阮基浩 陳帥 范存義,2**

（1.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院骨科，上海 200233；2.上海健康醫(yī)學(xué)院附屬第六人民醫(yī)院東院骨科，上海 201306）

骨關(guān)節(jié)炎是最常見的關(guān)節(jié)退變疾病，其病理變化包括滑膜炎癥、軟骨破壞、骨贅形成以及軟骨下骨硬化[1,2]。目前，骨關(guān)節(jié)炎的治療主要包括生活習(xí)慣調(diào)整、藥物治療以及針對疾病末期的手術(shù)治療[3]。末期前的骨關(guān)節(jié)炎常推薦藥物治療，但是口服藥物常有明顯副作用。對于胃腸道不適或75歲以上老年患者[4]，關(guān)節(jié)腔藥物注射是臨床上一種非常有效的治療方法[5,6]。然而關(guān)節(jié)腔注射的藥物會被淋巴系統(tǒng)迅速清除，這極大地限制了該方法治療骨關(guān)節(jié)炎的療效[5,7]。所以在骨關(guān)節(jié)炎治療中，最關(guān)鍵并最有臨床應(yīng)用前景的是設(shè)計(jì)并制備在關(guān)節(jié)腔內(nèi)能夠長期緩釋的載藥體系（drug delivery system,DDS）[8,9]，更高效持久地治療骨關(guān)節(jié)炎。常用的載體根據(jù)形態(tài)分類包括水凝膠、聚合物以及納米和微米顆粒，按照來源可分為天然生物材料、人工合成高分子材料和復(fù)合材料[10]。本文對目前骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)腔藥物注射治療載藥體系的研究進(jìn)展作一綜述，同時(shí)對藥物靶向作用和載藥分子大小進(jìn)行討論。

1 天然生物材料

天然生物材料抗原性較弱，具有良好的生物相容性，因此在藥物輸送體系中被廣泛使用，其中最常用的有黏多糖（如透明質(zhì)酸）、殼聚糖、膠原和明膠等[11]。天然生物材料通過物理或化學(xué)連接形成水凝膠（hydrogels），與細(xì)胞外基質(zhì)一樣含有豐富的水分，3D結(jié)構(gòu)的水凝膠能夠負(fù)載生物活性分子或細(xì)胞到靶點(diǎn)，通過水凝膠降解從而釋放藥物進(jìn)行治療[12]。同時(shí)水凝膠的關(guān)節(jié)腔注射治療也被認(rèn)為能夠支持細(xì)胞生長、增殖、分化，促進(jìn)軟骨組織再生。

Kang 等[13]利用透明質(zhì)酸水凝膠輸送了聚乙二醇（poly-ethylene glycol,PEG）修飾的親水Kartogenin（KGN），促進(jìn)了軟骨細(xì)胞生長，從而有效地治療了骨關(guān)節(jié)炎。另外，Radhakrishnan等[14]制備了負(fù)載硫酸軟骨素和透明質(zhì)酸納米顆粒的水凝膠，同時(shí)做到了兩種成分半滲透的階梯納米支架，用于原位修復(fù)骨關(guān)節(jié)炎的骨軟骨再生。Cai等[15]則利用透明質(zhì)酸和殼聚糖按照7:3 比例鉸鏈形成水凝膠，能夠通過CD44 與軟骨細(xì)胞靶向結(jié)合，并持續(xù)釋放反義寡核苷酸進(jìn)行基因沉默。在骨關(guān)節(jié)炎模型的軟骨細(xì)胞中，第14 天環(huán)氧化酶2（cyclooxygenase-2,COX-2）含量與第3天和第10天相比，得到了更為有效的抑制。這表明骨關(guān)節(jié)炎中能夠利用水凝膠進(jìn)行基因治療，且行之有效。

微球與納米顆粒的出現(xiàn)為關(guān)節(jié)腔注射治療提供了新的載藥體系，這些顆粒不僅滿足良好生物相容性和可降解的要求，并且能夠修飾調(diào)控生物大分子的釋放[10]。納米顆粒已經(jīng)在腫瘤臨床治療中顯示出巨大優(yōu)勢，同樣也被應(yīng)用于骨關(guān)節(jié)炎的治療中。與此同時(shí)，顆粒在合成過程中，常常通過蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及其他生物分子進(jìn)行修飾，從而提高載藥體系的療效[5]。Zhu 等[16]研制了兩相釋放的殼聚糖微球，同時(shí)負(fù)載了靶向Rac1 抑制劑NSC23766。研究組證明了Rac1 的活化會促進(jìn)軟骨細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶13（matrix metallo-peptidase-13,MMP-13）、ADAMTS-5 等基質(zhì)金屬蛋白酶，導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和進(jìn)展。同時(shí)，Rac1 抑制劑NSC23766 的快速-緩釋兩相釋放，能夠在軟骨破壞的骨關(guān)節(jié)炎中起到有效的保護(hù)作用。

