洪澤亞 肖耀廣 李志鋼 王永東

（1.湖北省中西結(jié)合醫(yī)院骨外科，武漢 430000；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院骨科，呼和浩特 010000）

【關(guān)鍵字】金屬蛋白酶類；Ⅱ型膠原；頸椎間盤退變髓核組織

目前公認(rèn)頸椎病的根源是椎間盤退行性變（in?tervertebral disc degenera-tion，IDD）、椎間盤破裂脫出等壓迫神經(jīng)、脊髓或椎動脈而引起的各種癥狀[1]。椎間盤是椎體間的鏈接結(jié)構(gòu)，髓核位于椎間盤中央偏后[2]。髓核內(nèi)Ⅱ型膠原的降解是髓核退變的主要原因[3，4]。蛋白聚糖和Ⅱ型膠原（Collagen typeⅡ）為細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分，彈性蛋白和水也是其組成成分[5,6]?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生降解的重要酶，MMP-8 是MMPs 家族中重要成員，又稱膠原酶2、嗜中性膠原酶[7]。國外有研究證明MMP-8可以降解膠原蛋白，從而導(dǎo)致組織退化重構(gòu)，比例失衡。關(guān)于MMP-8 在心血管疾病、支氣管擴(kuò)張等疾病中的研究較多，但關(guān)于MMP-8在椎間盤退變中的研究目前較少。雖然有研究發(fā)現(xiàn)在椎間盤髓核組織中存在MMP-8[8]，但未進(jìn)一步描述MMP-8在退變和正常頸椎間盤髓核組織的表達(dá)情況及其意義。因此，本研究擬探討MMP-8和Ⅱ型膠原在正常和退變的頸椎間盤髓核組織中的表達(dá)和意義，為進(jìn)一步了解頸椎間盤髓核退變的機(jī)制及明確頸椎間盤退變的病因提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源與臨床資料

1.1.1 研究組：選取2017 年6 月至2018 年6 月湖北省中西結(jié)合醫(yī)院、內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院因頸椎?。ㄖ饕獮轭i椎間盤突出癥）行手術(shù)治療的患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前診斷為頸椎病神經(jīng)根型或脊髓型頸椎病，同時具有相應(yīng)的癥狀和體征，且病程超過1年以上；②術(shù)前頸椎MRI顯示頸椎間盤髓核有退變、突出壓迫神經(jīng)根或脊髓（Pfirrmann 分級2～5 級）[9]；③肌電圖提示相應(yīng)神經(jīng)根節(jié)段有病變；④手術(shù)摘除病變頸椎間盤髓核。排除標(biāo)準(zhǔn):①有椎間隙感染表現(xiàn)；②因骨折、脫位和腫瘤等導(dǎo)致脊髓神經(jīng)損傷。

最終共納入60 例患者。其中男45 例，女15 例，年齡30～62 歲，平均年齡（42.9±12.3）歲，包括神經(jīng)根型30 例（C4-55 例，C5-610 例，C6-715 例），脊髓型30 例（C5-615例，C6-715例）。每例患者取術(shù)中摘除的頸椎間盤髓核1個，共60個。

1.1.2 對照組：選取同期相同醫(yī)院因頸椎骨折或脫位行手術(shù)復(fù)位融合內(nèi)固定治療的患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①頸椎骨折或脫位的患者；②傷后6 h至3 d行手術(shù)治療；③術(shù)前頸椎MRI顯示椎間盤無退變信號（Pfirrmann分級1級）。排除標(biāo)準(zhǔn):術(shù)前有頸椎病相關(guān)癥狀及其他相關(guān)疾病。

最終共納入10 例患者。其中男7 例，女3 例，年齡21～36 歲，平均年齡（28.3±4.6）歲。每例患者取術(shù)中摘除的頸椎間盤髓核1 個，共10 個，其中C4-54 個，C5-65個，C3-41個。

本研究經(jīng)湖北省中西結(jié)合醫(yī)院、內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院倫理委員會許可，并獲得患者的知情同意。經(jīng)兩家醫(yī)院病理專家確診，研究組標(biāo)本均為頸椎間盤退變髓核組織，對照組標(biāo)本均為頸椎間盤正常髓核組織。

