董 朕，白東東，劉利利，白玉彬，王瑋瑋，張繼瑜，周緒正*

(1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州畜牧與獸藥研究所農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730050； 2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730050； 3. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所甘肅省中獸藥工程技術(shù)研究中心,蘭州 730050)

歸芪益母湯，出自《牛經(jīng)備要醫(yī)方》。由黃芪、益母草和當(dāng)歸組成。功效為補(bǔ)氣生血、活血化瘀。主治勞倦內(nèi)傷、氣血雙虛等證?？捎糜谂谝圻^重、產(chǎn)后血虛和產(chǎn)后癱瘓等。中獸醫(yī)藥的不斷推廣和應(yīng)用，使其加減后，功效主治更廣，如治療奶牛產(chǎn)后氣虛血瘀證、胎衣不下、奶牛不孕癥、同期發(fā)情和羊/奶牛產(chǎn)后癱瘓等疾病。中獸藥具有抗菌、消炎和提高動(dòng)物體自身免疫等作用，同時(shí)具有療效好、低毒、環(huán)保等特點(diǎn)，已成為人們研究的重點(diǎn)。隨著網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的發(fā)展，可對(duì)中藥/方劑進(jìn)行多成分-多靶點(diǎn)-多途徑分析，研究其作用機(jī)制。近年來，人醫(yī)上許多學(xué)者利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探索中藥治療胸痹、消渴病[1-2]、神經(jīng)退行性疾病、心律失常、冠心病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、心肌缺血、肝癌等的作用機(jī)制，取得了一定的成果。這種研究方法不僅能分析中藥對(duì)所研究疾病的作用，而且能發(fā)現(xiàn)中藥可能還對(duì)其他疾病有效，繼而深入研究，達(dá)到老藥新用的目的。該研究方法的整體性和系統(tǒng)性與中(獸)醫(yī)的整體觀念相吻合，具有一定的應(yīng)用前景。但在獸醫(yī)領(lǐng)域仍少有人應(yīng)用，本研究利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)(TCMSP)對(duì)歸芪益母湯多成分、多靶點(diǎn)、多途徑網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行系統(tǒng)分析，以期揭示歸芪益母湯治療牛氣血兩虛證的作用機(jī)制，并尋找出新的臨床應(yīng)用方向。

1 材料與方法

1.1 歸芪益母湯活性化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

本研究是根據(jù)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)檢索歸芪益母湯全方，黃芪、益母草和當(dāng)歸所有化學(xué)成分。根據(jù)口服利用度(OB)和類藥性(DL)將所有單味藥的化合物進(jìn)行篩選，其閾值分別是OB≥50，DL≥0.18[3]，篩選出的化合物具有較好的活性。將篩選出的化合物-靶點(diǎn)通過Cytoscape3.5.0構(gòu)建歸芪益母湯化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，探究歸芪益母湯治療疾病的作用機(jī)制。

1.2 歸芪益母湯作用于牛蛋白-蛋白互相作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

為了探究靶點(diǎn)蛋白在牛系統(tǒng)水平上的作用，將歸芪益母湯相關(guān)靶點(diǎn)基因上傳至在線STRING 10.5軟件(https://string-db.org/)，構(gòu)建由導(dǎo)入基因所表達(dá)產(chǎn)物組成的PPI網(wǎng)絡(luò)，以了解歸芪益母湯治療牛氣血兩虛證的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.3 歸芪益母湯-牛靶點(diǎn)基因的GO富集及KEGG信號(hào)-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

為了深入了解從歸芪益母湯篩出化合物的靶點(diǎn)蛋白在基因功能和信號(hào)通路中的作用，采用DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中的蛋白質(zhì)基因進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，通過軟件對(duì)KEGG通路富集分析中篩選出的信號(hào)通路構(gòu)建靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，從基因功能和信號(hào)通路層次分析歸芪益母湯治療牛氣血兩虛證的作用機(jī)制。