雖然天然材料有良好的生物相容性，但其存留關(guān)節(jié)腔的半衰期常相對較短[17,18]，例如水凝膠在生物組織內(nèi)半衰期僅有1～2 d，這極大地限制了水凝膠的應(yīng)用[19]。然而，骨關(guān)節(jié)炎的藥物療程常在數(shù)周到數(shù)月[3,20]，因此相對較短的存留時(shí)間也相應(yīng)的限制了天然載體的發(fā)展和應(yīng)用。

2 人工合成高分子材料

人工合成的高分子材料相較天然載體，則能夠?qū)崿F(xiàn)更長效的關(guān)節(jié)腔藥物釋放作用。聚乳酸（poly lactic-co-glycolic acid,PLGA）因其可靠的安全性、極低的毒性以及多變的物理化學(xué)特性而被廣泛應(yīng)用于多種臨床研究。目前已有多個研究以PLGA 作為骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)腔注射的載體，載有曲安奈德的PLGA微球在骨關(guān)節(jié)炎患者膝關(guān)節(jié)中存留了6周，非甾體抗炎藥（nonsteroidal antiinflammatory drugs,NSAIDs）氯諾昔康載入PLGA 后也同樣提高了其在關(guān)節(jié)腔內(nèi)的存留時(shí)間，并明顯改善了治療效果[10]。

Shkhyan等[21]將白細(xì)胞介素6（interleukin-6,IL-6）受體亞單位gp130 的小分子配體RCGD 423 負(fù)載于PLGA，20 μg 的RCGD 423 能夠維持濃度在0.1～0.3 μmol/L 并緩釋12 d 以上，通過關(guān)節(jié)腔注射后，有效抑制了IL-6 引起的炎癥反應(yīng)，并減少了軟骨細(xì)胞肥大凋亡，促進(jìn)了軟骨再生。然而，PLGA 載藥體系仍舊存在一些不足，限制了它在臨床的應(yīng)用，例如藥物有效包裝率較低（約50%）、爆發(fā)式釋放較高（約60%）以及回收率較低（約25%）等[22]。

Janssen 等[23]于是利用聚酰胺酯（polyester amide,PEA）制備了關(guān)節(jié)腔注射治療的緩釋微球。PEA聚合物中的氨基酸能夠在絲氨酸蛋白酶作用下降解，從而釋放非甾體類抗炎藥塞來昔布。在中性粒樣Hl-60細(xì)胞系中，塞來昔布在初始釋放約15%后，緩慢釋放長達(dá)80 d，為關(guān)節(jié)腔注射治療提供了新的思路。然后研究人員離斷了Lewis 大鼠前交叉同時(shí)切除部分內(nèi)側(cè)半月板構(gòu)建了骨關(guān)節(jié)炎模型，關(guān)節(jié)腔注射治療顯示，負(fù)載塞來昔布的PEA 微球明顯控制炎癥并減緩軟骨退化程度。

高分子材料不僅用于藥物輸送，本身也可以成為治療性的替代品。在人體各關(guān)節(jié)中，關(guān)節(jié)腔的滑膜液在關(guān)節(jié)活動中起到了潤滑的作用，但當(dāng)剪切力較小且接觸壓力較大的情況下，滑膜液被擠出，繼而主要由關(guān)節(jié)軟骨表面的多糖和糖蛋白起到減小磨損的作用[24]。當(dāng)骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生，關(guān)節(jié)軟骨表面的天然潤滑層也遭到了破壞，進(jìn)一步加重了疾病的進(jìn)展[25]。Morgese 等[26]利用聚麩胺酸（polyglutamic acid back?bone,PGA）試圖重建關(guān)節(jié)軟骨表面的潤滑功能。PGA 作為長鏈的主干，在兩側(cè)分別聚合了利用Schiff堿感應(yīng)軟骨退變的羥基苯甲醛（hydroxybenzalde?hyde,HBA）以及提供“毛刷”樣潤滑的聚-2-甲基-2-噁唑啉（poly-2-methyl-2-oxazoline,PMOXA）。研究發(fā)現(xiàn)，使用了聚合物修復(fù)的軟骨表面明顯降低了摩擦系數(shù)，提高了潤滑性能。因此PGA-α-PMOXA（x）-β-HBA 有望成為早期骨關(guān)節(jié)炎的治療藥物，能夠減少關(guān)節(jié)軟骨的磨損。