1.2 主要實驗試劑與儀器

UltrasensitiveTMS-P超敏試劑盒（福州邁新生物技術(shù)有限公司），DAB 顯色試劑盒：試劑A：DAB 緩沖液（20×）、試劑B：DAB 底物（20×）、試劑C：DAB 色原（20×）（福州邁新生物技術(shù)有限公司），一抗兔抗人MMP-8多抗?jié)饪s型抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），TKY-BMB 型石蠟包埋機(jī)，德國LEICA RM2235型切片機(jī)，Olympus CX41型顯微鏡，江蘇捷達(dá)JD-108圖像分析儀，奧林巴斯BX41P偏光顯微鏡。

1.3 主要實驗方法

髓核組織標(biāo)本獲取后洗去血跡，常規(guī)固定（10%中性甲醛溶液），石蠟包埋，4 μm 連續(xù)切片。分別進(jìn)行HE、天狼猩紅飽和苦味酸及免疫組化染色。HE染色后光鏡下觀察頸椎間盤髓核組織結(jié)構(gòu)。偏振光鏡下觀察天狼猩紅飽和苦味酸染色后頸椎間盤髓核組織膠原類型及分布特點，其中Ⅰ型膠原呈黃色與紅色，Ⅲ型膠原呈綠色，Ⅱ型膠原纖維有弱的雙折光性，為疏松網(wǎng)狀分布，呈多種色彩[10]。免疫組化染色使標(biāo)記抗體的顯色劑顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原，并對其進(jìn)行定性、定量分析[11]。MMP-8 免疫組化染色陽性表達(dá)為棕黃色（細(xì)胞質(zhì)及胞外），弱陽性表達(dá)為淺棕黃色，陰性表達(dá)為無著色。Ⅱ型膠原免疫組化染色陽性表達(dá)為棕色，主要在軟骨樣細(xì)胞周圍基質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)，弱陽性表達(dá)為淺棕黃色，陰性表達(dá)為無著色。采用畫分割光密度分析，平均光密度值越小表示著色越淺，平均光密度值越大則表示著色越深。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)統(tǒng)計學(xué)分析。采用獨(dú)立樣本t檢驗比較頸椎間盤正常與退變髓核組織MMP-8、Ⅱ型膠原的平均光密度值差異；采用Pearson相關(guān)分析法分析頸椎間盤退變髓核組織MMP-8與Ⅱ型膠原表達(dá)的相關(guān)性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果

頸椎間盤正常髓核組織的軟骨細(xì)胞有不規(guī)則的軟骨陷窩，細(xì)胞呈卵圓形，髓核細(xì)胞多孤立存在于細(xì)胞陷窩內(nèi)，少見多核巨細(xì)胞及細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞核呈橢圓形，纖維網(wǎng)排列致密，結(jié)構(gòu)規(guī)整，無斷裂及鈣化（圖1A）。頸椎間盤退變髓核組織纖維排列紊亂或相互交叉融合，結(jié)構(gòu)不規(guī)整、凌亂，出現(xiàn)斷裂及纖維軟骨組織鈣化（局部深藍(lán)部分）（圖1B）。

2.2 天狼猩紅飽和苦味酸染色結(jié)果

頸椎間盤正常髓核組織內(nèi)可見膠原纖維含量高，膠原排列致密連續(xù)，無斷裂，主要是Ⅱ型膠原，纖維環(huán)處為Ⅰ型膠原，Ⅱ型膠原在軟骨樣細(xì)胞處顯色（圖2A）。頸椎間盤退變髓核組織膠原顯色弱，各型膠原含量均減弱，降解嚴(yán)重，僅有少量的Ⅰ型膠原和極少量Ⅱ型膠原（圖2B）。