2 結(jié) 果

2.1 化合物的篩選

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)從263個(gè)化合物中篩選出30個(gè)符合條件的化合物，但并非所有化合物都有活性，為此，根據(jù)化合物對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的有無再次篩選，篩選出27個(gè)化合物，去除單味藥之間的重復(fù)共24個(gè)活性化合物。利用Cytoscape3.5.0軟件將24個(gè)化合物和對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的關(guān)系構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果見圖1，在化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖中，共發(fā)現(xiàn)273個(gè)節(jié)點(diǎn)(包括24個(gè)化合物節(jié)點(diǎn)和249個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn))和134條邊。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)篩選度(度，英文對(duì)應(yīng)degree，節(jié)點(diǎn)的度為節(jié)點(diǎn)連接的邊的總數(shù)，一個(gè)節(jié)點(diǎn)的節(jié)度越大就意味著這個(gè)節(jié)點(diǎn)的度中心性越高，該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中就越重要)[4]較大的節(jié)點(diǎn)進(jìn)行分析，這些連接化合物或靶點(diǎn)較多的節(jié)點(diǎn)在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中起到樞紐的作用，可能是關(guān)鍵的化合物或者靶點(diǎn)。該網(wǎng)絡(luò)圖中，平均每個(gè)化合物有平均靶點(diǎn)數(shù)是5.6個(gè)，每個(gè)靶點(diǎn)平均與10個(gè)化合物相互作用，同時(shí)歸芪益母湯中也存在一個(gè)化合物與多靶點(diǎn)之間的相互作用，這體現(xiàn)了歸芪益母湯多成分與多靶點(diǎn)之間共同作用的機(jī)制，亦符合中藥復(fù)方治療疾病的特點(diǎn)。從化合物的角度，有62.5%的化合物作用靶點(diǎn)>10個(gè)，其中靶點(diǎn)>20個(gè)的化合物有12個(gè)，靶點(diǎn)>40個(gè)的化合物有3個(gè)。其中益母草和黃芪中的槲皮素(quercetin)的連接度最高，能與154個(gè)靶點(diǎn)相互作用，然后是山奈酚(kaempferol)等。統(tǒng)計(jì)靶點(diǎn)>20的化合物，見表1。從靶點(diǎn)的角度來看，連接化合物>10個(gè)靶點(diǎn)有7個(gè)，連接化合物>20個(gè)靶點(diǎn)有0個(gè)。其中前列腺素合成酶G/H-2連接了20個(gè)化合物，占到了總化合物的83.3%，其次是前列腺素合成酶G/H-1，連接了15個(gè)化合物，其他連接化合物>10的靶點(diǎn)統(tǒng)計(jì)，見表2。

圖1 歸芪益母湯的復(fù)合靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)(黃色代表化合物，紅色代表靶點(diǎn))Fig.1 Compound-target network of Gui Qi Yimu decoction (Yellow for the compound and red for the target)

表1度>10的化合物的拓?fù)湫再|(zhì)

Table1Topologicalpropertiesofcompoundswithdegree>10

編號(hào)Serial number名稱Name來源Source度DegreeMOL000098槲皮素Quercetin黃芪(Hedysarum Multijugum Maxim.)、154益母草(Leonuri Herba)MOL000422山奈酚Kaempferol黃芪(Hedysarum Multijugum Maxim.)、63益母草(Leonuri Herba)MOL0003787-O-甲基-異微凸劍葉莎醇黃芪(Hedysarum Multijugum Maxim.)457-O-methylisomucronulatolMOL000392刺芒柄花素Formononetin黃芪(Hedysarum Multijugum Maxim.)39MOL001439花生四烯酸Arachidonic acid益母草(Leonuri Herba)38MOL000358β-谷甾醇β-sitosterol當(dāng)歸(Angelicae Sinensis Radix)38MOL000354異鼠李素Isorhamnetin黃芪(Hedysarum Multijugum Maxim.)、37益母草(Leonuri Herba)MOL000449豆甾醇Stigmasterol當(dāng)歸(Angelicae Sinensis Radix)31MOL000296常春藤皂苷元Hederagenin黃芪(Hedysarum Multijugum Maxim.)24MOL0003713,9-二氧甲基尼索林3,9-Di-O-methylnissolin黃芪(Hedysarum Multijugum Maxim.)23MOL000380美迪紫檀素 6aR,11aR-9,10-dimethoxy-6a,黃芪(Hedysarum Multijugum Maxim.)2211a-dihydro-6H-benzofurano[3,2-c]chromen-3-olMOL000417毛蕊異黃酮Calycosin黃芪(Hedysarum Multijugum Maxim.)22MOL001418兒茶素Galeopsin益母草(Leonuri Herba)14MOL000239梔子醇Jaranol黃芪(Hedysarum Multijugum Maxim.)13MOL001421左旋雜合素前體Preleoheterin益母草(Leonuri Herba)12