3 復(fù)合材料

隨著對生物材料的不斷了解，復(fù)合材料越來越成為新興的研究熱點(diǎn)。相比于以上兩類材料，它具有天然材料良好的組織相容性，又具有人工合成材料多變的可塑性和持久的緩釋能力。Petit 等[22]將塞來昔布水凝膠載于甲基化處理的PCLA-PEG-PCLA“三明治”聚合物，并且通過凝膠溫控實(shí)現(xiàn)了藥物在關(guān)節(jié)腔內(nèi)長達(dá)90 d 的緩釋，為骨關(guān)節(jié)炎長期治療提供了依據(jù)。水凝膠常被分為天然與合成兩種，又可根據(jù)降解性分為可降解和非可降解。常用于關(guān)節(jié)軟骨組織工程的聚合物是PEG、聚乙烯醇（poly-vinyl al?cohol,PVA）等[11]。Li 等[27]組裝了混合水凝膠來治療骨關(guān)節(jié)炎，混合了普朗尼克F127（聚丙二醇與環(huán)氧乙烷的加聚物）、黏多糖和骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone mor?phogenetic protein-2,BMP-2）的透明質(zhì)酸水凝膠能夠維持形態(tài)16 d以上，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了其抗炎作用。

糖皮質(zhì)激素是臨床常用的抗炎藥物，但激素的長期、大劑量使用會導(dǎo)致嚴(yán)重的不良反應(yīng)，包括高血糖、庫欣綜合征、骨質(zhì)疏松癥等。為了增加關(guān)節(jié)腔注射的地塞米松（dexamethasone,DEX）在炎癥控制中的作用，Lee 等[28]利用碳納米管（carbon nanotube,CNT）作為DEX 的關(guān)節(jié)內(nèi)輸送體系。DEX-CNT 藥物輸送體系能夠增加小窩蛋白（caveolin）依賴的細(xì)胞內(nèi)吞，從而在較低激素濃度下便有效控制促炎因子的釋放，例如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）。值得注意的是，PEG 修飾的CNT 能夠緩釋地塞米松，增加纖維樣滑膜細(xì)胞對小窩蛋白的內(nèi)吞，修復(fù)線粒體，抑制活性氧反應(yīng)，從而阻止關(guān)節(jié)病變。

4 藥物靶向

理想的載藥體系是能夠精準(zhǔn)地作用于病變或病變周圍，既提高藥物療效又減少其副作用[10]。因此疾病靶向治療日益成為研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。在骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展中伴隨著軟骨細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular ma?trix,ECM）的破壞，軟骨細(xì)胞穩(wěn)態(tài)改變，并造成局部炎癥[29]。關(guān)節(jié)腔注射治療中非靶向性的藥物能夠滲透到軟骨的較少，同時(shí)容易被巨噬細(xì)胞吞噬或淋巴血液系統(tǒng)清除[30]。靶向軟骨ECM 取決于載藥體系進(jìn)入并存留在基質(zhì)膠原的能力。Whitmire 等[31]在自組裝的納米顆粒外負(fù)載了白細(xì)胞介素1受體拮抗劑（inter?leukin-1 receptor antagonist,IL-1Ra），活體成像顯示藥物在大鼠關(guān)節(jié)內(nèi)可以存留14 d以上。

關(guān)節(jié)軟骨從軟骨面到骨面分為表層、切線層、中間層、深層以及鈣化層5 層，其中切線層的軟骨細(xì)胞在骨關(guān)節(jié)炎時(shí)有較為明顯的破壞和變化，因此研究建議靶向該層軟骨細(xì)胞進(jìn)行藥物治療[5]。膠原是軟骨ECM 的基本組成成分，不少研究針對膠原特異性靶向設(shè)計(jì)了抗關(guān)節(jié)炎藥物載體。Rothenfluh等[32]在聚硫化丙烯納米顆粒表面結(jié)合了Ⅱ型膠原α1 鏈結(jié)合肽，小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，直徑38 nm 的靶向修飾納米顆粒在軟骨內(nèi)的停留時(shí)間是相同直徑對照組的71倍，也是直徑96 nm 靶向修飾顆粒的14.9 倍。這些結(jié)果表明了生物分子靶向性和超小分子在ECM藥物釋放中的作用。