2.3 免疫組化染色及定量分析結(jié)果

頸椎間盤正常髓核組織內(nèi)MMP-8主要是陰性表達(dá)（圖3A），Ⅱ型膠原主要是陽性表達(dá)（圖4A）。頸椎間盤退變髓核組織內(nèi)MMP-8 主要是陽性表達(dá)，且在細(xì)胞核內(nèi)外均有表達(dá)（圖3B），Ⅱ型膠原主要是弱陽性表達(dá)或無表達(dá)（圖4B）。

定量分析結(jié)果顯示，與頸椎間盤正常髓核組織比較，退變髓核組織MMP-8的表達(dá)較多，而Ⅱ型膠原的表達(dá)較少，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

2.4 頸椎間盤退變髓核組織MMP-8與Ⅱ型膠原表達(dá)的相關(guān)性

圖1 成人頸椎間盤髓核組織（HE染色，×200）

圖2 成人頸椎間盤髓核組織（天狼猩紅飽和苦味酸染色，10×10）

Pearson 相關(guān)分析結(jié)果顯示，頸椎間盤退變髓核組織MMP-8表達(dá)與Ⅱ型膠原表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.713，P＜0.01），即頸椎間盤退變髓核組織MMP-8 表達(dá)越高，Ⅱ型膠原表達(dá)反而越低。

圖3 成人頸椎間盤髓核組織MMP-8表達(dá)（SP染色，×200）

圖4 成人頸椎間盤髓核組織Ⅱ型膠原表達(dá)（SP染色，×200）

表1 頸椎間盤正常與退變髓核組織MMP-8蛋白、Ⅱ型膠原表達(dá)比較（）

表1 頸椎間盤正常與退變髓核組織MMP-8蛋白、Ⅱ型膠原表達(dá)比較（）

3 討論

椎間盤細(xì)胞的數(shù)量減少和細(xì)胞外基質(zhì)的降解是其發(fā)生退變的主要原因[11]。椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)主要由水、蛋白聚糖、彈性纖維和Ⅰ、Ⅱ型膠原構(gòu)成，其中髓核組織內(nèi)以Ⅱ型膠原及蛋白聚糖為主，其退變的過程主要是Ⅱ型膠原及蛋白聚糖的表達(dá)減少[12,13]，使膠原基質(zhì)負(fù)荷增大，加快基質(zhì)降解和正常功能喪失，椎間盤生物力學(xué)發(fā)生改變[14-16]，從而導(dǎo)致椎間盤和脊柱發(fā)生一系列病理變化。本研究組織學(xué)觀察結(jié)果可見，在退變椎間盤組織中纖維環(huán)板層狀結(jié)構(gòu)破壞，髓核組織排列紊亂或相互交叉融合，整個纖維環(huán)變得粗糙甚至出現(xiàn)鈣化。

Attila 等[17]發(fā)現(xiàn)成人髓核內(nèi)主要細(xì)胞是軟骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞是Ⅱ型膠原表達(dá)的主要細(xì)胞，所以成人正常髓核內(nèi)膠原主要是Ⅱ型膠原。髓核組織變性的本質(zhì)是Ⅱ型膠原減少，從而使椎間盤正常結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。Smith 等[18]通過大量的實驗證明，在退變的椎間盤髓核組織中Ⅱ型膠原的表達(dá)隨著退變程度的加重逐漸減少。王兆豐等[19]將60例椎間盤標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色，結(jié)果顯示正常椎間盤髓核組織中Ⅱ型膠原表達(dá)較退變髓核組織中表達(dá)明顯增高，并且推測Ⅱ型膠原減少可能使椎間盤組織退變。本研究通過天狼猩紅飽和苦味酸及免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，頸椎間盤退變髓核組織Ⅱ型膠原較正常髓核組織明顯減少。頸椎間盤退變髓核組織內(nèi)各型膠原均減少，降解嚴(yán)重，主要是Ⅰ型膠原和極少數(shù)Ⅱ型膠原，而且膠原走行紊亂，連續(xù)性差。免疫組化定量分析結(jié)果也顯示，頸椎間盤退變髓核組織Ⅱ型膠原表達(dá)比正常髓核組織少，椎間盤髓核組織的退變與Ⅱ型膠原表達(dá)減少可能有著直接關(guān)系，Ⅱ型膠原有減緩髓核退變的作用。