表2度>10的靶點(diǎn)拓?fù)?/p>

Table2Targettopologywithdegree>10

靶點(diǎn)Target度Degree前列腺素合成酶G/H-2 Prostaglandin G/H synthase 220前列腺素合成酶G/H-1 Prostaglandin G/H synthase 115視黃酸受體RXR-α Retinoic acid receptor RXR-α12熱休克蛋白HSP90 Heat shock protein HSP9012核受體共激活劑2 Nuclear receptor coactivator 212乙酰膽堿受體M1 Muscarinic acetylcholine receptor M111γ氨基酸受體亞單位α-1 Gamma-aminobutyric acid receptor subunit α-111

2.2 歸芪益母湯靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

為了更好地理解歸芪益母湯作用于牛病的作用機(jī)制，基于PPI關(guān)系，利用STRING軟件構(gòu)建了歸芪益母湯靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)(圖2)。打分值>0.9，結(jié)果PPI網(wǎng)絡(luò)包括了182個(gè)蛋白節(jié)點(diǎn)，238條相互關(guān)系。根據(jù)節(jié)點(diǎn)的“Degree”繪制出了前20個(gè)關(guān)鍵蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)的條形圖(圖3)，其中TNF、IL8、HSP90-AA1、MAPK1、F3、ENSBTAG00000014921、PSMD3、TP53等出現(xiàn)頻率較高，在治療牛氣血兩虛證中起到關(guān)鍵作用。

圖2 歸芪益母湯相關(guān)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.2 PPI network of Gui Qi Yimu decoction related targets

2.3 GO富集與KEGG通路富集分析

本研究利用DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)歸芪益母湯PPI靶點(diǎn)的蛋白進(jìn)行GO富集與KEGG通路富集分析。在GO富集分析中，確定了29條GO條目(偽發(fā)現(xiàn)率<0.01)，其中細(xì)胞組成條目1個(gè)，涉及extracellular space(細(xì)胞外間隙)；分子功能條目1個(gè)，涉及amine receptor activity(胺受體活動(dòng))；生物過程條目27個(gè)，涉及response to wounding (損傷應(yīng)答)、regulation of cell proliferation (細(xì)胞增殖調(diào)控)、negative regulation of cell proliferation (細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控)、positive regulation of macromolecule metabolic process (大分子代謝過程的調(diào)控)、inflammatory response (炎癥反應(yīng))、cell migration (細(xì)胞移行)等(表3)。如表4所示，在通路分析中，得到11條信號(hào)通路(偽發(fā)現(xiàn)率<0.01)，具體是pathways in cancer(癌癥通路)、apoptosis(細(xì)胞凋亡)、T cell receptor signaling pathway(T細(xì)胞受體信號(hào)通路)、prostate cancer(前列腺癌)、MAPK signaling pathway(MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑)等信號(hào)通路(表4),靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖如圖4所示。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)的中心節(jié)點(diǎn)Fig.3 Hub nodes from PPI network

3 討 論

歸芪益母湯具有補(bǔ)氣生血之功效，主治過力勞傷，氣血俱虛及產(chǎn)后血虛血滯之證。原方記載治“牛無力疲倦多眠”“牛行路太多，或日夜負(fù)重，以致氣血俱虛，其癥疲倦多眠。宜歸芪益母湯主之”。但在臨床上，凡過力勞傷所致的氣血俱虛，產(chǎn)后氣血虛弱，子宮、陰道垂脫等證，均可酌情應(yīng)用。然而其作用機(jī)制尚不明了，故本研究采用TCMSP中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)，研究了歸芪益母湯3味中藥的有效成分，配伍機(jī)制，同時(shí)構(gòu)建了化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，分析了化合物-靶點(diǎn)、靶點(diǎn)-通路相互之間的作用關(guān)系，明確了歸芪益母湯“多成分-多靶點(diǎn)-多途徑”的治療機(jī)制及信號(hào)通路表達(dá)途徑。