骨關(guān)節(jié)炎過程中伴隨著軟骨細(xì)胞表型的改變，微環(huán)境內(nèi)合成了不同的代謝介質(zhì)?；蛑委熤荚卺槍φ{(diào)整軟骨細(xì)胞表達(dá)從而阻斷骨關(guān)節(jié)炎過程并恢復(fù)軟骨穩(wěn)態(tài)。陽離子聚乙烯亞胺（polyethylenimine,PEI）是非病毒基因治療體系的重要一類，PEI將DNA輸送到細(xì)胞質(zhì)中釋放，并整合到細(xì)胞核，從而達(dá)到基因治療的效果[33]。Pi 等[34]通過健康兔滑膜與軟骨的鑒別分析，篩選出軟骨靶向多肽（CAP，序列：DWRVIIP?PRPSA），并連接在PEI的末端，從而構(gòu)建了表達(dá)海參熒光素酶質(zhì)粒的基因載藥體系（CAP-PEI-DNA）。與非靶向性的對照顆粒相比，這些靶向軟骨細(xì)胞的納米顆粒表現(xiàn)了高出近乎一個數(shù)量級的轉(zhuǎn)染效率。同樣的CAP-PEI 體系也被用于輸送Epas1 編碼的低氧誘導(dǎo)因子2α（hypoxia-inducible factor-2α,Hif-2α）的siRNA，起干擾作用的載藥體系（CAP-PEI-siRNA）通過關(guān)節(jié)腔注射用于骨關(guān)節(jié)炎模型小鼠。藥物注射7 d后進(jìn)行染色觀察，可以發(fā)現(xiàn)CAP 偶聯(lián)的顆粒較對照組軟骨退化表現(xiàn)更輕，從而表明CAP-PEI 的載藥體系可能成為骨關(guān)節(jié)炎基因治療的突破點(diǎn)。然而注射CAP 載藥體系的小鼠軟骨退化程度依舊明顯重于正常小鼠，很可能與CAP是從兔軟骨細(xì)胞篩選有關(guān)，對小鼠軟骨細(xì)胞缺乏足夠的靶向性。

骨關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)很大程度是由活化的巨噬細(xì)胞所引起，并形成了細(xì)胞內(nèi)的活性氧。過量的活性氧（reactive oxygen species,ROS）會外溢到細(xì)胞外基質(zhì)中，從而破壞關(guān)節(jié)軟骨的微環(huán)境[35]。Chung 等[36]設(shè)計(jì)了對ROS超敏反應(yīng)的PLGA中空微球，在局部炎癥環(huán)境的H2O2作用下，微球內(nèi)的Fe2+和碳酸氫鈉發(fā)生級聯(lián)化學(xué)反應(yīng)，從而產(chǎn)生CO2氣泡破壞微球，達(dá)到釋放微球內(nèi)抗炎藥物地塞米松的目的，繼而保護(hù)破壞的軟骨。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明了ROS反應(yīng)的微球能夠很好地對生物反應(yīng)相關(guān)的ROS 進(jìn)行反應(yīng)，并實(shí)現(xiàn)病灶特異性的藥物輸送。

5 載體的大小和輸送

藥物在關(guān)節(jié)腔減少的最主要屏障在于滑膜，藥物從載體釋放后發(fā)揮效用，最終被滑膜清除出關(guān)節(jié)腔[37]。而影響藥物通過擴(kuò)散作用到靶位點(diǎn)最關(guān)鍵的是細(xì)胞外基質(zhì)，其中內(nèi)皮細(xì)胞是蛋白質(zhì)擴(kuò)散的主要屏障[37]。因此在骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)腔注射治療中，載體的大小決定著療效的優(yōu)劣。在ECM 被動靶向輸送中，關(guān)節(jié)腔內(nèi)納米顆粒的分布主要由組織的滲透性和細(xì)胞內(nèi)吞所決定。Rothenfluh等[32]通過生物篩選發(fā)現(xiàn)，直徑在31～38 nm 的納米顆粒能夠進(jìn)入關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)，而直徑在96 nm的納米顆粒無法進(jìn)入。相對于被動的靶向作用，關(guān)節(jié)軟骨積極主動的靶向作用則需要納米顆粒具有球形結(jié)構(gòu)，同時(shí)表面帶有正電荷且直徑小于軟骨網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑（約60 nm）。而Lee等[28]發(fā)現(xiàn)PEG 修飾的CNT（PEG-SWCNTs）盡管表面是負(fù)電荷（在磷酸緩沖鹽溶液中約-11 mV），但能夠有很好的關(guān)節(jié)軟骨滲透作用，很可能得益于其10 nm的直徑以及1D結(jié)構(gòu)。