MMPs通過降解細(xì)胞外基質(zhì)使椎間盤發(fā)生生理和病理的改變[20]。該過程是受其與金屬蛋白酶組織抑制因子（tissue inhibitors of matrix metalloproteinases,TIMPs）之間的平衡調(diào)控[21,22]來完成的。MMPs是椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)降解的關(guān)鍵酶[23]，主要降解細(xì)胞外基質(zhì)的各型膠原和蛋白。MMPs在正常的椎間盤組織中是以無活性的酶原形式分泌，其蛋白水解酶活性的激活主要是位于細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)N端結(jié)構(gòu)域。并且有些MMPs可通過相互作用激活其他蛋白酶。人體有很多方式調(diào)節(jié)MMPs的產(chǎn)生和活性，如炎性介質(zhì)、激素、細(xì)胞因子、腫瘤壞死因子等影響MMPs的分泌和激活[24]。

MMP-8 是一種能夠降解完整間質(zhì)膠原的酶，與MMP-1 的結(jié)構(gòu)和功能十分相似[25]。以前學(xué)者認(rèn)為MMP-8 對Ⅰ型膠原降解有較強(qiáng)的作用，但現(xiàn)在研究表明MMP-8 對Ⅰ、Ⅱ型膠原降解均有較強(qiáng)的作用[26]。MMP-8 不僅直接降解Ⅱ型膠原，而且還可以激活其他MMPs 如MMP-3，加速膠原的降解，并調(diào)節(jié)細(xì)胞因子如腫瘤因子、白細(xì)胞介素8 等的分泌，而這些因子又可以激活其他MMPs，加速細(xì)胞外基質(zhì)的降解[27]。本實驗也證實了MMP-8 降解Ⅱ型膠原的結(jié)論：Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，頸椎間盤退變髓核組織MMP-8表達(dá)與Ⅱ型膠原表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，即MMP-8表達(dá)越高，Ⅱ型膠原表達(dá)反而越低，MMP-8可能是降解Ⅱ型膠原的因素之一。Beatrice等[28]通過對24例行椎體融合術(shù)的患者退變的椎間盤標(biāo)本中的MMPs 進(jìn)行免疫組化及PCR 實驗，得出MMP-8 在退變的椎間盤內(nèi)有一定的表達(dá)，其中18 例中度表達(dá)，6 例強(qiáng)烈表達(dá)，并且得出MMP-8 表達(dá)與MMP-1 表達(dá)無相關(guān)性，與MMP-13表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與疼痛時間呈正相關(guān)。故推測MMP-8表達(dá)與椎間盤退變有一定的關(guān)系。Wei?ler 等[29]對因椎間盤病變而行椎體融合術(shù)的患者髓核組織進(jìn)行MMPs 的測定，發(fā)現(xiàn)MMP-8 表達(dá)與髓核組織退變有一定的相關(guān)性。Vo等[30]也證明在退變椎間盤組織中MMP-8表達(dá)較正常椎間盤組織高。本研究免疫組化定量分析結(jié)果也證明，頸椎間盤退變髓核組織MMP-8 表達(dá)多于正常髓核組織，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明MMP-8參與了椎間盤髓核組織的退變。

綜上所述，本研究通過與頸椎間盤正常髓核組織對比，發(fā)現(xiàn)MMP-8 在退變髓核組織中的表達(dá)明顯增高，是頸椎間盤髓核組織退變的重要調(diào)節(jié)因子，對降解椎間盤髓核組織細(xì)胞外基質(zhì)中的Ⅱ型膠原有著重要的作用，且兩者的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，為MMP-8抑制劑減緩頸椎間盤退變提供了理論支持。但本研究樣本量較小，對其他生物因素如白細(xì)胞介素等如何調(diào)節(jié)MMP-8的分泌未進(jìn)行研究，對MMP-8及Ⅱ型膠原在各種頸椎病退變椎間盤髓核組織中表達(dá)進(jìn)行差異性比較還有待進(jìn)一步研究。