表3PPI網(wǎng)絡(luò)中的基因GO富集結(jié)果列表(FDR<0.01)

Table3ListofGOenrichmentresultstogenesinPPInetwork(FDR<0.01)

種類Category項(xiàng)目Term總數(shù)Count偽發(fā)現(xiàn)率FDR生物過程損傷應(yīng)答Response to wounding267.10×10-14Biological process細(xì)胞增殖調(diào)控Regulation of cell proliferation285.60×10-11細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控192.30×10-10Negative regulation of cell proliferation大分子代謝過程的正調(diào)控287.00×10-10Positive regulation of macromolecule metabolic process炎癥反應(yīng)Inflammatory response181.20×10-9細(xì)胞移行Cell migration185.60×10-9

(轉(zhuǎn)下頁 Carried forward)

表4PPI網(wǎng)絡(luò)中基因通路富集結(jié)果列表(FDR<0.01)

Table4ListofpathwayenrichmentresultstogenesinPPInetwork(FDR<0.01)

種類Serial number名稱Name基因數(shù)Count gene偽發(fā)現(xiàn)率FDRbta5200癌癥通路Pathways in cancer364.30×10-12bta4210細(xì)胞凋亡Apoptosis141.00×10-4bta4660T細(xì)胞受體信號(hào)通路 T cell receptor signaling pathway164.10×10-5bta5215前列腺癌Prostate cancer131.00×10-3bta4010MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑MAPK signaling pathway221.30×10-3bta5210大腸癌Colorectal cancer131.00×10-3bta4620Toll樣受體信號(hào)通路Toll-like receptor signaling pathway157.00×10-5bta5222小細(xì)胞肺癌Small cell lung cancer124.50×10-3bta4020鈣信號(hào)途徑Calcium signaling pathway185.80×10-4bta5219膀胱癌Bladder cancer93.10×10-3bta4621NOD樣受體信號(hào)通路NOD-like receptor signaling pathway106.00×10-3

3.1歸芪益母湯組方中主要是通過黃芪、益母草中的槲皮素、山奈酚、芒柄花黃素、花生四烯酸、異鼠李素等化合物發(fā)揮作用，而組方中當(dāng)歸主要是以β-谷固醇和豆甾醇發(fā)揮作用的。其中槲皮素能顯著抑制促癌劑的作用[5]，抑制離體惡性細(xì)胞的生長[6]，槲皮素還具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、降低毛細(xì)血管的通透性和脆性的活性[7]；山奈酚主要具有抗動(dòng)脈粥樣硬化[8]、抑制癌細(xì)胞增殖[9]和炎癥保護(hù)作用[10]；芒柄花黃素主要針對(duì)膀胱癌[11]、肺癌[12]、直腸癌[13]等多種癌癥有明顯的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用；花生四烯酸是前列腺素的重要合成前體，具有廣泛的生物活性，對(duì)細(xì)胞內(nèi)磷酯酶[14]、蛋白激酶[15]起著調(diào)節(jié)作用，并直接影響著鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通道[16]，并且具有興奮子宮的作用[17]；異鼠李素具有抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[18]、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈[19]、內(nèi)皮保護(hù)[20]、抗血栓[21]、抗血小板凝集[21]、降壓[22]和舒張血管[23-24]等多種藥理作用；當(dāng)歸中β-谷固醇和豆甾醇是天然抗氧化體系，具有明顯的降血脂[25]和抗氧化作用[24-27]。綜上，歸芪益母湯主要是通過多種化合物的多靶點(diǎn)多作用通路共同實(shí)現(xiàn)治療目的，如通過花生四烯酸調(diào)節(jié)鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通道，興奮子宮，引起子宮收縮，治療母牛產(chǎn)后胎衣不下；通過槲皮素、異鼠李素等舒張血管、抗血栓、抗血小板凝集和抗氧化作用治療產(chǎn)后氣虛血瘀證。且多種化合物具有明顯的抗癌作用，對(duì)應(yīng)了膀胱癌、肺癌、大腸癌等多個(gè)疾病通路，對(duì)以后的藥理作用研究提供了方向。

