDA)、超氧化物岐化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒,南京建成生物工程研究所；原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，德國(guó)羅氏生物技術(shù)公司； RNA 提取試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,美國(guó)GeneCopoeia 公司；ECL試劑盒：皮爾斯生物科技公司；Bax、Bcl-2及Caspase-3抗體購(gòu)自圣克魯斯生物技術(shù)公司。百里醌用無(wú)水乙醇溶劑并配制成1 mol /L 的貯存液，-20 ℃冰箱保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 45只健康雄性Wistar大鼠, 體重250～300g，隨機(jī)分為3組，每組15只。實(shí)驗(yàn)前，所有大鼠飼養(yǎng)在恒溫房間，自由進(jìn)食和水。所有大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉(50mg/kg)進(jìn)行麻醉，取腹正中切口，分離并暴露腸系膜上動(dòng)脈(superior mesenteric artery，SMA)。假手術(shù)對(duì)照組(A組)僅游離SMA，不給予任何干預(yù)措施，觀察3 h。 缺血再灌注組(B組)使用無(wú)損傷動(dòng)脈夾夾閉SMA 1 h后，取下動(dòng)脈夾再灌注2h。缺血再灌注+百里醌組(C組):在B組基礎(chǔ)上，再灌注同時(shí)腹腔注射百里醌(50 mg /kg )。術(shù)畢，快速脫頸椎法處死所有大鼠，采集距大鼠小腸回盲部10 cm以上的腸組織作為標(biāo)本。

1.3 HE 染色 小腸組織沖洗干凈后置于4%的甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋，4μm厚切片、脫蠟和水化，觀察小腸組織的形態(tài)學(xué)改變。

1.4 MDA和SOD測(cè)定 冷凍的小腸組織勻漿、離心，然后收集上清液。MDA含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定，SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法，按照說(shuō)明書指示進(jìn)行操作。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，細(xì)胞核染成棕黃色者為陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞總數(shù)和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。凋亡指數(shù)(AI)= 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.6 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR) 凍存的小腸組織樣本，加入Trizol試劑提取總RNA。取1μg 總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用PCR基因擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)方案依據(jù)試劑盒說(shuō)明書操作步驟，條件為: 逆轉(zhuǎn)錄52℃ 15min，92℃ 40s；循環(huán)條件為: 90℃ 30s、54℃ 10s、72℃ 40s，40個(gè)循環(huán)。引物序列：caspase-3正義鏈5'-TGGACTGCGGTATTGAGACA-3'；反義鏈5'-GCGCAAAGTGACTGGATGAA-3'；Bax正義鏈5'TGAACTGGACAACAACATGGAG3'；反義鏈5'AGCAAAGTAGAAAAGGGCAACC3'；Bcl-2正義鏈5'-ATGCTTCAGACCTCCCTT-3'；反義鏈 5'-CTCCACCAACTATCTCCACT-3'；GAPDH正義鏈5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3'；反義鏈5'-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3'。軟件分析各組的循環(huán)閾值(Ct)，最終數(shù)據(jù)以2-△△Ct進(jìn)行分析，得出各組基因的表達(dá)量。

1.7 Western blot法檢測(cè)各組小腸組織中caspase-3、Bax和Bcl-2 蛋白表達(dá)水平 取凍存小腸組織約100mg，放入預(yù)冷的1000μl細(xì)胞裂解液中勻漿，離心并吸取上清液。取等量勻漿蛋白，經(jīng)10%的SDS-PAGE進(jìn)行凝膠電泳，將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，5% 脫脂奶粉封閉。1∶500稀釋抗Bax抗體,1：1000稀釋抗Bcl-2和caspase-3抗體，與硝酸纖維素膜4℃孵育過(guò)夜。漂洗兩次, TBST緩沖后，1∶ 500 HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 后，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL) 測(cè)定光密度值。

2 結(jié)果

2.1 腸缺血再灌注模型的建立 使用無(wú)損傷動(dòng)脈夾夾閉腸系膜上動(dòng)脈。模型制備成功的標(biāo)準(zhǔn)：腸系膜上動(dòng)脈遠(yuǎn)端動(dòng)脈搏動(dòng)消失，漸變蒼白，恢復(fù)灌注前小腸段發(fā)黑，水腫明顯,見圖1。