在關(guān)節(jié)軟骨膠原纖維中，有許多富含亮氨酸的蛋白聚糖（small leucine-rich proteoglycans,SLRPs）支鏈，它們與基質(zhì)內(nèi)表皮細(xì)胞生長因子（epidermal growth factor,EGF）、轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth fac?tor-β,TGF-β）、TNF-α等多種生長因子相互關(guān)聯(lián)，成為動態(tài)調(diào)控軟骨微環(huán)境的“蓄水池”[5]。因此納米載藥體系可以利用生物分子間的連接，將軟骨基質(zhì)從屏障阻礙轉(zhuǎn)變?yōu)楸苊饪焖偾宄龑?shí)現(xiàn)緩釋的容器[32]。

6 總結(jié)和展望

作為全球性退變疾病，骨關(guān)節(jié)炎目前尚缺乏改善病情的抗骨關(guān)節(jié)炎藥物（disease-modifying osteoar?thritis drugs,DMOADs）。雖然目前各類載藥體系多處于基礎(chǔ)研究階段，距離臨床應(yīng)用尚有一定的距離，但其中一些已經(jīng)進(jìn)入了臨床試驗(yàn)階段。目前有二期臨床試驗(yàn)來評價(jià)關(guān)節(jié)腔注射FX0006對骨關(guān)節(jié)炎的療效[38,39]。FX006是一種新型的PLGA微球緩釋系統(tǒng)，能夠有效延長滑膜組織和滑膜液中藥物作用時(shí)間。結(jié)果表明，膝關(guān)節(jié)炎患者在關(guān)節(jié)腔單次注射負(fù)載曲安奈德的FX006 載藥系統(tǒng)后，在24 h 藥物峰值后，能夠持續(xù)20周在血漿中檢測到曲安奈德。相比較于單純曲安奈德組（1 ml，40 mg，n=18），使用FX006 載藥體系的緩釋系統(tǒng)能夠有效降低血漿中曲安奈德峰值水平，從而減少藥物的全身反應(yīng)。關(guān)節(jié)腔藥物注射在臨床和基礎(chǔ)研究中均體現(xiàn)了極大的治療優(yōu)勢，是當(dāng)前早期骨關(guān)節(jié)炎的有效治療方法。小分子藥物在關(guān)節(jié)腔內(nèi)容易迅速被清除，所以臨床治療中常需要多次注射，且療效有限[5,40]。因此，利用生物材料設(shè)計(jì)制備高效的DDS，將為基礎(chǔ)研究轉(zhuǎn)為臨床治療提供可靠渠道。

目前骨關(guān)節(jié)炎載藥體系的生物材料研究主要包括生物安全性、可調(diào)控性、靶向性等，另外基礎(chǔ)研究對生物分子的直徑也有了更深入的了解，從而為載體的設(shè)計(jì)提供了指導(dǎo)意見[32]。Rothenfluh 等[32]提出可以將軟骨基質(zhì)的復(fù)雜3D 結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)镈MOADs 的“水庫”，從而有效提高骨關(guān)節(jié)炎的治療效果，這為今后的研究提供了更開放的思維?？傊谛》肿雍蜕锊牧系妮d藥體系是當(dāng)前骨關(guān)節(jié)炎的研究熱點(diǎn)，對載體和藥物的修飾是靶向治療的突破點(diǎn)。但目前的載藥體系還不能滿足全部需求，還存在各種難以避免的不足，如何使載藥體系能夠以更低劑量更加精準(zhǔn)地治療骨關(guān)節(jié)炎，如何做到藥物的可控緩釋，如何提高改善疾病進(jìn)展的藥物療效，以及如何將載藥體系轉(zhuǎn)化于臨床患者，將會成為今后的研究重點(diǎn)和熱點(diǎn)。