3.2根據(jù)分析表明其化合物-靶點(diǎn)的關(guān)鍵靶點(diǎn)是前列腺素合成酶G/H-2、前列腺素合成酶G/H-1、視黃酸受體RXR-α、熱休克蛋白HSP90、核受體共激活劑2等。有學(xué)者研究表明，前列腺素合成酶G/H-2是生成前列腺素E2的兩種關(guān)鍵合成酶[28-29]，而前列腺素E2[30]參與體內(nèi)發(fā)熱、炎癥[31]、疼痛感知和細(xì)胞生長[32]等的調(diào)節(jié);前列腺素合成酶G/H-1主要在多數(shù)組織與血小板中表達(dá),并且涉及前列腺素與血栓素的合成,前列腺素與血栓素對(duì)維持某些細(xì)胞功能起作用[33-34]；視黃酸受體RXR-α作為一個(gè)有著中心作用的核受體，能夠在細(xì)胞的不同發(fā)育階段進(jìn)行不同程度的表達(dá)，對(duì)細(xì)胞的生長、增殖、分化等諸多生理過程都起著非常重要的調(diào)控作用[16,27]，并且RXR-α功能的異常與某些癌癥[35]的發(fā)生也存在一定的聯(lián)系；熱休克蛋白[36]是生物受到環(huán)境中物理、化學(xué)、生物、精神等刺激時(shí)發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)而合成的蛋白質(zhì)。HSP90作為HSPs中的一個(gè)重要家族，主要作用是與一系列激素受體和激酶結(jié)合，參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及功能的調(diào)節(jié)[37-39]。

3.3將歸芪益母湯作用于牛的靶點(diǎn)進(jìn)行PPI映射且構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，分析結(jié)果表明，歸芪益母湯作用于牛的關(guān)鍵靶點(diǎn)是TNF、IL8、HSP90AA1、MAPK1等，尤其TNF的作用程度大于其他靶點(diǎn)，TNF不僅對(duì)腫瘤細(xì)胞有毒性作用，還可以引起血管擴(kuò)張，促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化，促進(jìn)T細(xì)胞MHCⅠ類抗原表達(dá)，增強(qiáng)IL-2依賴的胸腺細(xì)胞、T細(xì)胞增殖能力，促進(jìn)IL-2、CSF和IFN-γ等淋巴因子產(chǎn)生，增強(qiáng)有絲分裂原或外來抗原刺激B細(xì)胞的增殖和Ig分泌。

圖4 靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)(黃色表示通路，紫色表示靶點(diǎn))Fig.4 Target-pathway network (Yellow for pathway and purple for target)

3.4GO富集分析和KEGG通路注釋分析結(jié)果可知,歸芪益母湯主要活性成分的靶點(diǎn)是通過細(xì)胞增殖、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在細(xì)胞內(nèi)外不同部位發(fā)生蛋白結(jié)合、酶反應(yīng)等分子反應(yīng)。具體包括：T細(xì)胞受體、細(xì)胞凋亡、鈣離子、Toll樣受體等信號(hào)通路，前列腺素合成酶G/H-2、前列腺素合成酶G/H-1、視黃酸受體RXR-α、熱休克蛋白HSP90、核受體共激活劑2等細(xì)胞分化和炎性物質(zhì)，小細(xì)胞肺癌、大腸癌、膀胱癌等疾病通路。綜上，歸芪益母湯是通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)-內(nèi)分泌-炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡來發(fā)揮作用的。

分析結(jié)果表明，歸芪益母湯通過多種通路，多個(gè)靶點(diǎn)發(fā)揮作用，上述分析的結(jié)果與治療牛氣血兩虛證的藥理作用吻合，且具有抗癌抗腫瘤的靶點(diǎn)與通路，可以為以后的深入研究提供參考和方向。且多靶點(diǎn)、多通路的作用方式符合中藥方劑的治療理念，但古方的配伍比例是否準(zhǔn)確，改變比例是否可以改變藥效等仍需繼續(xù)研究討論。

4 結(jié) 論

通過基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建了歸芪益母湯治療牛氣血兩虛證的化合物-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)模型，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)歸芪益母湯可以通過細(xì)胞增殖、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、酶反應(yīng)等生物過程調(diào)控胎衣不下，產(chǎn)后血虛等牛氣血兩虛證。