圖 1 動(dòng)脈夾夾閉腸系膜上動(dòng)脈Figure 1 Artery clamps occluded the superior mesenteric artery

2.2 各組大鼠小腸組織的病理學(xué)改變 A組未見明顯的組織病理學(xué)改變，黏膜上皮排列整齊，形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，腸黏膜無(wú)充血，無(wú)水腫；B組可見腸絨毛排列紊亂，明顯腫脹、變粗，腸黏膜壞死；C組可見形態(tài)結(jié)構(gòu)的破壞損傷較B組減輕，腸黏膜部分壞死，腸絨毛未見明顯水腫，見圖2。

圖2 小腸組織病理學(xué)改變 (HE×100)Figure 2 Histopathological changes of small intestine (HE×100)注：A.假手術(shù)對(duì)照組，B.缺血再灌注組，C.缺血再灌注+百里醌組

2.3 各組小腸組織中MDA、SOD含量的變化 B組中MDA含量較A組明顯增加，百里醌治療后MDA含量顯著降低，組間比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與A組相比，B組SOD活性明顯降低，百里醌治療后增加了小腸組織中SOD的活性，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

Table1ChangesofthecontentsofMDAandSODinthesmallintestine

組別nMDA(nmol/mg)SOD(U/mg)A組152.83±0.36135.37±3.34B組159.23±0.78 ①76.45±1.39 ①C組154.97±0.45 ①②95.13±1.64 ①②

注：與A組比較，①P<0.05；與B組比較，②P<0.05

2.4 各組腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡情況 A組可見散在較少的腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡；B組中凋亡細(xì)胞明顯增加,與A組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)；C組細(xì)胞凋亡較B組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)，見表2。

表2 腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)Table 2 Apoptosis index of intestinal mucosal epithelial

注：與A組比較，①P<0.05；與B組比較，②P<0.05

2.5 各組小腸組織中caspase-3、Bax和Bcl-2 mRNA的表達(dá)水平 Bax、caspase-3在B組中的mRNA表達(dá)水平，與A組比較顯著增加；與B組比較,百里醌治療(C組)后其mRNA表達(dá)水平降低,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。與A組比較，B組中Bcl-2在mRNA表達(dá)水平明顯減低；C組中mRNA表達(dá)水平較B組明顯增加，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)，見圖3。

圖3 小腸組織中caspase-3、Bax和Bcl-2 mRNA的表達(dá)水平Figure 3 The mRNA expression levels of caspase-3, Bax and Bcl-2 in the small intestine tissues注：A.假手術(shù)對(duì)照組，B.缺血再灌注組，C.缺血再灌注+百里醌組；與A組比較，①P<0.05；與B組比較，②P<0.05

2.6 各組小腸組織中caspase-3、Bax和Bcl-2 蛋白表達(dá)水平 與A組比較，Bax、caspase-3在B組中的表達(dá)水平增加；百里醌治療(C組)后其表達(dá)水平降低,組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。Bcl-2在B組中的表達(dá)水平，與A組比較顯著降低；與B組比較,百里醌治療(C組)后其表達(dá)水平增加, 組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)，見圖4。

圖4 小腸組織中caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)水平Figure 4 The protein expression levels of caspase-3, Bax and Bcl-2 in the small intestine tissues注：A.假手術(shù)對(duì)照組，B.缺血再灌注組，C.缺血再灌住+百里醌組，與A組比較，①P<0.05；與B組比較，②P<0.05

3 討論

百里醌是從黑種夏草種子中提取的具有生物活性成分單體，具有廣泛的藥理作用，研究發(fā)現(xiàn)百里醌具有多種生物學(xué)作用。Galaly等[8]報(bào)道，百里醌激活內(nèi)皮細(xì)胞分泌生長(zhǎng)因子，促使平滑肌細(xì)胞大量增殖，從而在肝細(xì)胞的損傷中發(fā)揮抗凋亡及抗炎作用。Shao等[9]研究發(fā)現(xiàn)，百里醌可通過(guò)降低氧化應(yīng)激水平，對(duì)大鼠腦細(xì)胞損傷的功能產(chǎn)生保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)采用HE染色觀察百里醌對(duì)IIRI大鼠小腸組織學(xué)變化的影響。結(jié)果顯示，IIRI組出現(xiàn)明顯的病理學(xué)變化，比如腸絨毛排列紊亂、腸黏膜壞死等表現(xiàn)；經(jīng)百里醌治療后，小腸IIRI引起的組織學(xué)損傷得到明顯好轉(zhuǎn)及改善。

氧化應(yīng)激是機(jī)體內(nèi)活性氧自由基(ROS)大量積累的結(jié)果，ROS也是器官IIRI發(fā)展的重要因素, 大量ROS的產(chǎn)生可打破氧化和抗氧化之間的平衡，引起組織損傷[10]。當(dāng)小腸血供中斷引起缺血時(shí)，機(jī)體內(nèi)ROS清除能力明顯降低，再灌注損傷時(shí)則進(jìn)一步誘發(fā)產(chǎn)生大量ROS, 過(guò)量的ROS可以氧化細(xì)胞膜蛋白、脂質(zhì)和DNA，導(dǎo)致一系列細(xì)胞功能障礙或死亡[11-12]。正常情況下，MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化分解產(chǎn)生的最終產(chǎn)物,通常用于評(píng)估氧化應(yīng)激下細(xì)胞損傷的程度。SOD水平是細(xì)胞生長(zhǎng)、分化過(guò)程中的重要組成部分, 其抗氧化能力可改善IIRI的損傷[13]。Cobourne-Duval 等[14]發(fā)現(xiàn)，百里醌可明顯減少ROS的生成，從而抑制大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的氧化應(yīng)激水平，在減慢或防止小膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)退行性疾病發(fā)生發(fā)展中，可作為一種有效的治療劑。Al-Majed等[15]通過(guò)百里醌腹腔注射的方法，發(fā)現(xiàn)其可有效地減少急性腹主動(dòng)脈缺血再灌注大鼠模型中氧化應(yīng)激的病理?yè)p傷。本實(shí)驗(yàn)研究表明，經(jīng)百里醌治療后，可使IIRI小腸組織中的MDA含量降低，SOD活性升高，從而減輕了腸IIRI過(guò)程中氧化應(yīng)激造成的損傷。

細(xì)胞凋亡是一種基于遺傳學(xué)機(jī)制的細(xì)胞死亡模式，通過(guò)誘導(dǎo)一系列形態(tài)和生化的改變導(dǎo)致細(xì)胞死亡的過(guò)程，在維持機(jī)體的動(dòng)態(tài)平衡中發(fā)揮重要的作用[16]。IIRI時(shí)，由于能量的消耗，活性代謝產(chǎn)物的大量生成，激活線粒體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，引起大量細(xì)胞凋亡,使機(jī)體發(fā)生損傷[17]。Kojima等[18]認(rèn)為在腸IIRI過(guò)程中，氧化應(yīng)激水平的升高可進(jìn)一步誘導(dǎo)黏膜上皮細(xì)胞發(fā)生異常凋亡。 Caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵效應(yīng)酶，也是多種凋亡刺激信號(hào)最終的匯聚點(diǎn)[19]。Bcl-2是一組家族蛋白，其中包含促凋亡因子(如Bax)和抗凋亡因子(如Bcl-2)，它們是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一對(duì)關(guān)系密切的凋亡基因，其變化是細(xì)胞凋亡損傷中另一個(gè)重要的因素[20]。本實(shí)驗(yàn)IIRI組中, Bax、caspase-3表達(dá)明顯高于對(duì)照假手術(shù)組，Bcl-2表達(dá)低于對(duì)照假手術(shù)組, 其凋亡指數(shù)(AI)顯著升高；百里醌治療后，Bax，caspase-3的表達(dá)明顯降低，Bcl-2表達(dá)明顯增多，提示百里醌在小腸IIRI過(guò)程中具有抑制凋亡的作用。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，百里醌可減輕實(shí)驗(yàn)大鼠的氧化應(yīng)激水平，發(fā)揮抗凋亡作用, 從而在腸IIRI過(guò)程中發(fā)揮保護(hù)作用。這些發(fā)現(xiàn)為我們更好地理解百里醌在臨床治療中的作用提供了依據(jù),無(wú)疑將為未來(lái)IIRI治療提供新的思路。